農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及微流控技術(shù)在農(nóng)殘快檢中的應(yīng)用前景

許晶冰，蔡靈利

摘要 現(xiàn)階段，農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)應(yīng)用最廣泛的是酶抑制率法，此法在市場監(jiān)管的基層執(zhí)法中應(yīng)用最多，但其先天存在很多不足，也使其使用效果大打折扣。而膠體金免疫層析法的優(yōu)勢雖然在于定性能力強(qiáng)、檢出限更低，但其成本較高且只能做單一農(nóng)藥殘留，在基層應(yīng)用中效率太低從而未被廣泛應(yīng)用。微流控技術(shù)可以結(jié)合酶抑制率法的優(yōu)勢，在短時間內(nèi)完成全自動檢測，具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥殘留;酶抑制率法;膠體金免疫層析;微流控

中圖分類號：S481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2095–3305（2022）03–0161–03

調(diào)查表明，農(nóng)藥殘留問題與我國大約40%食品安全事件相關(guān)，是民眾最為關(guān)心的問題。近年來，食品安全快速檢測逐漸普及和推廣應(yīng)用。據(jù)食品藥品監(jiān)督管理部門發(fā)布的抽檢監(jiān)測數(shù)據(jù)，2020年，重慶市食品安全監(jiān)管部門共完成食品安全監(jiān)督快速檢測9萬余批次，其中食用農(nóng)產(chǎn)品抽查是食品安全日常監(jiān)管的重中之重，食用農(nóng)產(chǎn)品數(shù)量為4.7萬批次，占比約54%，快速檢測抽檢項目主要是農(nóng)藥殘留。目前，用于農(nóng)藥殘留快速檢測的技術(shù)主要是2類：一類是基于國家快檢標(biāo)準(zhǔn)酶抑制率法的相關(guān)試劑盒，一類是基于膠體金免疫層析技術(shù)的膠體金試紙條產(chǎn)品。

1 酶抑制率法

酶抑制率法是利用有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用這一特點(diǎn)，在加入一定量酶反應(yīng)底物和膽堿酯酶的條件下，進(jìn)行催化反應(yīng)，通過底物被酶催化反應(yīng)的程度來判斷樣品中是否含有高劑量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

1.1 紙片法

紙片法是基于酶抑制率法原理設(shè)計的快速檢測樣品中農(nóng)藥殘留的方法，其利用膽堿酯酶能夠催化紅色的靛酚乙酸酯水解為藍(lán)色的靛酚這一顯色特性，將膽堿酯酶和靛酚乙酸酯固化在紙片上，加入樣品提取液后，在37℃的條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，通過觀察紙片的顏色變化來判定樣品中是否含有高劑量農(nóng)藥。

使用此法檢測樣品中農(nóng)藥殘留的成本最低，且操作簡便，但其不足之處在于對于顯色情況的判定只能依靠檢測人員的經(jīng)驗(yàn)，如果樣品本身有顏色，也會干擾檢測人員對結(jié)果的判定。因此，在實(shí)際的監(jiān)管中，應(yīng)用存在很大局限性。

1.2 分光光度法

分光光度法是利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能的抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，抑制率與農(nóng)藥的含量呈正相關(guān)這一特性，在反應(yīng)體系中加入膽堿酯酶、乙酰膽堿及能與乙酰膽堿的水解產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑，在特定波長下測定吸光度隨時間的變化情況，計算出抑制率，通過抑制率可判斷出樣品中是否含有高劑量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥。因此，此法也叫酶抑制率法。

酶抑制率法是目前應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥殘留快速檢測方法，被用于農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、商超和基層監(jiān)管部門的快檢實(shí)驗(yàn)室中。其最大優(yōu)勢在于檢測成本低，單個樣品檢測成本低于1元，并且實(shí)驗(yàn)操作過程相對簡單，對于檢測人員的專業(yè)要求不高。

1.3 酶抑制率法存在的不足

第一，樣品中的物質(zhì)對膽堿酯酶活性的影響：影響膽堿酯酶活性的因素是多方面的，而某些特殊樣品如香辛料類、洋蔥等樣品中的物質(zhì)亦會抑制酶活性，從而造成假陽性的結(jié)果。第二，樣品的顏色對檢測結(jié)果的影響：不管是紙片法還是分光光度法，均是通過觀察顏色變化來讀取檢測結(jié)果，樣品中若含有可溶于提取液的色素，則會對檢測結(jié)果造成干擾。第三，方法原理的局限性：該方法無法對樣品中的農(nóng)藥進(jìn)行定性，即使檢出陽性結(jié)果，也不知道樣品中具體是什么農(nóng)藥。第四，方法未考慮多種農(nóng)藥的交互疊加作用：該方法結(jié)果判定成立的背景是假設(shè)樣品中僅含有單一農(nóng)藥，但實(shí)際情況是多種農(nóng)藥的混合使用，而該方法沒有考慮多種農(nóng)藥的疊加效應(yīng)（即可能樣品中含有4～5種農(nóng)藥，但均未超過限量標(biāo)準(zhǔn)），從而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

1.4 酶抑制率法方法優(yōu)化研究現(xiàn)狀與分析

酶抑制率法已編入衛(wèi)生部頒發(fā)的國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測》（GB/T 5009.199—2003）中，該方法較成熟，近年來國內(nèi)外相關(guān)研究主要是在反應(yīng)條件及方法學(xué)上進(jìn)行優(yōu)化。楊建平[1]研究發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿酯酶在37℃、pH值7.8～8.0時表現(xiàn)出最大活力，適當(dāng)延長反應(yīng)放置時間，可以提高檢測的靈敏度。鐘樹明等[2]研究發(fā)現(xiàn)，用前處理小柱對樣品進(jìn)行預(yù)處理，可去除葉綠素的干擾、提高檢測靈敏度，提高抑制率閾值15%。李順等[3]通過正交試驗(yàn)和極差分析得出，酶抑制率法最佳檢測條件為抑制時間15 min、抑制溫度35℃、底物加入量100 μL、酶液加入量100 μL。楊東鵬等[4]提出了新的最適條件確定標(biāo)準(zhǔn)，即保證酶的活性保持在一定水平的基礎(chǔ)上，選擇抑制率（以甲胺磷為抑制劑）最高時的溫度47.0℃、pH值7.7和抑制時間10 min為最適條件。

2 膠體金免疫層析法

目前，大多數(shù)膠體金免疫層析產(chǎn)品采用競爭性抑制免疫層析原理，及樣品中的目標(biāo)物經(jīng)特定前處理方式提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體與檢測線上的抗原結(jié)合，通過觀察檢測線顏色的深淺來判定樣品中目標(biāo)物的含量。

調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前市場銷售的膠體金農(nóng)藥殘留快檢試紙條所能覆蓋的農(nóng)藥殘留項目不多，主要有克百威、三唑磷、氟蟲腈、水胺硫磷、甲基異柳磷、腐霉利、毒死蜱、高效氯氰菊酯、丙溴磷、敵百蟲、氧樂果等十余項農(nóng)藥殘留。

此法的主要優(yōu)勢在于：（1）特異性強(qiáng)，免疫層析技術(shù)通過在目標(biāo)物上尋找特定的結(jié)合位點(diǎn)，能夠與目標(biāo)物進(jìn)行特異性結(jié)合，因此，對于定性檢測，存在先天優(yōu)勢;（2）檢出限低，對于目標(biāo)物檢測，通常都能夠做到ppb級的檢出限，能夠檢測樣品中的微量農(nóng)殘;（3）對于檢測儀器的依賴性不高，不需要購置大型檢測儀器，多數(shù)情況下肉眼即可判斷檢測結(jié)果。

此法的主要缺陷在于：（1）檢測成本較高，每項次檢測試紙條成本約10元;（2）測定目標(biāo)物單一，每種試紙條只能檢測單一目標(biāo)物，而我國具有限量的限用和禁用農(nóng)藥在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中，共規(guī)定了564種農(nóng)藥10 092項最大殘留限量，對于單一農(nóng)藥的檢測不能滿足日常監(jiān)管的需求。

3 微流控技術(shù)的研究現(xiàn)狀與分析

微流控技術(shù)，又稱微流控芯片技術(shù)，是將樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等生化反應(yīng)過程集成到厘米尺度的芯片上的技術(shù)。它起源于毛細(xì)管電泳技術(shù)，隨著PDMS軟刻蝕和微閥微泵技術(shù)的應(yīng)用推廣，微流控芯片逐漸成為一個重要的技術(shù)平臺。

3.1 紙基微流控芯片

紙芯片微流控技術(shù)是一種新型微流控技術(shù)。相比于以玻璃、石英、高聚物等為基底的傳統(tǒng)微流控芯片，紙芯片具有成本低、易操作、可攜帶、耗樣量小等優(yōu)點(diǎn)。

紙基微流控芯片結(jié)合了微流控和紙的優(yōu)點(diǎn)，在紙的表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的流體通道微型分析器件。流體在紙上通過毛細(xì)作用流動，需要的試樣量更少，且分析步驟簡便易操作，適合于現(xiàn)場的便攜式檢測?；诩埢酒臋z測方法，主要包括了熒光法、電化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)檢測法、光度檢測法等，其中光度檢測法和電化學(xué)方法是目前應(yīng)用最多的。紙基芯片在臨床血液檢測中的應(yīng)用較為廣泛，例如，在臨床分析中，常用的葡萄糖檢測方法是利用葡萄糖和GOx、HRP混合物的顯色反應(yīng)進(jìn)行定量分析。

在食品安全分析領(lǐng)域，紙基微流控芯片被應(yīng)用于致病菌、重金屬及蔬菜表層的農(nóng)藥殘留檢測中。Henry 課題組[5]利用細(xì)菌產(chǎn)生的酶和顯色底物反應(yīng)進(jìn)行比色法檢測成功在紙芯片上檢測大腸桿菌、沙門菌以及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，檢出限可達(dá)10 cfu /cm2，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測范圍，與傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)方法相比，大幅度縮短了富集時間。

3.2 離心式微流控芯片

微流控檢測近年來得到快速發(fā)展，在生物檢測、食品檢測等領(lǐng)域已有成功應(yīng)用。圖1為在新型冠狀病毒核酸檢測中成功應(yīng)用的基于微流控技術(shù)制備的核酸檢測芯片，該芯片在1.5 h內(nèi)便可一次性檢測包括新型冠狀病毒（2019-nCoV）在內(nèi)的6種呼吸道常見病毒，且可實(shí)現(xiàn)多個樣品批量處理，為患者及一線醫(yī)務(wù)人員提供快速、精確、有效的診斷。

此外，Guan等[6]在構(gòu)建的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） /玻璃微流控芯片與微珠組成的免疫分離平臺上，采用生物發(fā)光技術(shù)檢測食源性病原體;Birnbaumer等[7]建立了一種新型的微全分析系統(tǒng)，能夠持續(xù)監(jiān)測病毒污染，具有較高的靈敏度和良好的選擇性;Bergeron[8]最早發(fā)展了實(shí)時PCR檢測技術(shù)，并成功將其市場化，用于檢測B組鏈球菌、甲氧西林、抗藥性金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌和難辨梭狀芽孢桿菌，近年來他所帶領(lǐng)的團(tuán)隊又開發(fā)一個微向心力設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)無需培養(yǎng)的食源性病原快速檢測。Min等[9]開發(fā)了一種基于PCR的分子診斷裝置，包括微流控芯片和離心力輔助的液體操作管（CLHT），后者可在單管內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的濃縮、純化和放大。

在食品檢測領(lǐng)域，針對蘇丹紅的檢測，Liu等[10]通過兩層芯片間夾濾膜的方式發(fā)展了一種真空加速微流體免疫方法（VAMI）。Jiang等[11]設(shè)計了一個塑料微流控裝置用于食品中污染物的高通量檢測，其中，微流控網(wǎng)格以聚酯和聚二甲基硅氧烷為材質(zhì)，采用硅模板印跡和毛細(xì)管成型技術(shù)制得，檢測方法采用親和捕獲、濃縮和電噴霧粒子質(zhì)譜方法，聚氯乙烯膜被夾于印跡化的共聚物微通道中，形成一個整合平臺，用于對包含黃曲霉毒素B1抗體和黃曲霉毒素的連續(xù)親和透析和濃縮。

3.3 離心式微流控技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用情況

將離心式微流控技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)殘快速檢測中，目前已有一些研究基礎(chǔ)。中國計量大學(xué)申請了“一種基于雙光譜技術(shù)的微流控農(nóng)藥殘留檢測方法”發(fā)明專利，其主要將拉曼光譜與微流控模塊結(jié)合，將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，預(yù)期實(shí)現(xiàn)樣品中農(nóng)藥殘留的定性定量檢測。

深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心申請了“一種基于花狀納米銀襯底的農(nóng)藥殘留快速檢測系統(tǒng)”實(shí)用新型專利[12]，其利用離心式微流控來控制液體流向及反應(yīng)時間，將熒光檢測裝置用于獲取所述圓盤陣列結(jié)構(gòu)的芯片實(shí)驗(yàn)室中待測農(nóng)藥的光強(qiáng)度信號，通過采集農(nóng)藥的光強(qiáng)度信號進(jìn)行農(nóng)殘檢測。

廣州安諾科技股份有限公司申請了“一種基于DELFIA 的農(nóng)殘檢測裝置及檢測方法”發(fā)明專利，其設(shè)計了一種基于DELFIA 的農(nóng)殘檢測裝置及檢測方法，包括離心盤和熒光檢測機(jī)構(gòu)的分析儀，固定設(shè)置在離心盤上并通過離心作用獲取檢驗(yàn)液的微流控芯片。微流控芯片內(nèi)部沿離心盤的徑向由內(nèi)至外依次設(shè)置有樣品孔、過濾孔、第一反應(yīng)孔、第二反應(yīng)孔以及廢液孔;樣品孔、過濾孔、第一反應(yīng)孔、第二反應(yīng)孔以及廢液孔之間依次通過微流道連通，在各微流道口分別設(shè)置有不同厚度的糖膜，不同厚度的糖膜根據(jù)不同的離心轉(zhuǎn)速而分別開啟微流道;樣品孔用于容納農(nóng)殘檢驗(yàn)液的樣品溶液并通過離心轉(zhuǎn)動而攪拌均勻;從而檢測出農(nóng)作物樣品中農(nóng)藥殘留的含量。

蘇州汶顥芯片科技有限公司申請了“一種檢測農(nóng)藥殘留的離心式微流控芯片及其制備方法”的發(fā)明專利，其設(shè)計了一種用于農(nóng)藥殘留檢測的離心式微流控芯片，該芯片是帶微結(jié)構(gòu)和微通道的圓片狀芯片，由多層芯片組成，在離心機(jī)旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力驅(qū)動下，實(shí)現(xiàn)待測樣品與反應(yīng)試劑的混合、萃取、反應(yīng)、分離和顯色過程，最后用紫外可見光分光光度計定量檢測出樣品中農(nóng)藥殘留的含量。

廣東順德中山大學(xué)卡內(nèi)基梅隆大學(xué)國際聯(lián)合研究院申請了“多通道微流控?zé)晒鈾z測裝置和方法”的發(fā)明專利，該熒光檢測裝置和方法采用雙柵極光電薄膜晶體管，并將其和多通道微流控芯片集成，形成集成化和微型化的多通道的微流控?zé)晒獠杉到y(tǒng)進(jìn)行熒光信號收集和檢測，具有較高的光靈敏度和光電導(dǎo)增益，非常適用于熒光檢測，并且其制備難度和成本較低、功耗小、集成度高，適用于大面積制作，實(shí)現(xiàn)陣列化。葉嘉明等基于酶抑制原理結(jié)合光度分析方法，研制了一種預(yù)存儲生化試劑的離心式微流控芯片，結(jié)合自行研制的便攜式分析裝置，可以同時檢測12個樣品，實(shí)現(xiàn)了樣品的半自動化檢測。

鹽城工學(xué)院申請了“一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜和紙質(zhì)微流控芯片的茶葉中農(nóng)藥殘留檢測方法”發(fā)明專利，其基于表面增強(qiáng)拉曼光譜和紙質(zhì)微流控芯片技術(shù)開發(fā)了一種茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法，可做茶葉中農(nóng)藥殘留的定性定量檢測。

蘇州汶顥芯片科技有限公司申請了“微流控芯片及其在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用”的發(fā)明專利，其檢測單元分別包括一萃取池、一微通道和一檢測池，微通道的兩端分別連通于所述萃取池和檢測池，萃取池、檢測池和中心點(diǎn)共線，且所述萃取池和檢測池分別位于所述中心點(diǎn)的近端和遠(yuǎn)端。此微流控技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多個樣品的在線分離和平行檢測，試劑和樣品量耗損微量，大大降低了農(nóng)藥的檢出限。

通過現(xiàn)有的文獻(xiàn)分析，目前的研究主要集中于將微流控技術(shù)與拉曼光譜相結(jié)合，或微流控技術(shù)與熒光模塊相結(jié)合，微流控平臺包括紙基微流控和離心式微流控，其核心反應(yīng)還是以酶抑制反應(yīng)為基礎(chǔ)的顯色反應(yīng)，其中，拉曼光譜可以用于定性檢測。

4 農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的發(fā)展方向

4.1 優(yōu)化酶抑制率法

目前，對酶抑制率法優(yōu)化的研究主要集中在反應(yīng)環(huán)境條件的優(yōu)化上，這有效提高了酶抑制率法的靈敏度和準(zhǔn)確性，但對影響反應(yīng)體系的因素考慮不夠系統(tǒng)、全面，對酶的來源、緩沖液、不同樣品的基質(zhì)干擾等關(guān)注較少，相關(guān)研究還需深入。

4.2 將酶抑制率法與微流控技術(shù)結(jié)合

將微流控技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的研究，有助于精確控制酶抑制反應(yīng)的反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間，實(shí)現(xiàn)多個樣品批量檢測，輔以膽堿酯酶的優(yōu)選及前處理技術(shù)優(yōu)化，能大大提升檢測效率、結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。首先，通過篩選高效膽堿酯酶、控制底物及反應(yīng)體系的多種因素、排除基質(zhì)干擾等，系統(tǒng)優(yōu)化酶抑制率法體系，獲得高靈敏度的酶抑制率法農(nóng)殘檢測體系;其次，基于微流控技術(shù)，設(shè)計合理芯片結(jié)構(gòu)、離心反應(yīng)條件等，獲得微流控自動化檢測參數(shù);最后，開發(fā)出基于微流控技術(shù)的農(nóng)殘高通量快速檢測試劑盒，提高基層快速檢測的效率及檢測結(jié)果的可靠性。此外，在遇到含有深色素的樣品時，可見光變化的傳統(tǒng)方法會受到嚴(yán)重干擾從而影響結(jié)果判斷。通過熒光底物及相關(guān)體系，同時建立熒光法的酶抑制率方法，實(shí)現(xiàn)熒光、可見光雙通道的信號輸出，可有效提升方法的適用性。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊建平.蔬菜農(nóng)藥殘留快速檢測影響因素的分析[J].上海計量測試，2018，45 （S1）：24-26，31.

[2] 鐘樹明，袁東星，金曉英，等.植物酶抑制技術(shù)用于檢測蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留[J].環(huán)境化學(xué)， 2002（2）：189-193.

[3] 李順，紀(jì)淑娟，李東華.酶抑制法快速檢 測蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的最佳條件研究[J].食品科技，2007（1）：171-173.

[4] 楊東鵬，張春榮，董民，等.酶抑制分光光度法檢測蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的方法的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2004（4）：58-61.

[5] Dungchai W， Chailapakul O， Henry C S. A low-cost， simple， and rapid fabrication method for paper-based microfluidics using wax screen-printing[J]. Analyst， 2011， 136（1）： 77-82.

[6] Guan X， Zhang H J， Bi Y N， et al. Rapid detection of pathogens using antibody-coated microbeads with bioluminescence in microfluidic chips[J]. Biomedical Microdevices， 2010， 12（4）： 683-691.

[7] Birnbaumer G M， Lieberzeit P A， Richter L， et al. Detection of viruses with molecularly imprinted polymers integrated on a microfluidic biochip using contact-less dielectric microsensors[J]. Lab on A Chip， 2009， 9（24）： 3549，3556.

[8] Bergeron M G. Revolutionizing the practice of medicine through rapid （<1 h） DNA-based diagnostics[J]. Clinical & Investigative Medicine Medecine Clinique Et Experimentale， 2008， 31（5）： E265-271.

[9] Min J， Kim J H， Lee Y， et al. Functional integration of DNA purification and concentration into a real time micro-PCR chip[J]. Lab on A Chip， 2011， 11（2）： 259-265.

[10] Liu Y， Yu J， Du M， et al. Accelerating microfluidic immunoassays on filter membranes by applying vacuum[J]. Biomedical Microdevices， 2011，14（1）： 17-23.

[11] Jiang Y， Wang P C， Locascio L E， et al. Integrated plastic microfluidic devices with ESI-MS for drug screening and residue analysis[J]. Analytical Chemistry， 2001， 73（9）： 2048-2053.

[12] 陳波，靳保輝，趙旭，等.一種基于花狀納米銀襯底的農(nóng)藥殘留快速檢測系統(tǒng)：中國， CN210604385U [P].2020-05-22.

責(zé)任編輯：黃艷飛

Development Status of Rapid Detection of Pesticide Residues and Application Prospect of Microfluidic Technology in Rapid Detection of Pesticide Residues

XU Jingbing et al（Chongqing Institute of Food and Drug Inspection and Testing， Chongqing 401121）

Abstract At present， the most widely used rapid detection technology of pesticide residues is enzyme inhibition method， which is most widely used in the grassroots law enforcement of market supervision， but it has a lot of congenital deficiencies， which also makes its use effect greatly reduced. Although colloidal gold immunochromatography has the advantage of strong qualitative ability and lower detection limit， its cost is high and it can only be used as a single pesticide residue， so its efficiency is too low in basic application， so it has not been widely used. Microfluidic technology can combine the advantages of enzyme inhibition rate method， complete automatic detection in a short time， and has a good application prospect.

Key words Pesticide residues; Enzyme inhibition; Colloidal gold immunochromato-graphy; microfluidic