溶劑法提取微擬球藻脂質(zhì)的工藝優(yōu)化及其脂質(zhì)組學(xué)分析

張美蘭，趙康宇，張立偉,2，何東平,2，鄭竟成,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023； 2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

二十碳五烯酸(EPA)是ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)，對(duì)人體健康有著重要的作用，其不僅具有良好的調(diào)節(jié)人體免疫作用[1]，還具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[2]、降低人體甘油三酯水平從而降低動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的功能[3]。

人體內(nèi)EPA的來(lái)源主要有兩種，一種是由人體攝入的α-亞麻酸經(jīng)過(guò)碳鏈延長(zhǎng)酶和去飽和酶的作用得到[4]。但根據(jù)Hussein等[5]的研究，人體內(nèi)僅有0.3%的EPA可以由α-亞麻酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，并不能滿足人體日常所需攝入量。另一種來(lái)源是通過(guò)日常的膳食進(jìn)行補(bǔ)充。目前，市場(chǎng)上EPA的主要來(lái)源是深海魚(yú)油和磷蝦油，也是EPA的傳統(tǒng)來(lái)源，但由于其可持續(xù)性較差，供應(yīng)量無(wú)法滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求[6]。近年來(lái)，人們?cè)趯ふ腋鞣N不同的EPA來(lái)源，如轉(zhuǎn)基因植物以及海洋微藻[7-9]。

近年來(lái)，微藻由于具有單位面積內(nèi)培育量大，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)[10]，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[11]、生物柴油的制備[12]以及高附加值的人體營(yíng)養(yǎng)膳食補(bǔ)充劑的生產(chǎn)[13]。在眾多的微藻中，微擬球藻由于具有生長(zhǎng)速率快、脂質(zhì)積累量高、EPA含量較高的特點(diǎn)，成為近年來(lái)制備功能性脂質(zhì)方向的研究熱點(diǎn)[14]。從微擬球藻中提取的脂質(zhì)含有8%～10%的磷脂、30%～40%的糖脂和30%～40%的中性脂[15]。不同脂類(lèi)中脂肪酸組成差別較大，EPA在糖脂中含量較高，而在中性脂和磷脂中分布較少，3種脂類(lèi)中EPA含量之和占微擬球藻總脂質(zhì)的30%～40%。在正常生長(zhǎng)條件下，微擬球藻合成脂肪酸主要用于合成膜脂，膜脂上含有大量的PUFA，在外部條件發(fā)生變化時(shí)，微藻合成的脂肪酸會(huì)轉(zhuǎn)而積累在中性脂上[16]。因此，在提取微擬球藻脂質(zhì)時(shí)，所選方法不僅能提取中性脂，還應(yīng)能提取極性脂，此外還需要考慮提取的脂質(zhì)中EPA含量的高低。

近年來(lái)，已有多位學(xué)者對(duì)微擬球藻脂質(zhì)的提取方法進(jìn)行了研究，如：Crampon 等[17]研究了氣流干燥和冷凍干燥對(duì)超臨界CO2萃取Nannochloropsisoculata脂質(zhì)的影響；Ryckebosch等[18]研究了8種溶劑對(duì)Nannochloropsisgaditana中脂質(zhì)提取的影響，發(fā)現(xiàn)乙醇提取率較低，且存在純度較低的情況。采用乙醇提取微擬球藻脂質(zhì)時(shí)，可以得到溶血?；视腿谆呓z氨酸(LDGTS)[19]，該物質(zhì)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的能力，能通過(guò)改善高密度脂蛋白(HDL)的質(zhì)量和功能來(lái)促進(jìn)心血管健康。

本文對(duì)比氯仿-甲醇(體積比1∶1)、氯仿、異丙醇、石油醚、正己烷-乙醇(體積比1∶1)、正己烷、乙醇7種溶劑提取微擬球藻脂質(zhì)對(duì)脂質(zhì)得率及EPA含量的影響，并對(duì)乙醇提取微擬球藻脂質(zhì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最后對(duì)所得脂質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，以期為乙醇法提取微擬球藻脂質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

微擬球藻藻粉，由山東煙臺(tái)海融微藻養(yǎng)殖有限公司提供。

氯仿、甲醇、石油醚、正己烷、無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉、丙酮、氯化鈉、50%三氟化硼甲醇溶液，分析純；正己烷、異丙醇、甲醇、乙腈，色譜純，德國(guó)默克集團(tuán)；EPA甘三酯標(biāo)品，上海源葉生物有限公司；氘化脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)混合物，美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；HyperSep Silica 固相萃取柱，賽默飛公司。

UPLC LC-10A超高效液相色譜，日本島津公司；AB ScieX Triple TOF 6600質(zhì)譜儀；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱；AR423DCN精密電子天平；SHA-B數(shù)顯恒溫水浴振蕩器；Agilent 7890A-5975C GC-MS；TDZ5-WS低速離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微擬球藻脂質(zhì)的提取

取10 g微擬球藻藻粉于錐形瓶中，以一定的料液比加入溶劑，在一定溫度下提取一定時(shí)間后，將混濁液轉(zhuǎn)移至離心管中，并用相同溶劑洗滌錐形瓶3次，將洗滌液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 000 r/min下離心15 min，收集上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，收集濃縮液于平板中，在60℃下真空干燥至恒重，獲得微擬球藻粗脂質(zhì)。

將微擬球藻粗脂質(zhì)溶于8 mL氯仿-甲醇(體積比1∶1)中，用2 mL水洗滌，在8 000 r/min下離心15 min，去除上層含有多糖和蛋白質(zhì)等非脂質(zhì)物質(zhì)的水層，取下層氮吹去除溶劑，即為微擬球藻脂質(zhì)。

微擬球藻脂質(zhì)得率(Y)按下式計(jì)算。

Y=m1/m0×100%

(1)

式中：m1和m0分別為微擬球藻脂質(zhì)的質(zhì)量和微擬球藻藻粉的質(zhì)量。

1.2.2 微擬球藻脂質(zhì)中EPA含量的測(cè)定

甲酯化方法：參照俞喜娜等[20]的方法，取200 mg微擬球藻脂質(zhì)于10 mL試管中，加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，在60℃水浴中振蕩30 min；小心加入2 mL 50%的BF3-CH3OH，繼續(xù)在60℃水浴振蕩3 min；加入2 mL飽和NaCl溶液，再加入2 mL色譜級(jí)正己烷并振蕩，靜置后取上清液，過(guò)0.25 μm有機(jī)濾膜后待GC-MS分析。

GC條件：Agilent HP-88毛細(xì)管色譜柱(100 m×25 μm, 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度260℃；升溫程序?yàn)?40℃保持2 min，以3℃/min升溫至185℃，保持5 min，再以3℃/min升溫到200℃，保持3 min，再以2.5℃/min升到225℃，保持5 min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比1∶40。

MS條件：EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～550，溶劑延時(shí)5 min。

EPA含量按照GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》第二法外標(biāo)法中公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 微擬球藻脂質(zhì)的脂質(zhì)組學(xué)分析

樣品前處理：稱取10.0 mg微擬球藻脂質(zhì)于1 mL 異丙醇中，渦旋30 min使其充分溶解，加入異丙醇稀釋至100倍后，加入10 μL 100 μg/mL的氘化脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)混合物，渦旋30 s后于12 000 r/min離心5 min，取上層清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，待UPLC-Q-TOF-MS測(cè)定。

UPLC條件：Phenomenex Kinete C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；柱溫60℃；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相中A相為H2O-甲醇-乙腈(體積比1∶1∶1，含5 mmol/L NH4Ac)，B相為異丙醇-乙腈(體積比5∶1 ，含5 mmol/L NH4Ac)；流速0.4 mL/min；流動(dòng)相梯度洗脫程序按表1進(jìn)行。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

MS條件：ESI離子源，正模式，質(zhì)量掃描范圍(m/z)100～1 200，干燥氣壓力0.24 MPa,離子源氣體1壓力0.35 MPa,離子源氣體2壓力0.35 MPa,離子噴射電壓5 500 V,溫度600℃。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率及EPA含量的影響

在料液比1∶10、提取溫度25℃、提取時(shí)間3 h的條件下，考察不同提取溶劑對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率和EPA含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

注：CM.氯仿-甲醇(體積比1∶1)；C.氯仿；I.異丙醇；Pe.石油醚；HE.正己烷-乙醇(體積比1∶1)；H.正己烷；E.乙醇。同一指標(biāo)不同字母表示存在顯著差異(p<0.05)。下同

由圖1可知，與氯仿-甲醇(體積比1∶1)和正己烷-乙醇(體積比1∶1)混合溶劑相比，采用單一溶劑進(jìn)行微擬球藻脂質(zhì)提取時(shí)脂質(zhì)得率普遍較低，而EPA含量卻因溶劑不同呈現(xiàn)出一定的差異。這是由于微擬球藻脂質(zhì)中含有中性脂與極性脂兩類(lèi)脂質(zhì)，且微擬球藻中EPA主要分布于細(xì)胞膜脂等極性脂上，故當(dāng)提取出的脂質(zhì)中極性脂含量較高時(shí)，提取物中的EPA含量較高。如采用正己烷-乙醇(體積比1∶1)混合溶劑提取時(shí)，正己烷多用于提取中性脂，乙醇用于提取極性脂。采用單一溶劑提取時(shí)，乙醇提取的脂質(zhì)EPA含量最高?？紤]到脂質(zhì)的提取過(guò)程需要綠色、安全、無(wú)毒，以及較高含量的EPA，因此選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2 乙醇提取微擬球藻脂質(zhì)的工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

在料液比1∶10、提取溫度65℃、提取時(shí)間3 h的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率和EPA含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

由圖2可知，微擬球藻脂質(zhì)得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后減少,脂質(zhì)中EPA含量變化與脂質(zhì)得率的趨勢(shì)相同，脂質(zhì)得率與EPA含量都在乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)達(dá)到最高。綜合考慮，選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。

2.2.1.2 料液比對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取溫度65℃、提取時(shí)間3 h的條件下，考察料液比對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率和EPA含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

由圖3可知，微擬球藻脂質(zhì)得率與EPA含量均隨著料液比的增加先增加后降低，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，脂質(zhì)得率與EPA含量均最大。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶15。

2.2.1.3 提取溫度對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

在提取時(shí)間3 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶15 條件下，考察提取溫度對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率和EPA含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，脂質(zhì)得率和EPA含量均先升高后降低，在提取溫度為65℃時(shí)，脂質(zhì)得率和EPA含量最高。這是因?yàn)樵谔崛囟鹊陀?5℃時(shí)，提取溫度的上升使溶劑分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，有利于溶劑分子擴(kuò)散進(jìn)入微擬球藻細(xì)胞中對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行提取，因此提取溫度的上升有利于脂質(zhì)的提??；而當(dāng)提取溫度高于65℃時(shí)，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致料液間出現(xiàn)汽化層，漸漸阻礙了溶劑分子的擴(kuò)散，不利于微擬球藻脂質(zhì)的提取。同時(shí)，EPA不飽和度較高，高溫時(shí)易發(fā)生氧化。綜合考慮，選擇最佳提取溫度為65℃。

2.2.1.4 提取時(shí)間對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

在提取溫度65℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶15條件下，考察提取時(shí)間對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率和EPA含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取的影響

由圖5可知，微擬球藻脂質(zhì)得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后趨于穩(wěn)定，在提取時(shí)間2 h時(shí)微擬球藻脂質(zhì)的提取達(dá)到平衡。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，EPA含量呈波動(dòng)變化趨勢(shì)。綜合考慮，選擇最佳提取時(shí)間為2 h。

2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間為因素，分別以微擬球藻脂質(zhì)得率和EPA含量為指標(biāo)，采用四因素三水平正交試驗(yàn)L9(34)優(yōu)化微擬球藻脂質(zhì)的提取工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可知，各因素對(duì)微擬球藻脂質(zhì)得率影響的主次順序?yàn)锽(料液比)>C(提取溫度)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>D(提取時(shí)間)。最佳工藝參數(shù)組合為A1B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶17.5、提取溫度65℃、提取時(shí)間2 h。

各因素對(duì)微擬球藻脂質(zhì)中EPA含量影響的主次順序?yàn)镈(提取時(shí)間)>C(提取溫度)>B(料液比)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))。最佳工藝參數(shù)組合為A1B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶17.5、提取溫度60℃、提取時(shí)間2 h。

由于兩個(gè)指標(biāo)的最佳工藝參數(shù)組合中，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間相同，僅提取溫度存在差異，故分別對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的工藝參數(shù)組合進(jìn)行試驗(yàn)。

當(dāng)工藝參數(shù)組合為A1B3C2D2時(shí)，微擬球藻脂質(zhì)得率為(15.87±0.21)%，EPA含量為(14.49±0.14) g/100 g。當(dāng)工藝參數(shù)組合為A1B3C1D2時(shí)，微擬球藻脂質(zhì)得率為(15.73±0.17)%，EPA含量為(12.49±0.31)g/100 g，該條件下EPA含量低于A1B3C2D2組合條件下的，可能是因?yàn)闆](méi)有考慮到各因素的交互作用。兩種條件下脂質(zhì)得率相差不大，而EPA含量相差較大，故選擇工藝參數(shù)組合A1B3C2D2作為微擬球藻脂質(zhì)提取的最佳工藝條件。

2.3 微擬球藻脂質(zhì)的脂質(zhì)組學(xué)分析

對(duì)最佳條件下提取的微擬球藻脂質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。微擬球藻脂質(zhì)中含有EPA的脂質(zhì)種類(lèi)及含量見(jiàn)表5。

由表4可知，乙醇提取的微擬球藻脂質(zhì)中含有17種脂質(zhì)。其中，糖脂(SQDG、LDGTS、DGDG、MGDG、DGTS和DGGA)的含量最高，占總脂質(zhì)的62.2%，其次為磷脂(Cer、LPC、LPE、LPG、PC、PE、PG和PI)，占總脂的25.2%,中性脂(DG和TG)含量占總脂的5.1%。

表4 微擬球藻脂質(zhì)中脂質(zhì)組成及含量 mg/g

表5 微擬球藻脂質(zhì)中含EPA的脂質(zhì)種類(lèi)及含量 mg/g

由表5可知，含有EPA的脂質(zhì)有12種，含有EPA的脂質(zhì)含量按照由高到低依次為DGDG>LDGTS>PG>PC>MGDG>TG>DG>DGTS>PE>LPC>LPE=LPG。微擬球藻中的EPA主要是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，并進(jìn)一步輸出到質(zhì)體中與半乳糖脂結(jié)合，因此含EPA較多的是DGDG和LDGTS。在DGDG中，含EPA的物質(zhì)占總DGDG的80.3%； 在LDGTS中，含EPA的物質(zhì)占總LDGTS的70.7%；在微擬球藻17種脂質(zhì)中，含EPA的脂質(zhì)占總脂質(zhì)的45.24%。

3 結(jié) 論

乙醇提取微擬球藻脂質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶17.5、提取溫度65℃、提取時(shí)間2 h，在最佳條件下微擬球藻脂質(zhì)得率為(15.87±0.21)%，EPA含量為(14.49±0.14)g/100 g。

采用 UPLC-Q-TOF-MS對(duì)微擬球藻脂質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，共檢出17種脂質(zhì)，分別是神經(jīng)酰胺(Cer)、游離脂肪酸(FA)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰甘油酯(LPG)、單半乳糖酰甘油二酯(MGDG)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、甘油二酯(DG)、雙半乳糖甘油二酯(DGDG)、二?；视推咸侨┧?DGGA)、二酰甘油-N-三甲基高絲氨酸(DGTS)、溶血酰基甘油三甲基高絲氨酸(LDGTS)、硫代異鼠李糖甘油二酯(SQDG)和甘油三酯(TG)，其中12種脂質(zhì)含有EPA，含EPA最多的脂質(zhì)是DGDG，其次是LDGTS，在微擬球藻17種脂質(zhì)中，含EPA的脂質(zhì)占總脂質(zhì)的45.24%。