酸后處理對腦缺血再灌注后神經(jīng)元ROS生成的抑制作用*

范彥英， 趙 靜， 曹 靜， 楊彩紅

（山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室，山西 太原 030001）

腦缺血是目前成年人死亡和殘疾的主要原因，其損傷機制極為復雜［1］。目前主要的治療手段即溶栓或機械性取栓，但該療法時間窗短，且血管再通過程中大量氧自由基的產(chǎn)生和谷氨酸興奮性毒性作用，會進一步造成再灌注損傷，影響治療效果［2-3］。尋找有效減輕腦缺血再灌注損傷的治療手段是目前該領域的研究難點之一［4］。

缺血后處理作為一種內(nèi)源性保護策略，是指在缺血后給予短暫的缺血/再灌注循環(huán)的處理手段，通過調(diào)動機體自身的保護機制達到神經(jīng)保護目的［5］。研究者已在多種腦缺血模型如局灶性腦缺血、全腦缺血及離體腦片和神經(jīng)元缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型中證實了缺血后處理的神經(jīng)保護作用［4］。我們前期研究了促使缺血后處理發(fā)揮神經(jīng)保護作用的因素，結果顯示腦組織酸化是其中的關鍵因素，再灌早期通過給小鼠短暫性吸入CO2以模擬缺血后處理時的腦內(nèi)弱酸環(huán)境可減輕神經(jīng)損傷，且該保護程度與缺血后處理相當［6］。同時，在皮層紋狀體腦片和原代皮層神經(jīng)元OGD 模型中，酸后處理也具有保護作用［6］。有趣的是，酸后處理還可延長再灌注的時間窗［7］。相對于缺血后處理，酸后處理作為一種非手術形式的后處理手段，可能是一種更安全、便捷的干預手段。我們的前期研究顯示，酸后處理的保護機制可能與調(diào)節(jié)線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transformation pore，MPTP）開放、減少線粒體依賴的細胞凋亡有關［6］。研究顯示，酸后處理的抗凋亡機制也可能與其在腦缺血再灌后誘導Parkin 依賴的線粒體自噬有關［7］。然而，酸后處理的神經(jīng)保護機制仍未完全闡明。腦缺血再灌時血供的突然恢復會造成體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的大量產(chǎn)生，導致細胞氧化應激損傷。因此如何對抗ROS是目前抗腦缺血藥物的研究方向之一［8］。但是，酸后處理的保護機制是否與抗ROS有關尚無報道。

因此，本研究利用小鼠短暫性大腦中動脈栓塞（transientmiddle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型及原代大鼠皮層神經(jīng)元OGD 模型，觀察了酸后處理對腦缺血再灌后ROS 產(chǎn)生的影響，并初步探討其機制是否與調(diào)節(jié)MPTP 的開放及內(nèi)源性抗氧化物谷胱甘肽氧化還原態(tài)有關。

材料和方法

1 動物

24 只SPF 級雄性C57/BL6 小鼠購自北京維通利華公司，許可證號為SCXK（京）2011-0011，體重22～25 g，8周齡。

2 藥物和試劑

JC-1 探針購自碧云天生物技術有限公司；atractyloside、cyclosporin A、DCFH-DA 探針、3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）、2，3，5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）和poly-L-lysine 購自Sigma；胰酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清、Neurobasal 神經(jīng)元培養(yǎng)基、B27 和DMEM 無糖培養(yǎng)基購自Gibco；還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

3 方法

3.1 動物分組、tMCAO 造模、酸后處理方法及腦梗死體積測定 將小鼠隨機分為缺血組和酸后處理組，每組12 只。每組動物中，6 只用于ROS 含量測定，其余動物用于腦梗死體積測定。

參照文獻［9］，以1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉動物，將經(jīng)尖端鈍化處理的6-0線栓向頸內(nèi)動脈內(nèi)推進10 mm，阻斷大腦中動脈的起始點，60 min 后，將線栓拔出以造成tMCAO。酸后處理組的動 物 于 再 灌5 min 后 持 續(xù) 吸 入20% CO2（21% O2，59%N2）5 min。

再灌注24 h 后，利用0.25% TTC 染色測定腦梗死體積。用ImageJ 軟件分析正常（TTC 紅染）和梗死區(qū)域（白色）的體積。梗死體積百分比（%）=（對側半球體積-非缺血的同側半球體積）/對側半球體積×100%。

3.2 原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)，OGD 模型、酸后處理、藥物處理及細胞活力檢測 參照文獻［6］，分離E17～18 d 的Sprague-Dawley（SD）大鼠胚胎皮層組織，經(jīng)0.25%胰酶在37 ℃消化后，將分離的細胞接種到經(jīng)0.01%poly-L-lysine 包被的玻片或培養(yǎng)板上，種植液為含10%馬血清和10%胎牛血清的高糖DMEM。24 h 后更換為Neurobasal 飼養(yǎng)液（含2%B27）。神經(jīng)元培養(yǎng)7～9 d后，將細胞隨機分為對照組、OGD組、酸后處理組、atractyloside+酸后處理組及cyclosporin A組。將對照組飼養(yǎng)液換為高糖DMEM 繼續(xù)在5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，將各實驗組飼養(yǎng)液換為無糖DMEM，并將細胞暴露于充以80% N2和20% CO2混合氣體的缺氧小室中（37 ℃），以建立OGD 模型（20%CO2可致培養(yǎng)液pH 降至6.8，以模擬在體腦缺血的酸性環(huán)境），2 h 后將培養(yǎng)液換為高糖DMEM，并放回5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。酸后處理組則在正常再灌5 min 后將培養(yǎng)液換為經(jīng)20% CO2預孵育1 h的高糖DMEM，并立即放入20% CO2培養(yǎng)箱，15 min后轉移至5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)或進行其它指標檢測。MPTP 開放劑atractyloside（100 μmol/L）于酸后處理前5 min 加藥。MPTP 抑制劑cyclosporin A（2 μmol/L）則于再灌5 min后加藥。各組的每一次換液，相應其它組均平行換液。OGD 再灌24 h后，利用MTT 法測定細胞活力，對照組細胞存活率設為100%。

3.3 測定線粒體膜電位 利用JC-1 熒光探針測定神經(jīng)元線粒體膜電位（間接反映MPTP的開放情況）。OGD再灌5 min后，將神經(jīng)元于2.5 mg/L JC-1探針溶液中5%CO2培養(yǎng)箱（37 ℃）孵育15 min（酸后處理組置于20%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育），經(jīng)DMEM 漂洗后在熒光顯微鏡下成像（激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長＞520 nm）。當線粒體膜電位偏高時，JC-1以多聚體形式存在，呈紅色熒光；當線粒體膜電位處低位時，JC-1 以單體形式存在，呈綠色熒光。利用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件分析綠色和紅色熒光強度值，通過二者比值來評價線粒體膜電位的高低。

3.4 ROS 檢測 利用DCFH-DA 探針（本身無熒光）進入細胞內(nèi)被水解并迅速氧化成強熒光產(chǎn)物DCF的特性，該探針可用于檢測組織或細胞內(nèi)ROS 含量。腦組織ROS 測定：于再灌30 min 取缺血中心區(qū)和周邊區(qū)及相應對側區(qū)域的腦組織，于Locke緩沖液中按1∶10 的比例冰浴中勻漿。4 ℃、13 000×g離心30 min，取上清液。將等量的上清液加入至24 孔板中，室溫放置2 min 后加入DCFH-DA（10 μmol/L）。于37 ℃孵育30 min 后用多功能酶標儀（FLUOstar Optima，BMG）以485 nm 激發(fā)光，530 nm 發(fā)射光檢測熒光讀數(shù)。原代神經(jīng)元ROS測定：在酸后處理或cyclosporin A 處理結束前5 min 加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育5 min。經(jīng)DMEM 漂洗后在熒光顯微鏡下成像，或用多功能酶標儀檢測熒光讀數(shù)。采用Lowry 法檢測同一樣本的蛋白濃度以消除由于組織或細胞量不同造成的差異。

3.5 GSH 和GSSG 含量測定 神經(jīng)元OGD 再灌20 min 后，用冰PBS 沖洗后收集細胞，低溫離心2 min（2 300×g，4 ℃）。吸盡上清。根據(jù)GSH 和GSSG檢測試劑盒說明書進行反應，酶標儀測定波長412 nm 處吸光度。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SEM）表示。用one-way ANOVA 結合LSD 或Dunnett’s T3 post-hoc test 進行3 組以上數(shù)據(jù)間差異分析。用Student’st檢驗進行兩組間數(shù)據(jù)差異分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 酸后處理可減少tMACO 再灌后ROS 的產(chǎn)生及腦梗死體積

在tMCAO 再灌30 min 后，缺血中心區(qū)和周邊區(qū)的ROS含量分別上調(diào)為對側的2.78和1.75倍；而進行酸后處理的動物缺血中心區(qū)和周邊區(qū)的ROS含量與缺血組相比顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖1B。為了明確酸后處理保護作用的有效性，我們測定了小鼠再灌24 h 后的腦梗死體積。與對照組相比，酸后處理組小鼠的腦梗死體積顯著降低（P＜0.01），見圖1A。

2 酸后處理可抑制神經(jīng)元OGD 再灌后線粒體膜電位的下降和ROS的產(chǎn)生

JC-1 染色結果顯示，OGD 2 h 再灌20 min 后，神經(jīng)元線粒體膜電位急劇下降，表現(xiàn)為綠色與紅色熒光比值顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖2A、C，而于再灌注5 min 后給予15 min 的酸后處理可抑制再灌引起的線粒體膜電位下降（P＜0.01）。DCF熒光成像結果顯示，在神經(jīng)元OGD 再灌20 min 后，細胞內(nèi)的綠色熒光強度升高，表明有大量ROS 生成（圖2B），而酸后處理后細胞的綠色熒光強度降低。多功能酶標儀檢測結果顯示，細胞內(nèi)ROS含量升高，為對照組的2.65倍（P＜0.01），見圖2D，酸后處理可顯著抑制OGD 再灌誘導的ROS 產(chǎn)生，抑制率為（34.19±3.38）%（P＜0.01）。此外，MTT 結果顯示，OGD 再灌注24 h 引起的神經(jīng)元損傷也可被酸后處理所抑制（P＜0.01），見圖2E。

Figure 1. Effects of acidic post-conditioning（PostC）on infarct volume and ROS production induced by focal cerebral ischemia/reperfusion. A：infarct volume was determined 24 h after reperfusion（the left panel shows the representative images of TTCstained brain sections from each group，while the right panel shows the infarct volume）；B：fluorescence intensity of DCF was measured at 30 min after reperfusion in the core and periphery of the MCA territory using a FLUOstar Optima fluorescence plate reader. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs PostC group.圖1 酸后處理對局灶性腦缺血再灌注后腦梗死體積及ROS生成的影響

3 酸后處理可通過抑制MPTP 開放減少神經(jīng)元ROS的產(chǎn)生

進一步，我們研究了酸后處理對ROS 產(chǎn)生的抑制作用是否與其對MPTP 的調(diào)節(jié)作用有關。在酸后處理前給予100 μmol/L 的MPTP 開放劑atractyloside，可部分逆轉酸后處理對ROS 產(chǎn)生的抑制作用（P＜0.05），見圖3A、B。再灌5 min 后給予2 μmol/L的MPTP 抑制劑cyclosporin A 處理15 min，也可顯著抑制ROS的升高（P＜0.05），見圖3C、D。

4 酸后處理對神經(jīng)元OGD 再灌后谷胱甘肽氧化還原態(tài)的影響

為探討酸后處理抑制ROS 生成的其它可能機制，我們檢測了OGD 再灌20 min 后內(nèi)源性抗氧化多肽GSH 和及其氧化態(tài)的GSSG 的含量變化。再灌20 min 后，GSH 的含量與對照組相比顯著下調(diào)（P＜0.01），而酸后處理組的GSH 含量與OGD 組相比顯著上升（P＜0.01）。同時，與對照組相比，OGD 組和酸后處理組的GSSG 的含量均有輕微上調(diào)，但無顯著性差異。見圖4。

討論

氧化應激是缺血性腦損傷過程中一個重要的病理生理學機制。在再灌過程中，血供的突然恢復會引起ROS的大量產(chǎn)生，進而損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等細胞內(nèi)大分子，是誘導神經(jīng)元凋亡的重要原因之一［10］。課題組前期在整體和離體腦缺血模型上的研究表明酸后處理可減輕缺血再灌注損傷［6］。本研究在此基礎上，進一步證實酸后處理可顯著抑制小鼠tMCAO 或大鼠原代皮層神經(jīng)元OGD 再灌后的ROS生成，這可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一。

腦缺血再灌注時，神經(jīng)元內(nèi)ROS 的大量產(chǎn)生可造成MPTP 的迅速打開，進而造成線粒體膜電位下降、細胞色素C 的釋放等，該過程又會進一步導致更多ROS 生成，最終引起神經(jīng)元凋亡［11-12］。我們的前期研究在整體及離體腦缺血模型上證實，再灌早期給予酸后處理可抑制MPTP的開放、線粒體膜電勢的下降及線粒體依賴的凋亡［6］。Halestrap等［13］報道，在提取的心臟和肝臟線粒體上，從pH 7.0 到pH 6.0，酸（H+）可劑量依賴的有效抑制Ca2+誘導的MPTP 開放。在HL-1 心肌細胞上，pH 6.4 的酸性環(huán)境也可抑制缺血再灌引起的MPTP 的開放和細胞死亡［14］。H+本身可拮抗MPTP 重要組分ANT 上的Ca2+結合位點并減少線粒體Ca2+負載［13，15］，從而抑制MPTP的開放，但酸后處理是否可通過抑制MPTP 開放減少ROS 產(chǎn)生尚不清楚。本研究顯示，酸后處理可顯著抑制小鼠局灶性腦缺血及大鼠皮層神經(jīng)元OGD再灌后ROS的快速升高，而在細胞模型中，給予MPTP 開放劑atractyloside可削弱酸后處理對ROS的抑制作用。同時，OGD 再灌后給予MPTP 抑制劑cyclosporin A 也可抑制ROS 含量的上升。以上結果提示，抑制MPTP的開放可能是酸后處理抑制ROS 產(chǎn)生的機制之一。同時，由于MPTP 的開放劑atractyloside 并不能完全逆轉酸后處理對ROS 的調(diào)節(jié)作用，酸后處理對ROS產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用可能還存在MPTP以外的機制。

GSH 是一種內(nèi)源性的抗氧化多肽，可直接清除各種ROS［16］。而在腦缺血再灌注過程中，GSH 會被耗竭進而加重腦損傷［17-18］，在腦缺血再灌后外源性給予的GSH 具有神經(jīng)保護作用［19-20］。Zhu 等［21］在ch/ch細胞上證實，酸性環(huán)境（pH 6.8）可顯著抑制雙氧水誘發(fā)的GSH含量下降及氧化應激損傷。我們也同時觀察了酸后處理對GSH含量的影響。酸后處理組可逆轉OGD 再灌導致的GSH 含量下調(diào)。我們推測，酸后處理可能通過調(diào)動內(nèi)源性的ROS清除劑GSH來減少ROS的含量，進而減輕神經(jīng)損傷。然而，酸后處理調(diào)節(jié)GSH 含量的機制及其是否與抑制MPTP 開放有關仍有待進一步研究。

Figure 2. Effects of acidic post-conditioning on OGD/reperfusioninduced decrease in mitochondrial membrane potential，ROS production and cell injury in primarily cultured rat cortical neurons. A：representative photomicrographs of JC-1 fluorescence at 20 min after reperfusion in cells（red fluorescence indicates a polarized state，while green fluorescence indicates a depolarized state；scale bar=50 μm）；B：representative photomicrographs of ROS production at 20 min after reperfusion in cells using DCFH-DA as a probe（scale bar=50 μm；increased green fluorescence of the DCF indicates enhanced ROS generation）；C：the average green/red ratios for each group after JC-1 staining（n=3）；D：fluorescence intensity of DCF was measured at 20 min after reperfusion in cells using a FLUOstar Optima fluorescence plate reader（n=6）；E：cell viability 24 h after reperfusion was determined by MTT assay. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖2 酸后處理對原代大鼠皮層神經(jīng)元OGD 再灌注誘導的線粒體膜電位下降、ROS產(chǎn)生及細胞損傷的作用

Figure 3. Acidic post-conditioning inhibited OGD/reperfusioninduced ROS production by inhibiting MPTP opening in primary cultured rat cortical neurons. A and C：representative photomicrographs of ROS production in cells at 20 min after reperfusion using DCFH as a probe for ROS（scale bar=50 μm；increased green fluorescence of the DCF indicates enhanced ROS generation）；B and D：fluorescence intensity of DCF in cells was measured at 20 min after reperfusion using a FLUOstar Optima fluorescence plate reader. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group；△P＜0.01 vs PostC grpup.圖3 酸后處理通過抑制MPTP 開放減少原代大鼠皮層神經(jīng)元OGD再灌注誘導的ROS產(chǎn)生

Figure 4. Effects of acidic postconditioning on glutathione redox status after OGD/reperfusion in primary cultured ratcortical neurons. Reduced glutathione（GSH）and oxidized glutathione（GSSG）levels in the cells were measured at 20 min after reperfusion. Mean±SEM. n=4.**P＜0.01 vs CON group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖4 酸后處理對原代大鼠皮層神經(jīng)元OGD 再灌后谷胱甘肽氧化還原態(tài)改變的影響

綜上所述，酸后處理可抑制腦缺血再灌后的ROS產(chǎn)生，其機制可能與抑制MPTP開放及增加內(nèi)源性抗氧化物GSH的含量有關。該研究進一步補充了酸后處理發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制，為其防治腦缺血再灌注損傷提供了參考資料。