基于“腎生髓，髓養(yǎng)骨”理論的補腎藥膳方對成骨細胞Runx2、Col-Ⅰ、MGP的影響研究

梁百慧　譚小寧　成金林　林靜　陳燕

〔摘要〕 目的 探討補腎藥膳方對成骨細胞Runx2、Col-Ⅰ、MGP的影響。方法 30只大鼠隨機分為兩組，每組15只。一組予以生理鹽水灌胃干預7 d，另一組予以同劑量補腎藥膳方灌胃干預7 d;分別提取兩組大鼠血清，將血清分別與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）共同培養(yǎng)，生理鹽水大鼠血清培養(yǎng)為對照組，補腎藥膳方大鼠血清培養(yǎng)為實驗組，分別提取外泌體，并加入成骨細胞中。采用Western blot法檢測兩組成骨相關(guān)蛋白表達量，利用RT-qPCR法檢測成骨相關(guān)基因的表達。結(jié)果 與對照組比較，實驗組BMSCs分泌外泌體增加（P<0.01），miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p表達量升高（P<0.05），Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白及mRNA表達量均增多（P<0.01）。結(jié)論 補腎藥膳方可能通過促進BMSCs分泌成骨相關(guān)miRNA及更多成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)因子，促進成骨細胞成骨分化。

〔關(guān)鍵詞〕 補腎藥膳方;成骨細胞;骨髓間充質(zhì)干細胞;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥;外泌體

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.015

Study on the effect of reinforcing kidney medicinal diet on osteoblast Runx2， Col-Ⅰ， MGP based on the theory of "kidney producing marrow， marrow nourishing bone"

LIANG Baihui TAN Xiaoning CHENG Jinlin LIN Jing CHEN Yan

（1. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Changsha， Hunan 410006， China; 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of reinforcing kidney medicinal diet on Runx2， Col-Ⅰ， MGP of osteoblasts. Methods Thirty rats were randomly divided into two groups， 15 rats in each group. One group was given normal saline gavage for 7 days， and the other group was given the same dose of reinforcing kidney medicinal diet for 7 days; serum was extracted from the two groups of rats， and the serum was co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）. The normal saline rat serum culture group was the control group， and the reinforcing kidney medicinal diet rat serum culture group was the experimental group， and exosomes were extracted respectively， and added to osteoblasts. Western blot was used to detect the expression of osteogenic-related proteins of the two groups， and RT-qPCR was used to detect the expression of osteogenic-related genes. Results Compared with the control group， the secretion of exosome of BMSCs in the experimental group was increased （P<0.01）; the expression levels of miR-26a-3p， miR-218-3p and miR-199b-3p in the experimental group were higher （P<0.05）; the protein expression levels of Runx2， Col-Ⅰ， and MGP and the mRNA expression levels of Runx2， Col-Ⅰ and MGP were higher （P<0.01）. Conclusion Reinforcing kidney medicinal diet can promote the osteogenic differentiation of osteoblasts by promoting BMSCs to secrete osteogenic-related miRNA and more osteogenic transformation-related factors.879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8

〔Keywords〕 reinforcing kidney medicinal diet; osteoblasts; bone marrow mesenchymal stem cells; postmenopausal osteo-porosis; exosome

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP）又稱“Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥”，以絕經(jīng)后全身性骨量減少及骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，是危及中老年婦女健康的常見疾病。資料顯示，在我國50歲以上人群中，女性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率達20.7%，男性達14.4%[1]。骨質(zhì)疏松癥一旦發(fā)生，受到輕微外力即可引發(fā)骨折，從而嚴重影響老年人生活質(zhì)量，難以逆轉(zhuǎn)，加強預防則能更有效地降低骨折的發(fā)生率。近年來，研究[2-3]認為骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）是骨再生的種子細胞，在骨穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。BMSCs的分泌因子并不能定向輸送到病灶，只有BMSCs分泌的外泌體具有定向輸送功能，并能夠促進成骨細胞的增殖與分化。Liu等[4]在進行BMSCs移植研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Rab27a/b表達后（外泌體釋放減少），可抑制體外BMSCs的成骨分化作用，而在培養(yǎng)體系中補充BMSCs來源的外泌體則可以促進細胞的成骨分化作用。表明BMSCs源性的外泌體能夠促進骨代謝和骨形成[5-6]。

基于中醫(yī)藥食同源理論，藥膳以其“寓醫(yī)于食”的優(yōu)勢，在老年疾病防治、養(yǎng)生康復領(lǐng)域上有著一定的優(yōu)勢，已成為防控老年人常見病的應用熱點，如老年糖尿病[7]、老年功能性消化不良[8]、老年高血壓和高血脂[9]，其中包括PMOP。而藥膳的作用機制研究極少，探索其作用機制，可為PMOP的防治提供理論依據(jù)[10]。本文對課題組前期防治PMOP的補腎藥膳方[11]（狗肉200 g，羊腎150 g，山藥30 g，枸杞子30 g）進行研究，其中狗肉為君藥，有溫腎壯陽的功效，羊腎為臣藥，有補腎益精的功效，山藥、枸杞子為使藥，有養(yǎng)肝益腎的功效，全方可補腎強骨生髓。前期研究證明，補腎藥膳方能促進BMSCs外泌體的分泌，改善PMOP模型大鼠骨代謝水平、骨結(jié)構(gòu)，促進骨形成[12]，本文旨在通過觀察補腎藥膳方干預下BMSCs釋放的外泌體對成骨細胞的成骨分化作用，深入了解補腎藥膳方干預成骨過程的潛在機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料與細胞培養(yǎng)

大鼠BMSCs（貨號：CP-R131）、大鼠成骨細胞（貨號：CP-R091）均購于武漢普諾賽生命科技有限公司;MSC完全培養(yǎng)基（美國ATCC公司，貨號：PCS-500-030）;ES級FBS（美國GIBCO公司，貨號：12664025C）;FGF2（貨號：233-FB-025）、rhIGF-1（貨號：291-G1-200）均購自美國R&D公司;CD63（貨號：Ab134045）、TSG101（貨號：Ab125011）、ALIX（貨號：Ab275377）、Calnexin（貨號：Ab92573）、Runx2（貨號：Ab192256）、Col-Ⅰ（貨號：Ab299450）、MGP（貨號：Ab224367）均購于英國Abcam公司。

BMSCs培養(yǎng)條件為：含10% FBS的MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加FGF2和rhIGF-1，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。匯合率達80%左右，0.25%胰酶消化細胞成單個細胞懸液，1∶2進行傳代培養(yǎng)。

成骨細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。匯合率達80%左右，0.25%胰酶消化細胞成單個細胞懸液，1∶2進行傳代培養(yǎng)。

1.2? 實驗動物

從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（湘）2019-0004購買SPF級SD大鼠30只（4～5月齡），體質(zhì)量為200～220 g，大鼠質(zhì)量由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司檢測。大鼠由湖南省中醫(yī)藥研究院[許可證號：SYXK（湘）：2020-0008]專業(yè)人員統(tǒng)一管理飼養(yǎng)，其環(huán)境符合衛(wèi)生建議標準。大鼠平均分6籠，保證室溫22～25 ℃，濕度50%～70%，光照周期12 h/12 h，飼以標準大鼠顆粒飼料，常規(guī)自由攝食及飲水，定期清洗籠舍并更換墊料。

1.3? 試驗藥物及給藥方案

補腎藥膳方是課題組前期確定的防治PMOP的藥膳方，由狗肉200 g、羊腎150 g、山藥30 g、枸杞子30 g組成，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院提供。將補腎藥膳方中的食材清洗干凈后放入砂鍋，加水2 L，先用武火煮沸，再改文火煎煮1 h，取湯汁，加水再煮一次，兩次煎煮湯汁需濃縮至100 mL，湯汁藥膳含量為4.1 g/mL，將湯汁冷卻后，放置于冰箱冷凍備用。用藥劑量為人體給藥劑量的6倍，大鼠的給藥劑量為41 g/（kg·d），折算標準體質(zhì)量大鼠的給藥劑量為8.2 g/d。

30只大鼠適應性飼養(yǎng)1周進入實驗狀態(tài)，隨機分為兩組，一組在飼料飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上用生理鹽水灌胃，另一組用補腎藥膳方灌胃。給藥方法均為每日上午灌胃一次，每次2 mL，連續(xù)7 d。各組大鼠均自由飲食、水。動物實驗獲得湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院倫理委員會的同意。

1.4? 主要儀器

透射電鏡（型號：H-7650，日立高新技術(shù)有限公司）;顆粒電位滴定及粒度分析儀（型號：ZETAVIEW，德國PMX公司）;電泳儀電源（型號：DYY-7C）、雙垂直電泳儀（型號：DYCZ-24DN）均購自北京六一生物科技有限公司;酶標儀（型號：ELX800，美國博騰儀器有限公司）;PCR儀[型號：ABI7500，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]。

1.5? 含藥血清的制備879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8

實驗大鼠在最后一次灌胃后，禁食24 h，處死后立即取材。腹主動脈取血，將每只大鼠的血液分別移入無菌離心管，并于4 ℃保鮮冰箱內(nèi)靜置2 h，3000 r/min，離心半徑10 cm，離心20 min，吸取上層血清，同組含藥血清合并。含藥血清經(jīng)56 ℃水浴30 min滅活，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6? 實驗分組

分為實驗組和對照組。實驗組采用補腎藥膳方灌胃大鼠血清，對照組采用生理鹽水灌胃大鼠血清，超速離心去除外泌體后分別培養(yǎng)BMSCs，收集BMSCs的外泌體后處理成骨細胞。

1.7? 外泌體的鑒定

（1）電鏡檢測。取10 μL外泌體溶液在透射電鏡下觀察，并與80 kV成像。（2）粒徑檢測。使用粒子矩陣ZetaView PMX 11計算外泌體濃度，用PBS稀釋外泌體并對其大小及質(zhì)量進行測定，并分析粒子運動軌跡。（3）BCA檢測。通過測量外泌體吸光值，計算出蛋白濃度。（4）Western blot法檢測外泌體膜表面標志性蛋白CD63、TSG101、ALIX、Calnexin，稀釋比例均為1∶1000。

1.8? 外泌體miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p相對表達量檢測

取上述經(jīng)過提取的BMSCs外泌體，采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，后行RNA質(zhì)量檢測，采用Reverse Transcriptase M-MLV進行cDNA反轉(zhuǎn)錄后，進行RT-qPCR反應分析miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p的表達情況。目的基因引物序列見表1。

1.9? 成骨細胞Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白表達量及mRNA表達量檢測

取上述經(jīng)過提取的BMSCs外泌體，并分別將其與成骨細胞共培養(yǎng)12 d。取處理后的兩組成骨細胞，一部分用于提取蛋白，對兩組行Western blot檢測。用RIPA細胞裂解液裂解細胞，獲得細胞內(nèi)總蛋白，通過免疫電泳檢測成骨細胞中Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白含量。另一部分細胞用于提取RNA，行RT-qPCR檢測。采用TRNzol總RNA提取試劑提取細胞內(nèi)的總RNA，通過RT-qPCR定量檢測Runx2、Col-Ⅰ、MGP mRNA表達量。目的基因引物序列見表2。

1.10? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，滿足正態(tài)性、方差齊性的采用獨立樣本t檢驗;對于不服從正態(tài)分布的計量資料，兩組比較采用Mann-Whitney檢驗。P<0.05 表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 外泌體鑒定

所提取的外泌體粒徑大小約為100 nm（圖1），電鏡下可見，外泌體形態(tài)均勻，標準形態(tài)清晰，為杯狀脂質(zhì)雙分子層膜微小囊泡（圖2）。所提取的外泌體中可見陽性蛋白標志物ALIX、TSG101、CD63的表達，Calnexin無表達（圖3）。外泌體蛋白濃度為45.85 ng/μL（表3）。

2.2? 補腎藥膳方對BMSCs細胞分泌外泌體量的影響

實驗組BMSCs細胞外泌體的釋放啟動因子Rab27a/b、ISG15蛋白表達量高于對照組（P<0.01）（圖4），說明補腎藥膳方能促進BMSCs細胞分泌外泌體。

2.3? 補腎藥膳方對BMSCs細胞分泌外泌體中成骨分化相關(guān)miRNA的影響

外泌體樣本中miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p均有表達，實驗組中的miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p表達量高于對照組（P<0.05）。詳見表4。

2.4? 補腎藥膳方對成骨細胞成骨分化的影響

與對照組相比，實驗組Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白表達量及Runx2、Col-Ⅰ、MGP mRNA表達量均增多（P<0.01）。詳見圖5-6。

3 討論

中醫(yī)將PMOP歸屬于“骨痿”“骨痹”范疇，《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義·五臟所主》云：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”，認為PMOP以腎虛型多見，腎精漸衰，骨髓生化無源，不能充養(yǎng)骨骼而致骨髓空虛，導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，提示腎與骨髓和骨質(zhì)疏松癥有著極其密切的關(guān)系。

腎為先天之本，腎藏精?！鹅`樞·決氣》曰：“兩神相搏，合而成形，常先身生，是謂精。”由此可知，“先天”是指稟受于父母的“兩神相搏”之精，即胚胎，胚胎為腎所藏的先天之精。胚胎分化出人體各組織器官的干細胞（包括BMSCs），BMSCs主要來自于骨髓，在特定環(huán)境下向成骨細胞轉(zhuǎn)化，即實現(xiàn)髓養(yǎng)骨，與中醫(yī)理論“腎精生髓養(yǎng)骨”高度吻合，故認為中醫(yī)理論的“髓”與BMSCs二者同源同功[13]。前期有許多研究證明，補腎藥物對BMSCs的增殖和成骨分化都有促進作用，也驗證了腎、髓、骨之間的關(guān)聯(lián)[14-16]。藥膳是中醫(yī)學術(shù)與飲食文化相結(jié)合的產(chǎn)物，流傳悠久，“寓醫(yī)于食”，接受程度高，因此，將補腎藥膳與BMSCs外泌體相結(jié)合，研究其對成骨細胞成骨分化的機制，對于骨質(zhì)疏松癥患者的治療意義重大。

BMSCs具有很強的更新能力，可刺激相關(guān)組織再生，是可向成骨細胞轉(zhuǎn)化的干細胞，有臨床研究證明，BMSCs可加速改善骨質(zhì)疏松癥患者臨床癥狀，推動骨再生[17]。外泌體是直徑30～100 nm的由內(nèi)涵體與質(zhì)膜融合后分泌到細胞外環(huán)境的囊泡，內(nèi)部包裹著豐富的蛋白質(zhì)、RNA等生物活性分子，可以激活下游的、遠程的信號分子，被認為是細胞與周圍靶細胞間信息交流的重要“內(nèi)分泌”物質(zhì)[18]。Rab家族是一種小GTP酶蛋白，控制著細胞內(nèi)囊泡的移動、定位等，Rab27a/b是外泌體釋放的啟動因子，控制外泌體分泌、移動[19]。879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8

本研究中，通過補腎藥膳方灌胃大鼠血清、生理鹽水灌胃大鼠血清對BMSCs進行干預，跟蹤觀察兩組產(chǎn)生的外泌體，發(fā)現(xiàn)實驗組釋放的啟動因子Rab27a/b、ISG15蛋白表達量比對照組多（P<0.01），提示補腎藥膳方可促使BMSCs分泌外泌體增加。

miRNA是基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在骨形成中發(fā)揮重要作用，可加快人體骨重建進程[12]。郝靜等[20]研究證明外泌體miRNA對骨代謝具有積極作用。成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的活化是成骨細胞開始分化的標志，高表達Runx2能促進新生成骨細胞的分泌和成熟，并能調(diào)節(jié)多種成骨細胞增殖分化特異性標志物的表達。目前，已發(fā)現(xiàn)多個miRNAs調(diào)控Runx2在成骨細胞分化過程中發(fā)揮重要作用，外泌體攜帶并轉(zhuǎn)送miRNAs至成骨細胞，有miR-124-3p、miR-590、miR-122-5p，參與成骨分化的調(diào)節(jié)，促進骨形成[21-23]。因此，探究如何促進BMSCs分泌更多含有成骨相關(guān)miRNAs的外泌體，促進成骨細胞的成骨分化，可為促進骨再生、修復骨缺損的骨質(zhì)疏松癥治療提供參考。

本研究中，實驗組miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p表達量高于對照組;實驗組與對照組相比，Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白與mRNA表達量增多（P<0.01）。這提示了補腎藥膳方可促進BMSCs外泌體中成骨相關(guān)miRNA的產(chǎn)生，并在成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的產(chǎn)生中發(fā)揮著積極作用。補腎藥膳方可通過促進BMSCs分泌成骨相關(guān)miRNA及更多成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)因子，促進成骨細胞成骨分化。

間充質(zhì)干細胞被認為是骨再生的種子細胞，可促進成骨再生。本實驗研究補腎藥膳方對成骨細胞成骨分化的影響及其機制，實驗結(jié)果表明，補腎藥膳方可增加ISG 15、Rab27a/b蛋白表達量，促進BMSCs外泌體的分泌，外泌體可能攜帶miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p等miRNAs增加成骨細胞中Runx2、Col-Ⅰ、MGP表達，調(diào)控成骨信號、促進成骨分化?？梢娢磥砜蓪⑼饷隗w作為切入點，更全面地研究中醫(yī)藥膳治療PMOP的機制。

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（本文編輯? 周? 旦）879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8