逆流提取黃芪地上部分浸提酒加工工藝研究

陳曉婷，關(guān) 宏，朱金峰，馬淑麗，劉振艷，楊文欽，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

中藥藥酒歷史悠久。中草藥能夠強(qiáng)身健體，且毒副作用小，與酒相溶，酒助藥行，相得益彰，藥酒已成為保健常用的飲品[1-2]。中藥黃芪具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，素以“補(bǔ)氣諸藥之最”著稱，是最常用的中藥材，已有2 000多年的藥用歷史，中醫(yī)認(rèn)為黃芪具有補(bǔ)氣健脾、利水消腫、固表止汗和托瘡生肌等功效[3-10]。黃芪屬于多年生藥材，而黃芪的地上部分（莖稈，葉、花和果）每年均可采收，且產(chǎn)量是地下部分（根）的幾倍至十幾倍，卻長(zhǎng)期被棄之為廢，沒有被充分利用。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分析，地下及地上部分均含有多糖、皂苷、黃酮等有效成分，且活性成分種類一致、僅在量上略有差異。研究還顯示黃芪地上部分總皂苷、總黃酮含量較高[11-15]。2019年，黑龍江省出臺(tái)了與干制黃芪莖葉和干制黃芪花相關(guān)的食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)，充分證明黃芪地上部分也可作為食品原料進(jìn)行開發(fā) 利用[16-17]。

目前，藥酒常用的制備方法有浸提法、滲漉法、超聲提取法、回流提取法、煎煮法和超濾法等[18-21]， 其中浸提法最為常用。動(dòng)態(tài)逆流提取工藝是將兩個(gè)以上的動(dòng)態(tài)提取罐機(jī)組串聯(lián)，提取溶媒沿著罐組內(nèi)各罐藥料的溶質(zhì)濃度梯度逆向地由低向高順次輸送通過各罐，并與藥料保持一定提取時(shí)間并多次套 用[22-27]。此技術(shù)主要利用了固液兩相中有效成分的濃度梯度差，逐級(jí)將藥材中有效成分?jǐn)U散至起始濃度較低的提取溶劑中，達(dá)到最大限度轉(zhuǎn)移藥材中有效成分的目的。與傳統(tǒng)藥酒浸提的制備方法相比，逆流提取具有提取效率高、提取溶劑少的優(yōu)勢(shì)，連續(xù)動(dòng)態(tài)化的提取能適用于工業(yè)化的生產(chǎn)。

為此，本研究利用罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取工藝和傳統(tǒng)醇浸提法，以黃芪地上部分為原料，對(duì)黃芪地上部分提取液進(jìn)行研究。通過對(duì)比黃芪提取液的有效成分總糖、總皂苷和總黃酮的提取率，確定最佳提取工藝。本研究首次將逆流提取方法應(yīng)用在黃芪地上部分浸提酒的研制，在開發(fā)新型功能性食品領(lǐng)域有較好前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干黃芪莖葉，黑龍江省齊齊哈爾市富?？h；95%食用酒精，大慶博潤(rùn)生物科技有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸和濃硫酸（均為分析純），科密歐化學(xué)試劑；苯酚（分析純），上海生工生物工程有限公司；葡萄糖（優(yōu)級(jí)純），Acros；黃芪甲苷（純度＞98%）、毛蕊異黃酮（純度＞98%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純，迪馬科技）。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；UV2550-紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，石家莊陽(yáng)星儀器貿(mào)易有限公司；MS105DU電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；FA1604電子天平，上海精科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃芪浸提酒中總糖的測(cè)定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取干燥的葡萄糖對(duì)照品0.106 0 g，加水制成含葡萄糖0.106 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取使用液0 mL、0.1 mL、 0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.2 mL，用蒸餾水定容至 2 mL，得到質(zhì)量分別為0 mg、0.010 6 mg、0.021 2 mg、 0.042 4 mg、0.084 8 mg和0.127 2 mg的標(biāo)準(zhǔn)系列，以相應(yīng)試劑為空白，按照可見分光光度法，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值[28]。以O(shè)D490nm為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖回歸方程Y=5.607 1X+0.020 1（相關(guān)系數(shù)

R2=0.999 8）。

（2）供試品（黃芪浸提酒）總糖的測(cè)定。精密量取供試品溶液2 mL置于25 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液2 mL，混勻。加入10 mL濃硫酸，混勻，沸水浴中煮沸15 min，冷卻后，在可見分光光度計(jì)上測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算，即得總糖質(zhì)量。

提取率計(jì)算公式為：

1.3.2 黃芪浸提酒中總皂苷的測(cè)定

（1）黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密稱取黃芪甲苷5.40 mg，用甲醇制成含黃芪甲苷濃度為0.54 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液0.1 mL、0.2 mL、 0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL加入10 mL容量瓶，得到質(zhì)量分別為0 mg、0.054 0 mg、0.108 0 mg、0.162 0 mg、 0.216 0 mg和0.270 0 mg的標(biāo)準(zhǔn)系列，以相應(yīng)試劑為空白，按照可見分光光度法，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值[29]。以O(shè)D540nm為縱坐標(biāo)，黃芪甲苷質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黃芪甲苷回歸方程Y=1.751 9X+0.020 8（相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3）。

（2）供試品（黃芪浸提酒）總皂苷的測(cè)定。精密量取供試品溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴至揮干溶劑，加入0.4 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液，再加入1.6 mL高氯酸混勻，100 ℃水浴2 min，冷卻5 min,加入冰醋酸8 mL，搖勻，在可見分光光度計(jì)上測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算，即得總皂苷質(zhì)量。

提取率計(jì)算公式為：

1.3.3 黃芪浸提酒中總黃酮的測(cè)定

（1）毛蕊異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密稱取毛蕊異黃酮3.40 mg，用甲醇制成含毛蕊異黃酮0.34 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別吸取使用液0 mL、0.10 mL、 0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL和0.30 mL用甲醇定容至10 mL，得到質(zhì)量分別為0 mg、0.034 0 mg、0.051 0 mg、 0.068 0 mg、0.085 0 mg和0.102 0 mg的標(biāo)準(zhǔn)系列，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在波長(zhǎng)265 nm處測(cè)定吸光度值[30]。以O(shè)D265nm為縱坐標(biāo)，毛蕊異黃酮（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到毛蕊異黃酮回歸方程Y=7.388 2X+0.022 8（相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0）。

（2）供試品（黃芪浸提酒）總黃酮的測(cè)定。直接將供試品加入比色皿在紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算，即得總黃酮質(zhì)量。

提取率計(jì)算公式為：

1.3.4 醇提法單因素試驗(yàn)

根據(jù)常用浸提酒濃度選擇考察的酒精濃度為40%、50%、60%，單次提取時(shí)間分別考察了3 h、4 h、5 h，提取次數(shù)分別考察了3次、4次、5次，通過總糖、總皂苷、總黃酮的提取率進(jìn)行分析確定醇浸提法單因素最佳提取條件。

1.3.5 罐組式逆流提取方法

罐組式逆流提取示意圖見圖1。

圖1 罐組式逆流提取示意圖

將干黃芪莖葉剪成1 cm長(zhǎng)的小段，取4個(gè)6 L不銹鋼桶，分別標(biāo)識(shí)A桶、B桶、C桶和D桶，分別向4個(gè)不銹鋼桶中添加100 g干黃芪莖葉。如圖1所示，向A桶添加40%食用酒精4 L，浸泡2 h后，提取4 h，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為A1。向A桶第2次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為A2；向B桶添加A桶第2次收集的清液A2，浸泡 6 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為B1。向A桶第3次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為A3；再向B桶添加A桶第3次收集的清液A3，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為B2；向C桶添加B桶第2次收集的清液B2，浸泡6 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為C1。 A桶第4次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為A4；向 B桶添加A桶第4次收集的清液A4，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為B3；向C桶添加B桶第3次收集的清液B3，浸泡4 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為C2；向D桶添加C桶第2次收集的清液C2，浸泡6 h后，采用真空抽濾方式過濾，收集清液，標(biāo)記為D1，測(cè)定D1收集液。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較逆流提取法與醇浸提法對(duì)總糖、總皂苷、總黃酮提取率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪浸提酒的單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 不同酒精濃度對(duì)黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

分別使用40%、50%、60%食用酒精4 L提取100 g干燥黃芪莖葉，由圖2可知，在酒精度為40%時(shí)，總糖、總皂苷、總黃酮提取率均為最高。

圖2 酒精度對(duì)黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

2.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

在40%的酒精濃度下，考察不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率也隨之增加，但提取時(shí)間對(duì)提取率影響較小，提取時(shí)間為5 h時(shí)總黃酮的提取率最大，總糖和總皂苷在提取時(shí)間為4 h和5 h沒有變化，綜合時(shí)效考慮，選擇單次的提取時(shí)間為4 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

分別考察提取3次混合液、4次混合液、5次混合液對(duì)提取率的影響，由圖4可知，總皂苷和總黃酮在提取4次時(shí)提取率最高，確定了提取次數(shù)為 4次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)黃芪浸提酒中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的影響

2.2 逆流提取法與醇浸提法提取率顯著性分析結(jié)果

通過2.1單因素優(yōu)化的浸提條件，在相同條件下，對(duì)逆流提取4次混合液進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，醇提取混合液進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)兩種提取方法的總糖、總皂苷、總黃酮的提取率進(jìn)行了比較分析。采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較逆流提取法與醇浸提法提取率的差異。由表1可知，兩種方法中總多糖的提取率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.56，P=0.194 5）；總皂苷和總黃酮提取率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.24，P＜0.000 1；t=4.80，P=0.008 7），逆流提取法對(duì)總皂苷和總黃酮的提取率優(yōu)于醇浸提法。

表1 逆流提取法與醇浸提法對(duì)總糖、總皂苷和總黃酮提取率的結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了以黃芪地上部分為原料的浸提酒的逆流提取方法，對(duì)比分析了醇提取法和逆流提取法中總糖、總皂苷、總黃酮提取率的差異。結(jié)果表明，同樣提取條件下，逆流提取的有效成分總皂苷和總多糖提取率優(yōu)于普通醇浸提法。該方法首次將逆流提取方法應(yīng)用在黃芪地上部分浸提酒中，具有提取效率高、節(jié)省溶劑的優(yōu)點(diǎn)，連續(xù)動(dòng)態(tài)化的提取，同時(shí)能適用于工業(yè)化的生產(chǎn)，在開發(fā)新型功能性食品領(lǐng)域有較好前景。