大豆異黃酮干預肥胖大鼠肝氧化應激及炎癥反應

熊昕宜，許澤玉，何念佳，何俊博，陳正禮，黃 超，劉文濤，羅啟慧

(四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院， 動物疾病模型實驗室， 四川 成都 611130)

肥胖癥(obesity)是機體內脂肪堆積過多體重超常的一種慢性疾病。脂肪堆積所造成的組織功能障礙會導致許多代謝綜合征，包括Ⅱ型糖尿病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和心血管疾病等等。目前全球超重和肥胖人數(shù)已達21億，可以說肥胖已成為全球亟需解決的公共衛(wèi)生問題。肝臟作為體內重要的新陳代謝的器官，脂質的過量沉積會導致肝細胞發(fā)生氧化應激、脂質過氧化和炎癥反應等，引起肝臟細胞凋亡，從而導致肝功能紊亂。具體而言，肥胖一方面可通過損傷線粒體功能，導致活性氧(ROS)和直至過氧化的產生從而導致肝細胞的氧化應激。另一方面，高脂飲食所致的肥胖還會引起慢性低度無菌炎癥或代謝組織炎癥。而氧化應激與炎癥反應是許多肝臟疾病的發(fā)病機理和關鍵因素。大豆異黃酮是一種從大豆中提取的天然化合物，主要存在于大豆胚軸中，在大豆生長過程中的次級代謝產生，具有雌激素活性，故又稱植物激素。研究表明，大豆異黃酮有多種生理功能，其中包括抗氧化、廣泛抗炎、降脂等作用。SIF的抗氧化作用主要表現(xiàn)在抑制氧自由基產生、抑制過氧化氫生成、減少DNA氧化損傷以及抑制脂質過氧化，此外SIF還可以提高機體超氧化物歧化酶的生物學功能等等。然而SIF對于肥胖情況下肝臟的氧化應激以及炎癥反應的影響，尤其是不同劑量下的影響還鮮有報道。因此本試驗旨在探討不同劑量大豆異黃酮對肥胖大鼠肝臟氧化應激狀態(tài)及炎癥反應的干預，以期為大豆異黃酮的對肥胖的干預機制提供理論依據(jù)，同時為大豆異黃酮進一步的應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

5周齡健康SD雄性大鼠80只，購自四川省成都市達碩生物科技有限公司，使用許可證號：SCXK(川)2015-030。

1.1.2 試驗物品及試劑

試驗大鼠專用飼料和墊料，購自四川省成都市達碩生物有限公司；高脂日糧(基礎飼料69.5%、豬油15%、蔗糖15%、豬膽鹽 0.5%)，購自四川普萊美生物科技有限公司；大豆異黃酮，產品批號：NF-20170127，購自西安天豐生物有限公司，純度為90%。SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒，購自南京建成科技有限公司；SYBR Premix ExTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)，購自寶生物技術(北京)公司；RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒(DP431)，購自天根生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物模型建立和處理

80只大鼠隨機分為普通組(=16)和肥胖組(=64)，分別飼喂基礎飼料和高脂飼料9周，每周稱量大鼠體重，每天觀察記錄大鼠體況。第9周末采血檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。若肥胖組大鼠體重超過普通組的20%，血脂含量明顯高于普通組則肥胖模型建立成功。

建模成功后，將肥胖大鼠按劑量(0、150、300、450 mg·kg)SIF隨機分為肥胖對照組(F組，=16)、低劑量組(L組，=16)、中劑量組(M組，=16)和高劑量組(H組，=16)，普通對照組(C組，=16)灌喂0.5%羧甲基纖維素鈉2 mL·kg。SIF用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解。SIF灌喂4周，每周末稱量體重。第13周末，禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(4 mL·kg)麻醉，無菌采集肝臟組織，一部分于4%多聚甲醛中固定，一部分存放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。實驗中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物福利符合“美國國家衛(wèi)生研究院實驗室動物飼養(yǎng)管理和使用指南(The National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)的要求。本實驗由四川農業(yè)大學倫理委員會批準。

1.2.2 肝臟組織病理學觀察

將多聚甲醛中固定的肝臟組織樣本流水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(4 μm)，進行蘇木精-伊紅染色(HE)，光鏡觀察組織學變化。

1.2.3 肝臟組織SOD、GSH-Px、CAT水平檢測

準確稱取組織質量(0.5±0.05)g，按照組織質量(g)與生理鹽水體積(mL)質量體積比1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，剪碎組織塊，冰水浴制備勻漿，2 500～3 000 r·min，離心10 min，取10%勻漿上清液待用。

根據(jù)試劑盒方法步驟檢測各組大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.2.4 肝臟組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平檢測

取適量肝臟組織研磨成勻漿，用總RNA提取試劑盒提取肝臟組織RNA，收集RNA溶液。提取出的RNA可于-80 ℃保存。采用PCR儀將肝臟勻漿中提取出來的RNA溶液反轉錄出cDNA。采用熒光定量PCR儀擴增cDNA。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，65 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)；擴增循環(huán)結束后，降溫至65 ℃，然后加熱升溫至95 ℃變性DNA產物。讀取每個樣本的C值，采用相對定量法，以-mRNA表達量為內參，用Bio-Rad CFX Manager 軟件分析所得數(shù)據(jù)。各基因上下游引物參考自徐兆坤等。

1.3 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示(±SD)，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 高脂肥胖及大豆異黃酮干預大鼠體重及血脂水平變化

飼喂高脂日糧4周后，兩組大鼠體重呈現(xiàn)顯著差異(<0.05)，此后差異愈加明顯，到第9周時，高脂組大鼠體重極顯著高于普通組(<0.01)，達到了超過20%體重的肥胖標準(圖1-A)。第9周高脂日糧組大鼠血清中 TC、TG、LDL 水平均顯著高于普通組(<0.05或<0.01)(圖1-C)?？梢?，高脂日糧飼喂 9 周后，成功建立食源性肥胖大鼠模型。SIF干預4周后，各組大鼠體重持續(xù)增長，SIF干預前、后，高脂組大鼠體重增加最多，與SIF干預組相比差異顯著(圖1-B)。SIF干預期間，肥胖組血清中 TC、TG 和 LDL含量顯著高于普通組，SIF干預高劑量組血清中TC和 LDL含量明顯低于肥胖組(圖1-D)。

TG，甘油三酯；TC，總膽固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度酯蛋白。*，**分別表示不同處理組間差異達顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。下同。

2.2 大豆異黃酮干預逆轉肥胖致大鼠肝組織損傷

肝臟組織形態(tài)學結構觀察發(fā)現(xiàn)，C組大鼠肝臟結構、肝細胞形態(tài)均未見異常病理變化(圖2-A)。F組大鼠肝臟肝細胞呈現(xiàn)彌漫性重度脂肪變性伴炎性細胞浸潤，肝細胞腫脹，肝索排列紊亂(圖2-B)。L組大鼠肝臟病變較F組有輕微改善，但仍可見上述病變(圖2-C)。M組大鼠肝臟病變明顯改善，未見明顯異常病理變化(圖2-D)。H組小鼠肝臟可見局灶性肝細胞脂肪變性和肝索紊亂，但較F組和L組輕微(圖2-E)。

A， 空白對照組；B，肥胖對照組；C，低劑量組；D，中劑量組；E，高劑量組。

2.3 大豆異黃酮干預改善了肥胖大鼠肝臟氧化應激

大豆異黃酮干預后，肝臟的抗氧化指標檢測結果詳見表1。與C組相比，F(xiàn)組肝臟SOD、CAT和GSH-Px水平顯著降低(<0.05)。與F組相比，SIF各劑量組SOD、CAT和GSH-Px水平均顯著升高，并呈現(xiàn)劑量依賴效應?？梢姡琒IF干預改善了肥胖大鼠肝臟的氧化應激。

表1 大豆異黃酮干預改善了肥胖大鼠肝臟氧化應激

2.4 大豆異黃酮干預下調肥胖大鼠肝臟炎癥反應

通過檢測肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA表達量均顯著高于C組。不同劑量SIF干預后，各劑量組肝臟中IL-1β mRNA表達量不同程度的降低，高劑量組達到了顯著水平；IL-6 mRNA表達量呈劑量依賴性降低，中劑量組和高劑量組達到顯著水平；TNF-α mRNA在各劑量組的表達均顯著下調，高劑量組恢復到C組水平(圖3)。可見，SIF干預下調了肥胖大鼠肝臟的炎癥反應。

圖3 大豆異黃酮干預下調肥胖大鼠肝臟炎癥反應

3 討論

本實驗結果表明，高脂飲食引起的肥胖導致大鼠肝臟組織病理學損傷，大豆異黃酮干預后各劑量組較肥胖對照組有明顯改善，尤其在中劑量組水平更為明顯，高劑量組的肝組織損傷恢復不如中劑量組。因此，適當劑量的大豆異黃酮對食源性肥胖大鼠的肝臟損傷干預是需要考慮并進一步研究的。

氧化應激(oxidative stress，OS)是指機體氧化與抗氧化系統(tǒng)失調，引起過量的活性氧類(reactive oxygen species，ROS)在機體內蓄積，從而導致分子、細胞、組織氧化損傷的病理過程，現(xiàn)有研究指出高脂飲食可導致氧化應激。SOD和CAT是體內重要的抗氧化酶，也是細胞抵御氧化損傷的第一道防線；GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。當氧化脂質的負擔過大時，往往會導致抗氧化酶合成減少。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖組SOD、CAT和GSH-Px水平明顯降低，由此推測是由于肝臟自由基的堆積所導致的抗氧化酶SOD和CAT的消耗。與此同時，當自由基大量增加時，CAT與GSH-Px 共同作用以降解大量堆積的過氧化氫和脂類過氧化物。二者的共同作用導致了肥胖組SOD、CAT和GSH-Px水平降低。而大豆異黃酮具有較強的還原性，且對小鼠肝臟的損傷與其抗氧化作用相關。本文發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮干預后，大鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px水平升高，表明大豆異黃酮干預改善了肥胖大鼠肝臟的氧化應激。

肥胖可誘導一種全身性的慢性低度炎癥反應，慢性炎癥區(qū)別于傳統(tǒng)炎癥，并不出現(xiàn)“紅、腫、熱、痛”的癥狀，而是血液中促炎癥因子含量明顯增加，如 TNF-α、IL-1β、IL-6等。從本文的結果看，長期高脂飲食促發(fā)了大鼠肝臟炎癥反應，使肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達水平升高，肥胖組大鼠肝臟細胞呈現(xiàn)不同程度的脂肪浸潤和炎性浸潤。已有研究結果表明，通過合理飲食、吸脂術等方式使脂肪含量降低時可使多種炎癥因子含量降低。結合本研究中不同濃度大豆異黃酮干預后各炎癥因子表達量不同程度下降的結果，推測肥胖導致促炎因子分泌增多，大豆異黃酮可通過減少促炎細胞因子的表達來降低高脂肥胖大鼠肝臟炎癥。

綜上所述，高脂飲食引起的肥胖會導致大鼠肝臟組織病理學損傷、氧化應激反應和炎癥反應，大豆異黃酮可通過增強SOD、GSH-Px、CAT活力，抑制促炎癥因子的表達，來逆轉肥胖導致的大鼠肝組織損傷，高劑量組效果最為明顯。