不同強化處理措施對銅污染土壤微生物多樣性的影響

張 倩，張國威，商侃侃

（上海辰山植物園，城市園藝技術(shù)研發(fā)與推廣中心，上海 201602）

0 引言

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速進(jìn)步和發(fā)展，銅污染已成為重要的土壤環(huán)境問題，不僅導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降，而且還干擾土壤生物體的生命代謝，并威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全[1]。由于可持續(xù)、低投資、多功能等優(yōu)勢，植物修復(fù)被普遍認(rèn)為是一種的安全途徑。木本植物具有根系發(fā)達(dá)、生長迅速且生物量大等特征，利用其對重金屬污染進(jìn)行修復(fù)已經(jīng)成為植物修復(fù)領(lǐng)域的一個熱點[2-3]。添加有機廢棄物可以提高植物重金屬提取量和修復(fù)效率，同時也可以達(dá)到“以廢制污”的目的，但其對土壤重金屬生物有效性及修復(fù)效果仍存在較大分歧[4]。螯合劑能夠活化土壤中的重金屬，從而強化植物對土壤中重金屬的吸收[5]。因此，通過螯合劑和有機物覆蓋的聯(lián)合作用下，應(yīng)該可以有效提高植物的生物量、產(chǎn)量和重金屬利用效率。

提高植物修復(fù)效率依賴于土壤理化性質(zhì)、重金屬、土壤微生物等和植物之間的相互作用[6]。土壤微生物多樣性和豐富度已成為衡量土壤質(zhì)量高低的重要生物學(xué)指標(biāo)[7]。在整個能量轉(zhuǎn)化過程中，微生物起著積極作用，通過改善根際土壤質(zhì)量從而促進(jìn)植被的生長，達(dá)到提高植物對重金屬提取量的目的。重金屬會給土壤微生物帶來較大的影響，包括種群增長特征、群落結(jié)構(gòu)以及生理生化和遺傳等方面都會對脅迫做出響應(yīng)[8]。施用有機肥能夠為土壤微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，利于土壤微生物建群，減弱微生物間的競爭作用，進(jìn)而使微生物多樣性增加[9]?；瘜W(xué)螯合劑能夠活化土壤中存在的重金屬對土壤微生物群落產(chǎn)生影響[10]。目前針對于有機物覆蓋、螯合劑以及聯(lián)合強化處理措施對銅污染土壤微生物多樣性的影響對比研究較少。

本研究采用illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，較于傳統(tǒng)分析技術(shù)能夠產(chǎn)生覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量[11]，旨在通過研究不同強化處理措施對銅污染土壤微生物多樣性的影響，以期為解釋土壤微生物影響植物吸收累積重金屬的機理以及提高植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染效率提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗場地與材料

試驗場地位于上海辰山植物園土壤污染修復(fù)模擬試驗場(31°4′39″N、121°11′12″E)。試驗場地地區(qū)屬北亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫17.8℃，年均日照1997.1 h，年均降水量1103.2 mm，年均蒸發(fā)量1257 mm[12]。

測定銅污染樣地表層土壤(0～30 cm)的基本理化性質(zhì)為：容重1.51 g/cm3，含水量24.2%，總孔隙度41.0%，pH 8.15，電導(dǎo)率226.7 μS/cm，有機質(zhì)26.2 g/kg，水 解 氮 70.7 mg/kg，有 效 磷 8.4 mg/kg，速 效 鉀297.3 mg/kg，銅含量為452.8 mg/kg。

供試植物為雜交新美柳(Salix matsudana×alba)；EDTA購買于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；樹枝落葉類覆蓋物來自上海辰山植物園。

1.2 試驗設(shè)計與處理

設(shè)置如表1共5個處理，每個處理3個重復(fù)，共計15個樣地，每個樣地面積3.3 m×2.3 m。2019年3月，分別用長度為25 cm雜交‘新美柳’插穗，以10株/m2扦插于土壤中，T1和T3處理進(jìn)行6～8 cm樹枝落葉類覆蓋，CK、T0和T2覆蓋6～8 cm厚度的原土。生長20天后，T2和T3處理樣地加入濃度為5 mmol/L EDTA，常規(guī)管理。

表1 田間小區(qū)試驗不同強化處理措施情況

1.3 土壤樣品采集

于2020年9月進(jìn)行土壤采集，采用“Z”型隨機取樣法每個樣地各采集3份土樣，深度約為15 cm，將3份土樣進(jìn)行充分混合，并除去較大的石塊、雜草、根系等雜物后，過2 mm篩后將土樣裝于無菌封口袋中，共計15個樣品（5個處理×3個重復(fù)），用于土壤微生物測序分析。

1.4 土壤微生物總DNA提取和高通量測序

采用OMEGA土壤DNA試劑盒(D5625-01)提取土壤樣品DNA基因組，提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量用Eppendorf RS232G紫外可見分光光度計進(jìn)行檢測。以 V3-V4 區(qū) 特 異 性 引 物 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[13]進(jìn)行 PCR 擴增 ，采用illumina MiSeq對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。土壤樣品的微生物測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為有效序列。

使用QIIME軟件(V1.9.1)對有效序列進(jìn)行識別，利用USEARCH去除沒有重復(fù)的單序列后，按照97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，基于silva數(shù)據(jù)庫，采用RDP classifier貝葉斯算法（默認(rèn)置信度閾值為0.7）對選出的OTU代表序列進(jìn)行物種注釋后開展后續(xù)的測序數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列處理及優(yōu)化

經(jīng)數(shù)據(jù)前處理，15個樣品總DNA的16S rDNA V3+V4區(qū)共得到962574條有效序列數(shù)據(jù)，序列平均長度為419 bp，與16S rDNA V3+V4區(qū)序列長度大致吻合，對15個樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)抽平處理，每個樣本均含56729條有效序列，為統(tǒng)計方便，此后提到的有效序列均為抽平后的數(shù)據(jù)。按照16S rDNA相似性≥97%為一個OTU分類單元，進(jìn)行聚類后共得到7501個OTUs，并可以確定為42個門，145個綱，359個目，562個科，1060個屬，2290個種。

對所有樣本序列進(jìn)行隨機抽樣，構(gòu)建土壤中微生物的Shannon指數(shù)稀釋曲線，由圖1可以看出，5個處理的稀釋曲線隨著測序量的增大，OTU增加數(shù)目的速度逐漸趨于平緩，同時樣品所得到的序列的覆蓋度均高于97%，表明樣本測序深度足夠，得到的數(shù)據(jù)量合理，可反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。

圖1 不同處理土壤微生物Shannon稀釋曲線

2.2 土壤微生物群落物種組成

計算不同處理土壤樣品中微生物在門水平上的物種平均相對豐度，繪制了豐度聚類熱圖。由圖2所知，不同處理土壤微生物群落組成在門水平上較為相似，優(yōu)勢物種相同，微生物相對豐度較大的門類為酸桿菌門 (Acidobacteria，21.80% ～25.86%)、變 形 菌 門(Proteobacteria，19.21% ～23.74%)、放 線 菌 門(Actinobacteria，12.11% ～17.53%)、綠 彎 菌 門(Chloroflexi，9.69%～12.53%)和厚壁菌門(Firmicutes，5.38%～11.50%)。T0和T1處理土壤微生物群落組成較為相似，聚為一類；CK位于較遠(yuǎn)的聚類分支上，說明空白對照與不同處理下的土壤微生物群落組成差異相對較大。

圖2 不同處理土壤微生物在門水平上的豐度聚類熱圖

Venn圖展示了不同處理土壤微生物群落共有或特有的OTU數(shù)。由圖3可知，CK、T0、T1、T2和T3分別含有 4911、5217、4848、5429、5212 個 OTUs，其中2622個OTUs為5個處理的共有OTU，占比在50%以上，說明這部分微生物群落對環(huán)境改變表現(xiàn)出穩(wěn)定性。5個處理土壤微生物群落特有的OTU分別為349、151、124、197、122個，CK處理特有OTU數(shù)最多。

圖3 不同處理土壤微生物Venn圖

對比CK和T0處理，共有OTU數(shù)為3679個，分別占CK和T0處理OTU總數(shù)的74.91%和70.52%；對比T0和T1處理，共有OTU數(shù)為4106個，分別占T0和T1處理OTU總數(shù)的78.70%和84.69%；對比T0和T2處理，共有OTU數(shù)為4069個，分別占T0和T2處理OTU總數(shù)的78.00%和74.95%。

2.3 土壤微生物群落多樣性比較

對不同強化處理措施下土壤微生物Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，通過指數(shù)組間差異分析（WelchT檢驗）發(fā)現(xiàn)，T2處理土壤微生物的多樣性和豐富度均最大，且群落多樣性和T1處理的差異達(dá)到了顯著水平(0.01＜P≤0.05)。與CK相比，銅脅迫（T0～T3處理）均增加了土壤微生物群落的豐富度（圖4）。

圖4 不同處理土壤微生物Alpha多樣性指數(shù)

根據(jù)樣本的OTU豐度信息對土壤微生物群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，由圖5可知，不同處理的3個重復(fù)均聚類在一起，說明OTU水平上5個處理的組間差異大于組內(nèi)差異。基于Bray-Curtis距離進(jìn)行Adonis分析，結(jié)果表明：在OTU水平上，5個不同處理土壤微生物組成具有顯著差異(R2=0.5609，P=0.001)。T0和T1處理位于同一象限，說明這2個處理微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似；CK距離最遠(yuǎn)，說明和其他四組處理微生物群落差異性最大。

圖5 不同處理土壤微生物PCoA分析

2.4 土壤微生物群落差異物種比較

基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù)，使用WelchT檢驗方法對不同處理土壤微生物群落進(jìn)行門水平上的兩組間差異顯著性檢驗分析（圖6）。

圖6 不同處理土壤微生物門水平上兩組間差異顯著性檢驗分析

針對微生物群落的優(yōu)勢物種（相對豐度＞5%），和CK相比，T0處理增加了酸桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的相對豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對豐度降低。和T0相比，T1處理增加了厚壁菌門、酸桿菌門和變形菌門的相對豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對豐度降低；T2處理增加了變形菌門和放線菌門的相對豐度，酸桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的相對豐度降低；T3處理增加了酸桿菌門、綠彎菌門和變形菌門的相對豐度，厚壁菌門和放線菌門的相對豐度降低。

與CK相比，T0處理下擬桿菌門(Bacteroidota)的豐度顯著升高，Methylomirabilota、浮霉菌門(Planctomycetota)、匿 桿 菌 門 (Latescibacterota)、Entotheonellaeota和Armatimonadota的豐度顯著降低。與T0處理相比，T1處理下Entotheonellaeota和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcota)的豐度顯著升高，匿桿菌門和Sumerlaeota的豐度顯著降低；T2處理下藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)的豐度顯著降低；T3處理下MBNT15的豐度顯著升高。

不同處理下出現(xiàn)了一些特異物種，異常球菌-棲熱菌門在T0、T1、T2和T3中發(fā)現(xiàn)，CK中并未檢測出；Deferrisomatota在CK、T1、T2和T3中發(fā)現(xiàn)，T0中并未檢測出；Calditrichota、WS2、螺旋體門(Spirochaetota)和DTB120在CK、T0、T2和T3中發(fā)現(xiàn)，T1中并未檢測出；Abditibacteriota在T1和T3中發(fā)現(xiàn)，CK、T0和T2中并未檢測出；FCPU426在T0和T3中發(fā)現(xiàn)，CK、T1和T2并未檢測出。

3 結(jié)論

在門水平上，不同處理土壤微生物群落組成較為相似，優(yōu)勢物種相同，豐度較大的門類為酸桿菌門、變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門。

在OTU水平上，不同處理土壤微生物組成具有顯著差異，對微生物群落影響排序為：銅脅迫＞螯合劑＞有機物覆蓋；不同處理出現(xiàn)了特異物種，空白對照和其他處理差異性最大，銅脅迫和有機物覆蓋處理微生物群落組成最為相近。

銅脅迫均增加了土壤微生物群落的豐富度；添加螯合劑處理土壤微生物群落的多樣性和豐富度均最大，且群落多樣性和有機物覆蓋處理的差異達(dá)到了顯著水平。

4 討論

在門水平上，不同處理土壤微生物群落組成較為相似，優(yōu)勢物種相同。在OTU水平上，不同處理土壤微生物群落組成具有顯著差異，但仍有部分微生物對環(huán)境改變表現(xiàn)出穩(wěn)定性以及高抗銅污染能力?？軙鹊萚14]通過研究銅、鉛、鋅以及3種復(fù)合污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，各處理組之間的擴增群落存在差異，但微生物群落大部分種類表現(xiàn)出對重金屬污染的耐受性，說明修復(fù)后的土壤微生物群落可以恢復(fù)或保持與未處理對照組相似的結(jié)構(gòu)。

通過對比兩組間共有OTU發(fā)現(xiàn)，占比從大到小分別為：T0和T1，T0和T2，CK和T0，由此可以得出，不同強化處理措施對微生物群落影響排序為：銅脅迫＞螯合劑＞有機物覆蓋。

Alpha多樣性是評價土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，銅脅迫處理均增加了土壤微生物群落的豐富度，這與葛藝等[15]研究小麥非根際以及根際微生物群落豐富度的結(jié)果一致。另外，添加螯合劑處理土壤微生物的多樣性和豐富度均最大。趙金博等[16]通過梯度試驗探究EDTA處理土壤殘留液對微生物群落的影響發(fā)現(xiàn)，在0-10 mmol/L濃度的EDTA處理下，微生物群落沒有明顯變化，在5 mmol/L濃度的EDTA處理下土壤微生物總量略有上升。羅春玲等[17]研究表明不同濃度EDDS處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

針對微生物群落的優(yōu)勢物種（相對豐度＞5%），銅處理增加了酸桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的相對豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對豐度降低；有機物覆蓋處理增加了厚壁菌門、酸桿菌門和變形菌門的相對豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對豐度降低；螯合劑處理增加了變形菌門和放線菌門的相對豐度，酸桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的相對豐度降低；有機覆蓋+螯合劑處理增加了酸桿菌門、綠彎菌門和變形菌門的相對豐度，厚壁菌門和放線菌門的相對豐度降低。靳曉拓等[18]研究報道有機質(zhì)與放線菌門和變形菌門相對豐度成正相關(guān)，與厚壁菌門的相對豐度呈負(fù)相關(guān)；程存剛等[19]研究表明有機物料的種類對于微生物種群結(jié)構(gòu)的影響差異顯著，因此可能由于土壤性質(zhì)、有機質(zhì)類型以及施用量差異導(dǎo)致與本研究結(jié)果不完全一致。Berg等[20]研究表明綠彎菌門對高金屬含量具有普遍不耐受性，比如銅。安夢潔等[21]通過FTIR分析和高通量測序表明，碳?xì)滏I的形成為放線菌門和綠彎菌門提供了適宜的環(huán)境，有利于提高微生物豐度。而施用修復(fù)劑使土壤中Pb和Cd的有效性降低，破壞了碳?xì)滏I，因而使得放線菌門和綠彎菌門的豐度減少。Bonanomi等[22]研究表明酸桿菌門能夠降解纖維素和木質(zhì)素，進(jìn)而為土壤提供養(yǎng)分。本研究中，銅處理下酸桿菌門的豐度增加，表明土壤可能通過增加酸桿菌門細(xì)菌的豐度進(jìn)而促進(jìn)木質(zhì)素和纖維素的分解，以增強柳樹對養(yǎng)分的吸收?？軙鹊萚14]研究表明銅脅迫會增加土壤中酸桿菌門和變形菌門的相對豐度，與本研究結(jié)果一致。有研究指出，外源增加土壤中酸桿菌門和厚壁菌門的豐度，可以改變微生物種群的相互作用和平衡，從而促進(jìn)作物生長[23-24]。有研究表明，水稻田中變形菌門微生物具有耐重金屬性，具有固氮功能，利用光合作用儲存能量[25]。

不同處理下出現(xiàn)了特異物種，空白對照中未檢出異常球菌-棲熱菌門，有研究表明該軍門包括對嚴(yán)酷環(huán)境有抗性的球狀細(xì)菌[26]，可能是銅脅迫下產(chǎn)生了具有特殊選擇性優(yōu)勢的耐金屬極端微生物。單一銅脅迫下，Deferrisomatota未檢出，可能是高濃度銅脅迫造成該物種被消除。有機物覆蓋處理下，Calditrichota、WS2、螺旋體門和DTB120未檢出，可能是樹枝落葉類覆蓋單獨處理下產(chǎn)生某種脅迫導(dǎo)致這些物種被消除。有機物覆蓋和有機物覆蓋+螯合劑聯(lián)合處理中檢出Abditibacteriota，可能是樹枝落葉類覆蓋處理下產(chǎn)生的具有特殊選擇性優(yōu)勢的微生物。單一銅脅迫和有機物覆蓋+螯合劑聯(lián)合處理中檢出FCPU426，原因待進(jìn)一步分析。