全自動微生物分析儀在臨床兒科肺炎鏈球菌藥敏試驗中的應用

文/鄧起秀

肺炎鏈球菌是小兒肺炎、菌血癥、腦膜炎等諸多細菌感染疾病的主要病原菌之一，相關數(shù)據(jù)表明，全球5歲以下兒童中每年約有70～100萬死于肺炎鏈球菌性疾病。因此，加強對肺炎鏈球菌的抗菌藥物敏感性試驗，早期采取針對性的抗菌藥物治療方案尤為重要。但有研究指出，不同的抗菌藥物敏感性試驗方法可取得不同的檢測結果。E-test法在臨床上較為常見，可取得較高的準確性。隨著檢驗技術的不斷發(fā)展，全自動微生物分析儀因其具有檢測快速、操作簡便、檢測準確等優(yōu)勢在臨床中得到廣泛應用。基于上述背景，本文將2021年7月至2021年11月本院兒科分離的30株肺炎鏈球菌作為研究對象，其中將青霉素用鄭州安圖E-test法與國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）進行對比，其他抗菌藥物敏感性試驗用溫州康泰藥敏紙片（K-B法）與國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）進行對比，觀察檢測結果，旨在探索一種簡便、快速、有效的檢驗方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機抽取2021年7月至2021年11月本院分離的肺炎鏈球菌30株進行研究，均來源于兒科患兒的痰液、鼻腔分泌物等標本（同一患兒同一標本類型，不重復計入）。對應的患兒信息為男23例，女7例；年齡1個月～6歲，平均（3.15±0.92）歲，其中1個月～1歲27例，1～3歲2例，3～5歲1例；肺炎2例，鼻竇炎1例，急性咽炎1例，支氣管肺炎26例；咳嗽14例，咳痰5例，喘息1例，氣促2例，發(fā)熱8例。

1.2 方法

試劑與儀器：K-B法藥敏紙片（溫州康泰），青霉素E-test紙條（鄭州安圖）、血瓊脂平板、5%綿羊血MHA平板（鄭州安圖），麥氏標準比濁管、藥敏稀釋液、藥敏指示劑、樣本稀釋液、細菌鑒定藥敏鑒定板（珠海迪爾生物工程）。

（1）細菌分離鑒定：將標本接種于血瓊脂平板中，放置于5%CO、35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，經(jīng)典型菌落形態(tài)觀察，挑選血平板上草綠色溶血、臍窩狀的可疑菌落做進一步分純，同時采用藥敏紙片進行奧普托欣敏感性試驗，再用國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）鑒定為肺炎鏈球菌。

（2）抗菌藥物敏感性試驗：采用苛養(yǎng)菌5%綿羊血MHA平板以K-B法復核藥敏結果，其中青霉素采用E-test方法，同時也用國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）進行抗菌藥物敏感性試驗。

（3）具體操作方法：

①K-B法：嚴格按照第四版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行，選取血瓊脂平板上菌落配置0.5麥氏濁度菌懸液，用無菌棉拭子蘸取調好的菌液，擠出過多菌液，在5%綿羊血MHA平板表面反復均勻涂抹3次，每涂抹一次旋轉平板60°，最后沿平板內緣涂兩圈，待瓊脂表面菌液干燥，在15～20min內用無菌鑷子將紙片貼于平板表面，各紙片中心距離不小于24mm，并確保紙片與平板表面完全接觸，放置于35℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h后測量抑菌圈直徑。

②青霉素E-test方法：前述步驟與K-B法一致，待瓊脂表面菌液干燥用無菌鑷子將E試條貼于平板表面，確保整個藥敏條與瓊脂表面完全接觸，放置于35℃、5%的CO培養(yǎng)箱中孵育20～24h后讀取結果。

③微量肉湯稀釋法（參考方法）：取純培養(yǎng)單個菌落于稀釋液瓶內壁研磨呈細菌懸液（2麥氏），用連續(xù)移液器吸取該菌懸液加入試劑板A5-A12孔內，每孔100μL，吸菌懸液500μL，加至增菌肉湯培養(yǎng)基中，充分混勻，繼續(xù)加入試劑板A1-A4、B1-B7孔內，每孔100μL，在A1-A4、A9、B1-B7孔分別滴加無菌液狀石蠟兩滴；再吸剩余增菌肉湯培養(yǎng)基50μL，加至藥敏培養(yǎng)基，充分混勻，繼續(xù)加入試劑板其余各孔（所有的抗菌藥物MIC測定試驗孔、生長對照空及6.5%NACL），每孔100μL，并在C1孔滴加無菌液狀石蠟2滴；封板然后放培養(yǎng)箱35℃18～24h后上機讀取結果。

（4）質量控制：質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619，其藥敏結果必須符合質控范圍。

1.3 觀察指標

（1）檢測結果：3種方法均根據(jù)CLSIM100第30版規(guī)定的折點判斷標準進行檢測結果分析，主要分為3級：敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。（2）青霉素以E-test法進行實驗，其他藥物以K-B法進行實驗，均經(jīng)國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）復核。參照上述CLSI規(guī)定的折點判斷標準，分析檢驗結果：①分類符合（CA），國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）S、I、R結果與E-test法/K-B法檢驗結果一致；②非常重大誤差（VME），國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）將R誤判為S；③重大誤差（ME），國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）將S判定為R；④一般誤差（mE），E-test法/K-B法檢驗結果為S或R，而國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）結果為I或E-test法/K-B法檢驗結果為I，而國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）結果為S或R?？山邮艿恼`差范圍：CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%。

2 結果

2.1 檢測結果分析

根據(jù)CLSI折點判定標準，珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）與E-test法/K-B法的S、I、R結果如表1所示。

表1 檢測結果分析

2.2 兩種檢測方法比較

青霉素以E-test檢驗結果為參考，其他抗菌藥物以K-B法復核，國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）對青霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、利福平、利奈唑胺、四環(huán)素的CA均為100.00%；對復方新諾明的CA為93.33%，ME為6.67%；對紅霉素、克林霉素的CA均為93.33%，mE均為6.67%。具體結果如表2所示。

表2 兩種實驗方法比較［n=30，例（%）］

3 討論

肺炎鏈球菌是兒童呼吸道感染的主要致病菌之一，也是大葉性肺炎的病原菌，還可伴有菌血癥。肺炎鏈球菌屬條件致病菌，正常情況下定植于鼻咽部，當機體免疫功能失衡時，可引起鼻竇炎、中耳炎等非侵襲性疾??；若細菌入血，還可引起骨髓炎、菌血癥、敗血癥等，對患兒的生命安全造成威脅。隨著青霉素的廣泛應用，細菌耐藥性的問題日益突出，引起多重耐藥菌株，顯著增加臨床治療難度。有研究通過對某地區(qū)患兒的侵襲性肺炎鏈球菌病患兒進行分析發(fā)現(xiàn)，死亡病例的分離菌株多為多重耐藥菌株，故認為多重耐藥與患兒的不良預后有一定的聯(lián)系；同時青霉素不敏感患兒合并基礎疾病、罹患腦膜炎、合并多種耐藥的概率依次為30.7%、32.0%、86.7%，均高于青霉素敏感肺炎鏈球菌患兒的15.4%、9.2%、63.1%。由此可見，青霉素引起的耐藥問題會對患兒的臨床預后產(chǎn)生不良影響，故選擇一種有效、安全的抗菌藥物尤為重要。王傳清等于2016年對10家兒童醫(yī)院進行監(jiān)測，結果發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌是我國兒童臨床優(yōu)勢分離株，且兒童的分離比例明顯高于成人；而肺炎鏈球菌青霉素不敏感株占比從0.9%到71%不等，提示細菌耐藥問題形勢嚴峻。

抗菌藥物敏感性試驗，簡稱藥敏試驗，是指在體外測定抗菌藥物抑制或殺滅微生物的能力，能夠為臨床治療選擇準確的抗菌藥物，常見的檢驗方法包括肉湯稀釋法、E-tset法、紙片擴散法等?？咕幬锩舾行栽囼?，能夠針對菌株選擇敏感性抗菌藥物，最大化確?？垢腥局委熜Ч瑢τ诨純旱呐R床治療及預后具有重要意義。根據(jù)CLSI相關規(guī)定，頭孢曲松、美羅培南等均可用于肺炎鏈球菌感染的治療，但針對上述藥物尚無可靠的K-B法進行抗菌藥物敏感性試驗，故建議應采用MIC法進行確定。全自動微生物分析儀是目前國內臨床廣泛應用的抗菌藥物敏感性試驗方法，其中國產(chǎn)珠海迪爾細菌測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）能夠測得青霉素、復方新諾明、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、利福平、萬古霉素等多種抗菌藥物的MIC值。該分析儀的檢驗原理檢測系統(tǒng)由生化反應孔和抗菌藥物MIC測定試驗孔組成，在生化反應孔加入細菌懸液，抗菌藥物MIC測定試驗孔中加入培養(yǎng)基，經(jīng)35℃～37℃孵育。生化反應在細菌代謝作用下直接產(chǎn)生顏色變化或經(jīng)加入顯色劑后產(chǎn)生顏色變化，抗菌藥物MIC測定試驗根據(jù)試驗孔是否出現(xiàn)渾濁（沉淀）確定細菌是否生長，通過細菌測定系統(tǒng)分析從而將細菌快速、準確地鑒定到種屬，同時分析抗菌藥物的MIC值。本研究將青霉素以E-test法進行試驗，其他藥物以K-B法進行試驗，結果顯示該分析儀對青霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、利福平、利奈唑胺、四環(huán)素的CA均為100.00%，提示國產(chǎn)珠海迪爾測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）在上述6種抗菌藥物藥敏性試驗中與E-test法/K-B法具有高度一致性。分析儀對復方新諾明、紅霉素、克林霉素的CA均為93.33%，＞90%，提示符合率在標準范圍內。在誤差結果分析方面，發(fā)現(xiàn)分析儀對紅霉素、克林霉素的mE均為6.67%，符合≤10%的標準，提示誤差在可接受范圍內；但對復方新諾明的ME為6.67%，不符合≤3%的標準，提示誤差在不可接受范圍內。由此可見，對于肺炎鏈球菌，國產(chǎn)珠海迪爾測定系統(tǒng)檢（DL-96Ⅱ）測復方新諾明的藥敏試驗不可靠，需進行進一步驗證。但綜合研究結果可知，國產(chǎn)珠海迪爾測定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）可檢出肺炎鏈球菌對多種抗菌藥物的敏感性，且與K-B法相比存在較高的一致性，證實該分析儀在肺炎鏈球菌中抗菌藥物敏性試驗中的應用價值。黃梅等研究中還指出，全自動微生物分析儀檢驗快速、重復性高，可顯著提升工作效率，且受到人為因素的影響較小，檢驗結果具有較高的準確性。

綜上所述，全自動微生物分析儀具有檢驗準確、操作簡便、快速、受人為因素影響小、重復性高、精確檢測細菌的MIC濃度、結果符合率高等特點，可檢出兒科肺炎鏈球菌對大部分抗菌藥物的敏感性，但在復方新諾明的敏感試驗中尚存在一定的局限性，還需做進一步驗證。