藍桉根際菌根真菌的分離鑒定及其對藍桉生長和光合特性的影響

王曉麗，趙英偉，孔曉娜，曹子林

(1.西南林業(yè)大學 林學院，云南 昆明 650224； 2.廣西國有東門林場，廣西 扶綏 532108； 3.西南林業(yè)大學 生態(tài)與環(huán)境學院，云南 昆明 650224)

藍桉(Labill.)是桉樹中少有的油材兼用樹種，經(jīng)濟價值突出，現(xiàn)在我國云南省已有引種栽植和分布。依靠施用化學肥料來提高油、材產(chǎn)量是目前藍桉人工林培育和經(jīng)營中的常規(guī)管理技術(shù)；但是，施用化學肥料不僅成本高，而且還易對環(huán)境造成污染，不利于藍桉人工林的可持續(xù)發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，菌根不僅有助于培育壯苗，而且可增強苗木從環(huán)境中吸收水分和各種營養(yǎng)物質(zhì)的能力，促進林木的生長發(fā)育，提高林木的產(chǎn)量和質(zhì)量。桉樹是典型的菌根營養(yǎng)型樹種，給桉樹接種適宜的菌根菌可以提高桉樹的造林成活率、林木生產(chǎn)力和林木的營養(yǎng)成分含量。仲崇祿等的研究表明，不同地區(qū)、不同桉樹樹種接種不同菌根菌的效果不同，需要適樹適菌、適地適菌。朱天輝等對四川的藍桉進行研究，從不同郁閉度的林分中均分離出3種菌根菌，認為藍桉是菌根型樹種。譚方河等調(diào)查了四川藍桉人工林菌根菌的種類，林下僅發(fā)現(xiàn)大孢硬皮馬勃(Fr.)。然而，關(guān)于引種于云南的藍桉菌根菌在本研究檢索范圍內(nèi)尚未見報道。為此，本文從云南省昆明市呼馬山藍桉人工林中采集根際土壤：一方面，對根際土壤中的菌根真菌進行分離、鑒定與計數(shù)，調(diào)查其種類和優(yōu)勢種；另一方面，通過控制育苗基質(zhì)中菌根真菌菌群的數(shù)量來分析菌根菌對藍桉苗木生長和光合特性的影響，同時通過育苗前后基質(zhì)中菌根真菌孢子種類和數(shù)量的變化與苗木生長指標、光合指標的逐步回歸分析，探討影響藍桉苗木生長的主要菌根真菌種類。通過上述研究，旨在從菌根化育苗方面為藍桉壯苗培育提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)，同時從造林材料方面入手解決藍桉人工林經(jīng)營中地力衰退和生產(chǎn)力大幅下降的問題。

1 材料與方法

1.1 藍桉根際土采集

本研究采樣的藍桉林為26 a生藍桉人工純林，郁閉度0.7，位于云南省昆明市呼馬山，當?shù)啬昶骄鶜鉁?4.8 ℃，最高氣溫31.6 ℃，最低氣溫-7.8 ℃，年均降水量約1 000 mm，降水多集中在每年的5—9月。在藍桉林內(nèi)選取生長健壯的樣株，在其樹冠投影區(qū)內(nèi)分東、南、西、北4個方位分別采集30 cm深處的根際土和須根，混勻后裝入樣袋帶回實驗室，備用。

1.2 菌根真菌分離、鑒定與孢子計數(shù)

采用濕篩法分離菌根真菌孢子。用甘油做浮載劑，制片。在尼康YS100生物顯微鏡(日本Nikon)(400×)下觀察菌根真菌孢子，根據(jù)孢子的形態(tài)特征(大小、顏色、孢子壁的層次、厚度、孢子內(nèi)含物等)對其進行鑒定。

取土樣5 g，濕篩法分離，在Nikon SMZ1500型體視顯微鏡(日本Nikon)(10×)下計數(shù)，重復(fù)3次，并計算孢子密度。

1.3 藍桉苗木培育試驗設(shè)計

育苗地位于云南省昆明市西南林業(yè)大學苗圃。藍桉種子來源于云南省林木種苗站。

開展單因素試驗，共設(shè)計3個處理：處理1，滅菌根際土；處理2，1/2質(zhì)量的不滅菌根際土，加1/2質(zhì)量的滅菌根際土；處理3，不滅菌根際土。通過稱量，控制所有處理基質(zhì)的質(zhì)量相同。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)含30株苗木，共計270株苗木。田間布設(shè)采用隨機排列。2018年5月15日播種育苗，2019年3月15日育苗結(jié)束。

1.4 指標測定

育苗結(jié)束時，每個處理隨機取3株，挖出完整根系，沖洗掉根上的育苗基質(zhì)，將根剪成1 cm長的小段，用蒸餾水清洗數(shù)次，放入FAA固定液中24 h。隨后，先將根樣置于10%(質(zhì)量分數(shù))KOH溶液中，90 ℃水浴1 h，蒸餾水清洗數(shù)次；然后，將根樣置于10%(體積分數(shù))HO中，室溫靜置20 min以漂白、軟化根系，蒸餾水清洗數(shù)次；接著，將根樣置于1%(體積分數(shù))HCl溶液中酸化5 min，蒸餾水清洗數(shù)次；再接著，將根樣置于0.05%(質(zhì)量分數(shù))苯胺藍溶液中，90 ℃水浴35 min，染色。將染色后的根系放入乳酸甘油中浸泡，以去除多余的染色液，制片。在Nikon YS100型生物顯微鏡(日本Nikon)(400×)下觀察被染色的根段數(shù)和相關(guān)特征，計算侵染率和侵染強度。

菌根侵染率(%)=侵染的根段長/根段總長×100。

依據(jù)受侵染的根段數(shù)占觀察根段總數(shù)的比例，劃分侵染強度(共5個等級)：Ⅰ級，0～5%；Ⅱ級，6%～25%；Ⅲ級，26%～50%；Ⅳ級，51%～75%；Ⅴ級，76%～100%。

分別于苗齡5個月時(2018年10月15日)和育苗結(jié)束時(2019年3月15日)測定各處理苗木的苗高、地徑，且于育苗結(jié)束時測定各處理苗木根、莖、葉的干重。

育苗結(jié)束時，每個處理隨機取3株苗木，在每株苗木的上、中、下部分別取葉片：(1)利用Li-6800型便攜式光合作用測定系統(tǒng)(美國LI-COR)，于晴朗天氣的上午9:00—11:30測定苗木的光響應(yīng)曲線，分析苗木光合效率；(2)剪碎、混勻，備用。取0.1 g剪碎葉片，用95%(體積分數(shù))乙醇溶液浸泡24 h，利用UV-6100掃描型雙光束紫外/可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)，通過分光光度法測定葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量。

1.5 影響藍桉苗木生長和光合特性的主要菌種篩選

對育苗基質(zhì)中已鑒定出的不同真菌種類于育苗前后的孢子密度變化值和育苗結(jié)束時(10個月生)的藍桉苗木的生長指標、光合特性指標做皮爾遜(Pearson)相關(guān)性分析。依據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，進一步開展逐步回歸分析，建立回歸方程。綜合相關(guān)性分析和回歸分析，篩選對藍桉苗木生長起主導(dǎo)作用的菌種。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用Excel 2016軟件整理，在SPSS 22.0軟件中進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍桉人工林菌根真菌的種類

從藍桉根際土中共分離出3屬6種菌根真菌，其中，球囊霉屬()4種，分別為聚叢球囊霉()、何氏球囊霉()、多梗球囊霉()、摩西球囊霉()，近明球囊霉屬()1種——幼套近明球囊霉()，隔球囊霉屬()1種——縮隔球囊霉()。鑒定到的6種菌根真菌孢子的主要形態(tài)特征如圖1～圖6所示。

A，水中的孢子；B，孢子壁(L1、L2)。

A，水中的孢子、連菌孢絲(SH)；B，壓破的孢子；C，孢子壁(L1、L2)。

A，水中的孢子；B，連菌孢絲(SH)；C，孢子壁(L1)。

A，水中的孢子、連菌孢絲(SH)；B，孢子壁(L1、L2、L3)。

A，水中的孢子、連孢菌絲(SH)；B，孢子壁(L1、L2)。

A，水中的孢子、連孢菌絲(SH)；B，孢子壁(L1)。

這6種菌根真菌在藍桉須根中的侵染率均為99%，侵染強度均屬Ⅴ級，總孢子密度為104 g，其中，摩西球囊霉、聚叢球囊霉、多梗球囊霉、幼套近明球囊霉、縮隔球囊霉、何氏球囊霉的孢子密度分別為18、38、10、28、8、2 g，聚叢球囊霉的孢子密度占總孢子密度的比例達36.5%，為優(yōu)勢菌種。

2.2 不同處理下藍桉苗木的菌根侵染情況

處理1～處理3下，育苗基質(zhì)中的菌群數(shù)量增多，至育苗結(jié)束時，處理1～處理3下藍桉苗木的菌根侵染率亦相應(yīng)呈增大趨勢，且侵染強度同步增強(表1)。菌根侵染后，藍桉苗木根部形態(tài)、菌絲和泡囊如圖7所示。

a，菌根外觀形態(tài)；b，根內(nèi)菌絲(100×)；c，根內(nèi)泡囊(100×)。

表1 不同處理下藍桉苗木的菌根侵染率和侵染強度

2.3 不同處理下基質(zhì)中菌群數(shù)量的變化

對比育苗前后不同處理基質(zhì)中菌群數(shù)量的變化(表2)：處理1的基質(zhì)中在育苗前后都未觀察到菌根真菌孢子；處理2和處理3的基質(zhì)中，鑒定到的6種菌根真菌的孢子密度在育苗后均較育苗前有所增加，其中，孢子密度變化量最大的為聚叢球囊霉，其次是幼套近明球囊霉和摩西球囊霉，何氏球囊霉的變化最小。

表2 育苗前后不同處理基質(zhì)中菌根菌的孢子密度

2.4 不同處理下藍桉苗木的生長情況

苗齡5個月時，藍桉的苗高以處理2最高，處理3最低，兩者差異顯著(<0.05)，但3個處理藍桉的地徑無顯著差異(表3)。苗齡10個月時，藍桉的苗高、地徑以處理2最高，處理3最低，兩者差異顯著(<0.05)，且處理2的苗高還顯著(<0.05)高于處理1，3個處理在根干重、莖干重、葉干重上無顯著差異。綜合2個苗齡藍桉的生長情況和生物量，處理2對藍桉苗木生長具有更好的促進作用，說明向育苗基質(zhì)中接種一定數(shù)量的菌根真菌有利于促進藍桉苗木的生長，提高其生物量，但基質(zhì)中菌根真菌的接種數(shù)量也不是越多越好。

表3 不同處理對藍桉苗木生長情況和生物量的影響

不同處理下，藍桉苗木的葉綠素a、總?cè)~綠素含量和表觀量子效率隨育苗基質(zhì)中菌群數(shù)量的增多而增大，且處理3顯著(<0.05)大于其余2個處理(表4)；光補償點和光飽和點皆隨育苗基質(zhì)中菌群數(shù)量的增多而減小，且處理3和處理2皆顯著(<0.05)小于處理1。由此可見，接種一定數(shù)量的菌根真菌(處理2和處理3)有助于提高藍桉苗木的葉綠素含量，降低光補償點，提高其表觀量子效率，從而有利于苗木的生長和生物量的積累。

表4 不同處理對藍桉苗木葉綠素含量、葉面積指數(shù)和光合參數(shù)的影響

2.5 影響藍桉苗木生長和光合特性的主要菌種篩選

相關(guān)性分析結(jié)果(表5)顯示，僅聚叢球囊霉與苗高呈顯著(=0.017<0.05)正相關(guān)。僅從相關(guān)性上看，有5種菌根真菌與苗高高度相關(guān)(>0.9)；6種菌根真菌均與根干重高度相關(guān)；莖干重、葉干重和最大凈光合速率分別與1～2種菌根真菌高度相關(guān)；而地徑、表觀量子效率、暗呼吸速率、光補償點和光飽和點與這6種菌根真菌均無高度相關(guān)性。

表5 已鑒定菌種與藍桉苗木生理生化指標的相關(guān)性

取苗高、根干重和最大凈光合速率分別與已鑒定的6種菌根真菌做逐步回歸分析，結(jié)果(表6)表明：苗高與聚叢球囊霉()和縮隔球囊霉()具有顯著(<0.05)線性正相關(guān)關(guān)系，根干重與聚叢球囊霉和幼套近明球囊霉()具有顯著(<0.05)線性正相關(guān)關(guān)系，最大凈光合速率與聚叢球囊霉和幼套近明球囊霉具有顯著(<0.05)線性正相關(guān)關(guān)系，且其回歸模型的擬合度均較高(≥0.995)。綜上判斷，對藍桉苗木生長和光合作用起主要促進作用的是聚叢球囊霉、幼套近明球囊霉和縮隔球囊霉，其中，對苗高起主導(dǎo)促進作用的菌種為聚叢球囊霉，對根干重起主導(dǎo)促進作用的菌種為幼套近明球囊霉，對最大凈光合速率起主導(dǎo)促進作用的菌種為聚叢球囊霉和幼套近明球囊霉。

表6 已鑒定菌種與藍桉苗木生長指標以及光合特性的逐步回歸分析

3 討論

鑒于藍桉的生態(tài)學特性，我國僅在云南和四川有引種栽培。本研究從云南昆明的藍桉人工林根際土中分離出3屬6種菌根真菌，分別是幼套近明球囊霉、縮隔球囊霉、摩西球囊霉、多梗球囊霉、聚叢球囊霉和何氏球囊霉。朱天輝等從四川不同郁閉度的藍桉林分中均分離出幼套近明球囊霉、摩西球囊霉和縮隔球囊霉，在郁閉度0.7以上的林分中分離出聚叢球囊霉。多梗球囊霉和何氏球囊霉在以往的關(guān)于桉樹菌根菌的分離研究中未見報道，但在云南的西南樺等植物根際土，以及干熱河谷生境土壤的菌根菌調(diào)查中有相關(guān)報道。由此推測，這2種菌根菌的分布可能與云南的地理環(huán)境，尤其是土壤環(huán)境關(guān)系密切。結(jié)合云南和四川兩地藍桉人工林根際土中菌根菌的調(diào)查結(jié)果，認為幼套近明球囊霉、摩西球囊霉和縮隔球囊霉為藍桉固有的菌根真菌；聚叢球囊霉僅出現(xiàn)在郁閉度較大的藍桉林分中，且為優(yōu)勢菌群；多梗球囊霉和何氏球囊霉為藍桉在云南栽培區(qū)的特有菌根真菌。

苗齡10個月時，隨著育苗基質(zhì)中菌群數(shù)量的增多，藍桉苗木的菌根侵染率增大，侵染強度增強；同時基質(zhì)中6種菌根真菌孢子數(shù)量的增加幅度皆以育苗前基質(zhì)中的孢子數(shù)量為基礎(chǔ)，初始數(shù)量多的，后期增量大。綜合5個月和10個月2個苗齡藍桉苗木的生長(苗高和地徑)情況來看，處理2對藍桉苗木生長具有更好的促進作用，說明育苗基質(zhì)中，接種一定數(shù)量的菌根真菌有利于促進藍桉苗木的生長。本研究結(jié)果與仲崇祿等對尾葉桉和巨尾桉苗木接種菌根真菌，以及劉建福等對澳洲堅果幼苗接種菌根真菌的效果一致。與處理1相比，處理3可顯著提高藍桉的葉綠素a和總?cè)~綠素含量、表觀量子效率，顯著降低光補償點和光飽和點，說明向育苗基質(zhì)中接種一定數(shù)量的菌根真菌有利于藍桉苗木光合產(chǎn)物的合成與積累。這與朱凌駿等和常雙雙等報道的菌根真菌對櫸樹和君遷子光合特性的影響一致。本研究發(fā)現(xiàn)，對藍桉苗木生長和光合作用起主要促進作用的是聚叢球囊霉、幼套近明球囊霉和縮隔球囊霉。主導(dǎo)菌種的篩選研究，可為藍桉苗木培育提供接菌種類的指導(dǎo)。

針對本文分離鑒定出的6種菌根真菌，作者團隊已利用三葉草開展單孢擴繁，但由于時間原因，目前還未獲得足夠數(shù)量的純化菌種。這在一定程度上限制了我們就這些菌根真菌對藍桉苗木生長影響機制的進一步深入研究。后期，可在本文研究基礎(chǔ)上，在育苗時接種對藍桉苗木生長起主導(dǎo)促進作用的純化菌種，深入探討菌根真菌對藍桉苗木生長的促進機制，從而為藍桉的壯苗培育提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)，為藍桉人工林的可持續(xù)發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)苗木材料。