微塑料對(duì)外生菌根真菌生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)的影響

李玉婷，李 莎，曹 杰，李驕楊，張 亮，*，許曉風(fēng)，2

(1.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

2004年，研究人員首次在海洋水體和沉積物中發(fā)現(xiàn)塑料碎片，并提出微塑料的概念。自此，微塑料作為一種新型持久性環(huán)境污染物逐漸成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。目前，學(xué)術(shù)界一般把粒徑在5 mm以下的塑料顆粒稱為微塑料。

塑料產(chǎn)品因具有使用方便、價(jià)格低廉、經(jīng)久耐用和可塑性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)塑料制品在2019年的產(chǎn)量達(dá)到了8 184萬(wàn)t。這些塑料制品在使用之后進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)中，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的風(fēng)化、水流、光照和生物分解等作用形成微塑料，并廣泛存在于環(huán)境中。微塑料直徑微小，容易遷移，湖泊、海洋、陸地等生態(tài)系統(tǒng)均被發(fā)現(xiàn)存在大量微塑料，甚至人體也會(huì)由于食物鏈的層層傳遞而出現(xiàn)微塑料。微塑料可吸附化學(xué)農(nóng)藥、抗生素、重金屬、壬基苯酚等污染物，因此會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

目前，關(guān)于微塑料的研究多集中在環(huán)境調(diào)查和水生生物毒理學(xué)方面。在環(huán)境調(diào)查方面，研究人員主要圍繞海洋、河口、淡水湖和海岸區(qū)域中微塑料的來(lái)源、遷移、形態(tài)、含量等進(jìn)行了調(diào)查；在水生生物毒理學(xué)研究方面，關(guān)注對(duì)象主要集中于浮游動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、軟體動(dòng)物和貝類(lèi)等。有研究表明，微塑料可通過(guò)地膜降解、污泥施用、大氣沉降等方式在土壤中大量積累，土壤中微塑料的含量是海洋中的4～23倍。但是，迄今關(guān)于微塑料在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的環(huán)境行為及其機(jī)制的研究還相對(duì)薄弱。Rillig等研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓的攝食和運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)微塑料在土壤內(nèi)部的遷移，并且微塑料粒徑越小，越容易遷移。除蚯蚓外，線蟲(chóng)、跳蟲(chóng)等動(dòng)物也能夠取食微塑料。土壤中的彈尾蟲(chóng)和線蚓腸道菌在微塑料中暴露56 d后，其群落結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)繁殖均受到顯著抑制。此外，研究表明，將綠豆幼苗暴露在100 mg·L的聚乙烯微塑料中，其生長(zhǎng)和水分含量均受到顯著抑制；Giorgetti等發(fā)現(xiàn)，50 nm的聚苯乙烯微塑料能夠進(jìn)入洋蔥根系分生區(qū)細(xì)胞中并引起氧化脅迫，使細(xì)胞生理功能發(fā)生改變(如導(dǎo)致有絲分裂異常)；Jiang等發(fā)現(xiàn)，暴露在5 μm聚苯乙烯熒光微塑料中的蠶豆幼苗，其生物量和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性顯著降低，超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性顯著升高；但連加攀等發(fā)現(xiàn)，乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、線性低密度聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯3種微塑料在0～1 000 mg·L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)小麥根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和干重?zé)o顯著影響。

外生菌根真菌能與高等植物的根部形成菌根共生體，從而促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收和對(duì)不良環(huán)境的抗性。微塑料顆粒本就具有較強(qiáng)的黏附性，若長(zhǎng)期存留在土壤中，微塑料很有可能會(huì)進(jìn)一步形成微米型和納米型塑料，極容易被植物根系-外生菌根真菌共生體所產(chǎn)生的多糖黏液、有機(jī)酸等分泌物所捕獲。同時(shí)，塑料顆粒還具有一定的柔韌性，它們可能會(huì)在受到擠壓的情況下進(jìn)入到狹小的根部質(zhì)外體空間，進(jìn)一步滲透進(jìn)入根系皮層和真菌菌絲組織內(nèi)，甚至進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。然而，關(guān)于微塑料對(duì)土壤中外生菌根真菌的毒理學(xué)效應(yīng)及其作用機(jī)制等尚不明確，且在本研究檢索范圍內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，本研究特選取2株外生菌根真菌——彩色豆馬勃(，Pt)和松乳菇(，Ld)作為供試菌株，采用固體平板法和液體培養(yǎng)法，研究不同粒徑的單分散聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)對(duì)土壤外生菌根真菌生長(zhǎng)及其抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為評(píng)估微塑料對(duì)土壤微生物的生態(tài)毒性效應(yīng)和揭示其作用機(jī)制等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將2株真菌(Pt和Ld)接種到Pachlewsk固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d備用。

Pachlewsk固體培養(yǎng)基的配制方法如下：葡萄糖2 g，磷酸二氫鉀0.1 g，酒石酸銨0.05 g，硫酸鎂(MgSO)0.05 g，維生素B0.01 g，瓊脂2 g，微量元素液0.1 mL，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至5.5，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，30 min)。其中，微量元素液的配制方法如下：稱取8.45 mg硼酸(HBO)、6 mg硫酸亞鐵(FeSO)、5 mg硫酸錳(MnSO)、2.77 mg氯化鋅(ZnCl)、0.625 mg硫酸銅(CuSO)和0.27 mg鉬酸銨[(NH)MoO]，溶于1 L蒸餾水中，滅菌保存。以上用到的試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PS-MPs購(gòu)自天津賽爾群科技有限公司，粒徑分別為80 nm和4 μm，將其分別分散于10 mL的無(wú)菌水中(質(zhì)量濃度為25 g·L)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PS-MPs的表征情況

將PS-MPs稀釋一定倍數(shù)，稀釋前后分別進(jìn)行超聲波分散處理10 min。分別采用Tecnai G2 F20場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)、Gemini SEM500掃描電子顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)觀察PS-MPs的形貌特征，采用Zetasizer Nano ZS 90激光粒度儀(英國(guó)Malvern公司)測(cè)定PS-MPs懸浮液的粒徑分布。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在超凈工作臺(tái)中，將2種粒徑的PS-MPs原液(質(zhì)量濃度為25 g·L)均稀釋成1 000 mg·L的母液，分別取一定體積的PS-MPs母液，配制成含0(對(duì)照組)、10、20、50、100、200、300 mg·LPS-MPs的Pachlewsk液體培養(yǎng)液(PS-MPs稀釋前后均進(jìn)行超聲波分散處理)，分別取15、20 mL的液體培養(yǎng)液用于制作固體平板和液體培養(yǎng)基，接種一塊按1.1節(jié)方法活化好的固體菌塊(直徑6 mm)。每個(gè)處理重復(fù)5次。全部接種后，將固體平板放置于25 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)14 d，將液體培養(yǎng)基放置于25 ℃、120 r·min的搖床上振蕩培養(yǎng)14 d。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

固體平板培養(yǎng)結(jié)束后，觀察真菌生長(zhǎng)情況。液體培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)菌絲進(jìn)行過(guò)濾處理，將收集的菌絲在烘箱中烘干(105 ℃)，測(cè)干重(即每瓶真菌菌絲生物量)。另外取適量菌絲，分別采用硫代巴比妥酸法和分光光度法測(cè)定丙二醛(MDA)和可溶性蛋白含量，所用儀器為UV-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；用DDS-11A型數(shù)顯電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定電導(dǎo)率。再取適量菌絲，加入預(yù)冷磷酸緩沖液，在冰浴中研磨成勻漿，離心后制成粗酶液，然后分別采用氯化硝基四氮唑藍(lán)光化學(xué)還原反應(yīng)法、愈創(chuàng)木酚法和紫外分光光度法測(cè)定SOD、POD和CAT活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進(jìn)行整理和繪圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)有顯著(<0.05)差異的，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 微塑料的表征情況

利用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)和激光粒度儀對(duì)PS-MPs進(jìn)行相關(guān)表征(圖1)，可以看出，本試驗(yàn)所用80 nm和4 μm粒徑的PS-MPs在水溶液中呈球狀，平均粒徑分別為80.05 nm和3.94 μm，微塑料溶液體系分布較為均勻，分散效果良好。

A，80 nm PS-MPs的透射電子顯微鏡圖；B，4 μm PS-MPs的掃描電子顯微鏡圖；C，80 nm PS-MPs的粒徑分布；D，4 μm PS-MPs的粒徑分布。

2.2 微塑料對(duì)外生菌根真菌生長(zhǎng)和生物量的影響

在固體平板培養(yǎng)中，當(dāng)使用4 μm PS-MPs處理時(shí)，隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的增加，與對(duì)照組相比，Pt的生長(zhǎng)情況逐漸受到抑制，且PS-MPs的質(zhì)量濃度越高，抑制越明顯；而Ld的生長(zhǎng)情況在10～50 mg·L與對(duì)照組無(wú)明顯變化，當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度大于100 mg·L時(shí)，其生長(zhǎng)情況受到明顯抑制(圖2)。當(dāng)使用80 nm PS-MPs處理時(shí)，隨著其質(zhì)量濃度的增加，Pt和Ld的生長(zhǎng)情況均逐漸受到抑制，且PS-MPs的質(zhì)量濃度越高，抑制越明顯。

圖2 聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)對(duì)外生菌根真菌彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius)(A)和松乳菇(Lactarius delicious)(B)生長(zhǎng)情況的影響

從外生菌根真菌的生物量變化(圖3)來(lái)看，無(wú)論是使用哪種粒徑的PS-MPs，Pt的生物量均隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的升高而逐漸降低。當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為300 mg·L時(shí)，與對(duì)照組相比，4 μm和80 nm粒徑PS-MPs處理下，Pt的生物量分別顯著(<0.05)下降了63.81%和51.46%。

柱上無(wú)相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

當(dāng)使用4 μm的PS-MPs處理時(shí)，Ld的生物量在10～50 mg·L處理下與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度大于50 mg·L時(shí)，Ld的生物量較對(duì)照組顯著(<0.05)降低。當(dāng)使用80 nm的PS-MPs處理時(shí)，Ld的生物量隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的升高而逐漸降低。當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為300 mg·L時(shí)，與對(duì)照組相比，4 μm和80 nm粒徑的PS-MPs處理下，Ld的生物量分別顯著(<0.05)下降了67.26%和50.15%。

當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為10～100 mg·L時(shí)，4 μm和80 nm粒徑的PS-MPs對(duì)Pt生物量的影響無(wú)顯著差異；但當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為200～300 mg·L時(shí)，4 μm較80 nm粒徑PS-MPs對(duì)Pt生物量表現(xiàn)出顯著(<0.05)更強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為10～100 mg·L處理時(shí)，80 nm較4 μm粒徑的PS-MPs對(duì)Ld生物量表現(xiàn)出顯著(<0.05)更強(qiáng)的抑制作用；但當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為200～300 mg·L時(shí)，4 μm較80 nm粒徑的PS-MPs對(duì)Ld生物量表現(xiàn)出顯著(<0.05)更強(qiáng)的抑制作用。

2.3 微塑料對(duì)外生菌根真菌抗氧化系統(tǒng)、可溶性蛋白和組織電導(dǎo)率的影響

2.3.1 抗氧化酶活性

隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的增加，暴露于2種徑粒PS-MPs的Pt和Ld，其SOD活性總體呈先升高后降低的趨勢(shì)(表1)。當(dāng)使用4 μm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，在50 mg·L的質(zhì)量濃度下Pt和Ld的SOD活性均最高，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了4.36倍和4.09倍。當(dāng)使用80 nm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，在100 mg·L的質(zhì)量濃度下Pt的SOD活性最高，比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了5.14倍；在50 mg·L的質(zhì)量濃度下Ld的SOD活性最高，比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了6.21倍。

表1 微塑料對(duì)外生菌根真菌SOD、CAT和POD活性的影響

當(dāng)Pt和Ld暴露于4 μm粒徑的PS-MPs時(shí)(除Ld在PS-MPs質(zhì)量濃度為20、50 mg·L時(shí)以外)，與對(duì)照組相比，其CAT活性均顯著(<0.05)降低，且當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為300 mg·L時(shí)，其CAT活性最低。當(dāng)Pt暴露于80 nm粒徑的PS-MPs時(shí)，與對(duì)照組相比，其CAT活性均顯著(<0.05)降低，且當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為300 mg·L時(shí)，其CAT活性最低。但當(dāng)Ld暴露于80 nm粒徑的PS-MPs時(shí)，與對(duì)照組相比，其CAT活性表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為50 mg·L時(shí)，其CAT活性最高，當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度為300 mg·L時(shí)，其CAT活性最低。

當(dāng)使用4 μm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，與對(duì)照組相比，在20～100 mg·L的質(zhì)量濃度下，Pt的POD活性顯著(<0.05)升高，在200～300 mg·L的質(zhì)量濃度下，Pt的POD活性顯著(<0.05)降低；在20～200 mg·L的質(zhì)量濃度下，Ld的POD活性顯著(<0.05)升高，在300 mg·L的質(zhì)量濃度下，Ld的POD活性顯著(<0.05)降低。在100 mg·L的質(zhì)量濃度下，Pt和Ld的POD活性均最高，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了1.35倍和2.69倍；在300 mg·L的質(zhì)量濃度下Pt和Ld的POD活性均最低，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)降低了72.92%和40.76%。

當(dāng)使用80 nm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，與對(duì)照組相比，Pt和Ld的POD活性均顯著(<0.05)升高，其中，Pt和Ld分別在PS-MPs的質(zhì)量濃度為50 mg·L和10 mg·L時(shí)POD活性最高，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)增加6.11倍和7.33倍。

2.3.2 MDA含量

MDA是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量常被用于反映植物細(xì)胞的氧化損傷程度，含量越高，說(shuō)明植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度越高，細(xì)胞膜受到的傷害越嚴(yán)重?？偟膩?lái)看，除10 mg·L4 μm PS-MPs處理下的Pt和200 mg·L4 μm PS-MPs處理下的Ld外，與對(duì)照組相比，暴露于2種粒徑的PS-MPs中，Pt和Ld的MDA含量均顯著(<0.05)升高(圖4)。當(dāng)使用4 μm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，Pt和Ld的MDA含量分別在50、100 mg·L的質(zhì)量濃度下最高，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了1.89倍和56.84%；當(dāng)使用80 nm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，Pt和Ld的MDA含量分別在300、200 mg·L的質(zhì)量濃度下最高，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了1.94倍和1.14倍。這表明，當(dāng)暴露于含有PS-MPs的培養(yǎng)液中時(shí)，外生菌根真菌會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化，細(xì)胞膜會(huì)受到不同程度的傷害。另外，當(dāng)2種粒徑PS-MPs的質(zhì)量濃度同為200～300 mg·L時(shí)，Pt和Ld的MDA含量在80 nm PS-MPs環(huán)境中顯著(<0.05)更高，說(shuō)明菌絲細(xì)胞膜受到的傷害更重。

圖4 聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)對(duì)外生菌根真菌彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius)(A)和松乳菇(Lactarius delicious)(B)丙二醛(MDA)含量的影響

2.3.3 可溶性蛋白含量

可溶性蛋白是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞中的生命物質(zhì)和生物膜具有保護(hù)作用。當(dāng)使用4 μm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的增加，Pt和Ld的可溶性蛋白含量均呈先降后升再降的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比，總體均受顯著(<0.05)抑制，且均在300 mg·L的質(zhì)量濃度下最低，與對(duì)照組相比分別下降了67.39%和80.25%(圖5)。當(dāng)使用80 nm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的增加，Pt的可溶性蛋白含量總體呈先升后降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，在20 mg·L的質(zhì)量濃度下顯著(<0.05)升高，在300 mg·L的質(zhì)量濃度下最低，與對(duì)照組相比下降了59.36%；Ld的可溶性蛋白含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，在10 mg·L的質(zhì)量濃度下與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，在200 mg·L的質(zhì)量濃度下最低，與對(duì)照組相比顯著(<0.05)降低了41.78%。當(dāng)80 nm粒徑PS-MPs的質(zhì)量濃度較低(0～20 mg·L)時(shí)，與對(duì)照組相比，Pt和Ld的可溶性蛋白含量無(wú)顯著變化，甚至升高，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)微塑料的濃度還比較低。隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的上升，兩株外生菌根真菌的可溶性蛋白含量均受到不同程度的抑制，進(jìn)而可能影響真菌的正常代謝活動(dòng)。

圖5 聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)對(duì)外生菌根真菌彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius)(A)和松乳菇(Lactarius delicious)(B)可溶性蛋白含量的影響

2.3.4 菌絲組織電導(dǎo)率

真菌細(xì)胞遭受逆境脅迫后，細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性會(huì)改變或喪失，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲，從而引起組織電導(dǎo)率的變化。因此，菌絲組織電導(dǎo)率也可反映出細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的受傷害程度。當(dāng)Pt和Ld暴露于2種粒徑的PS-MPs時(shí)，與對(duì)照組相比，其菌絲組織的電導(dǎo)率均顯著(<0.05)升高，且隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的增加，總體表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，說(shuō)明PS-MPs對(duì)真菌菌絲細(xì)胞膜有一定的損傷作用。中高濃度的PS-MPs致使菌絲組織電導(dǎo)率顯著升高，暗示其細(xì)胞膜的通透性功能發(fā)生改變。

圖6 聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)對(duì)外生菌根真菌彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius)(A)和松乳菇(Lactarius delicious)(B)菌絲電導(dǎo)率的影響

當(dāng)使用4 μm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，Pt和Ld的菌絲組織電導(dǎo)率分別在100、200 mg·L的質(zhì)量濃度下最高，均比對(duì)照組顯著(<0.05)增加11.3倍；當(dāng)使用80 nm粒徑的PS-MPs進(jìn)行處理時(shí)，Pt和Ld的菌絲組織電導(dǎo)率分別在200、100 mg·L的質(zhì)量濃度下最高，分別比對(duì)照組顯著(<0.05)增加了6.92和7.10倍。整體而言，2種粒徑的PS-MPs相比，當(dāng)Pt和Ld暴露在4 μm粒徑的PS-MPs中時(shí)，其菌絲電導(dǎo)率要相對(duì)更高。

3 討論

目前，有關(guān)微塑料的研究主要集中在海洋、河口和湖泊等水域生態(tài)系統(tǒng)的污染現(xiàn)狀，以及微塑料對(duì)藻類(lèi)、貽貝、魚(yú)類(lèi)、植物種子等材料的毒理學(xué)效應(yīng)及其經(jīng)食物鏈傳遞對(duì)人體健康的威脅等方面，有關(guān)微塑料對(duì)土壤真菌毒性的研究在檢索范圍內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

有研究表明，添加不同濃度的微塑料地膜嚴(yán)重抑制小麥種子的萌發(fā)，小麥種子的發(fā)芽率隨著微塑料濃度增加逐漸降低。李連禎等研究發(fā)現(xiàn)，聚苯乙烯微球(粒徑0.2 μm)可被生菜根部大量吸收和富集，并從根部遷移到地上部。微塑料暴露會(huì)對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生不同程度的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是暴露于哪種粒徑的PS-MPs，菌株P(guān)t和Ld的生長(zhǎng)情況均隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的增加整體表現(xiàn)為抑制作用。這可能與微塑料滲透進(jìn)入真菌組織內(nèi)部，擾亂外生菌根真菌對(duì)水分和養(yǎng)分的正常吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)。有研究表明，微塑料在受到擠壓力后，可進(jìn)入到狹小的根部質(zhì)外體空間。另外，微塑料還可以通過(guò)植物新生側(cè)根邊緣的狹小縫隙進(jìn)入，然后滲透到根系皮層組織甚至到達(dá)導(dǎo)管組織中。微塑料進(jìn)入組織內(nèi)部后，可吸附在水分子中，阻斷細(xì)胞間的連接，形成物理堵塞或者其他損傷，進(jìn)而阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，從而引起細(xì)胞毒性。

POD、SOD和CAT是生物細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要酶，其活性水平能反映生物受逆境影響的程度。三者通過(guò)協(xié)同作用維持生物體自由基的穩(wěn)態(tài)，防止由于自由基不平衡而引起的生理?yè)p傷。高嘉蔚等報(bào)道，大型溞體內(nèi)SOD活性隨著聚氯乙烯(粒徑100 nm或5 μm)濃度的增加，表現(xiàn)為先升高后逐漸降低的趨勢(shì)。這與本研究結(jié)果相似。本研究中，在2種粒徑不同質(zhì)量濃度的PS-MPs處理下，外生菌根真菌的SOD活性始終高于對(duì)照組，且隨PS-MPs質(zhì)量濃度的增加，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。這表明供試真菌菌株受到了嚴(yán)重的環(huán)境脅迫，需要通過(guò)提高體內(nèi)的SOD活性來(lái)清除多余的超氧陰離子自由基，以降低環(huán)境脅迫壓力和毒害效應(yīng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將菜心幼苗暴露于20 μm粒徑的PS-MPs中，當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度低于500 mg·L時(shí)，其CAT活性顯著低于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)暴露在4 μm粒徑的PS-MPs中時(shí)，兩株供試真菌的CAT活性均表現(xiàn)出顯著降低的趨勢(shì)(除Ld在PS-MPs質(zhì)量濃度為20、50 mg·L時(shí)外)，暴露于80 nm粒徑PS-MPs的菌株P(guān)t的CAT活性較對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明微塑料的脅迫已經(jīng)超出了菌株自身調(diào)節(jié)能力的閾值，酶活受到損傷。安菁等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)暴露于含有聚氯乙烯(粒徑<15 μm)的土壤中時(shí)，大豆葉片的CAT活性隨土壤微塑料含量的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。這與本試驗(yàn)中暴露于80 nm粒徑PS-MPs下菌株Ld的CAT活性變化一致。這可能是因?yàn)?，?0～50 mg·L的PS-MPs處理下，菌株Ld需要通過(guò)提高CAT活性來(lái)分解體內(nèi)累積的HO，從而使細(xì)胞免于遭受HO的毒害；而高濃度PS-MPs處理下，CAT活性顯著降低。有研究表明，暴露在聚氯乙烯(粒徑3 μm)環(huán)境中，黑藻體內(nèi)的POD活性隨脅迫濃度增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。本研究中，在4 μm粒徑的PS-MPs處理下，菌株P(guān)t和Ld的POD活性在中濃度時(shí)顯著升高，在低濃度或高濃度下無(wú)顯著變化或顯著降低，且2株菌在相同質(zhì)量濃度的80 nm粒徑PS-MPs處理下，其POD活性要高于4 μm粒徑PS-MPs的處理。這暗示，兩株供試真菌在80 nm粒徑PS-MPs處理下產(chǎn)生的自由基更多，需要通過(guò)提高體內(nèi)POD的活性來(lái)維持自由基含量的平衡。抗氧化酶活性的短暫升高可能是機(jī)體為免受外界脅迫毒害而采取的調(diào)節(jié)措施，酶活性下降暗示其所受脅迫已超出自身調(diào)節(jié)能力范圍。綜合來(lái)看，PS-MPs對(duì)外生菌根真菌的毒性機(jī)制可能涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)暴露于2種粒徑的PS-MPs時(shí)，2株供試菌株的MDA含量比對(duì)照組顯著升高(除10 mg·L4 μm PS-MPs處理下的Pt和200 mg·L4 μm PS-MPs處理下的Ld外)。有研究表明，大豆幼苗在生長(zhǎng)初期，隨著盆栽土壤中微塑料(粒徑<15 μm)含量的增加，植株SOD、POD等抗氧化酶的活性顯著升高，而自由基和MDA含量降低。這與本研究結(jié)果相反。我們推測(cè)，這可能是由于本試驗(yàn)中采用的微塑料粒徑是4 μm和80 nm，粒徑更小且粒徑統(tǒng)一，比表面積和表面能更大，與真菌細(xì)胞的接觸面積更大，結(jié)合微塑料的濃度、表面電荷等自身特性，及真菌細(xì)胞對(duì)微塑料的響應(yīng)等多種因素，導(dǎo)致微塑料對(duì)真菌細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化損傷，產(chǎn)生大量的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物。當(dāng)PS-MPs的質(zhì)量濃度同為200～300 mg·L時(shí)，供試菌株的MDA含量在80 nm粒徑PS-MPs條件下顯著高于4 μm粒徑PS-MPs，說(shuō)明在80 nm粒徑PS-MPs脅迫下，細(xì)胞膜受到的傷害更嚴(yán)重，這可能與納米級(jí)PS-MPs更易滲入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，對(duì)細(xì)胞膜造成損害有關(guān)。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的生物膜起保護(hù)作用。本研究顯示，在4 μm粒徑PS-MPs暴露組中，菌株P(guān)t和Ld的可溶性蛋白含量均呈先降后升再降的趨勢(shì)，但總體受抑制。然而，廖苑辰等研究表明，小麥幼苗葉片的可溶性蛋白含量隨PS-MPs含量增加(0～100 mg·kg)，在粒徑5 μm和100 nm PS-MPs暴露下，可溶性蛋白含量呈先升后降再升的趨勢(shì)。這與本研究結(jié)果不同，可能是由于真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁成分和機(jī)械強(qiáng)度不同，且試驗(yàn)中設(shè)置的微塑料濃度不同，導(dǎo)致微塑料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的濃度也有所區(qū)別，進(jìn)而對(duì)可溶性蛋白的合成和分解產(chǎn)生了不同的影響。在80 nm粒徑PS-MPs暴露組中，菌株P(guān)t的可溶性蛋白含量呈先升后降的趨勢(shì)，而菌株Ld的可溶性蛋白含量呈逐漸下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)?，在低濃度?0 nm粒徑PS-MPs暴露下，兩株真菌可溶性蛋白的產(chǎn)生并未受到明顯影響；但隨著PS-MPs質(zhì)量濃度的上升，真菌的正常生命活動(dòng)受影響，從而抑制了可溶性蛋白的生成。

當(dāng)真菌受到逆境影響時(shí)，細(xì)胞膜被破壞，膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，以至真菌組織浸提液的電導(dǎo)率增大。一般來(lái)說(shuō)，膜透性增大的程度與逆境脅迫強(qiáng)度有關(guān)，也與生物體的抗逆性強(qiáng)弱有關(guān)。本研究表明，在2種粒徑的PS-MPs處理中，真菌菌絲組織的電導(dǎo)率均高于對(duì)照組。這說(shuō)明PS-MPs脅迫使細(xì)胞膜受到了不同程度的傷害，且整體來(lái)看，PS-MPs質(zhì)量濃度越高，對(duì)真菌細(xì)胞膜的傷害越嚴(yán)重。

綜上，微米級(jí)和納米級(jí)的PS-MPs暴露對(duì)外生菌根真菌生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)均產(chǎn)生了一定影響，且PS-MPs的粒徑和質(zhì)量濃度不同，對(duì)外生菌根真菌的效應(yīng)也有所差異，研究結(jié)果可為揭示微塑料對(duì)土壤外生菌根真菌的急性毒性提供依據(jù)，但關(guān)于其內(nèi)在機(jī)制等還有待進(jìn)一步研究。