歐李高效再生體系的建立

楊文靜，王占軍，甘曉燕，何建龍，張 麗

（1寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，銀川 750002；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，銀川 750002）

0 引言

歐李(Cerasus humilis)是薔薇科櫻屬矮生櫻亞屬灌木，是中國特有的古老野生樹種。植株高0.4～1.5 m，花葉同開，花期4—5月，果期6—10月。產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地[1]?？垢珊?、耐瘠薄、適應(yīng)能力強，可在沙漠、荒山、鹽堿地栽植[2]；集果、仁、葉、花等綜合利用于一身，在醫(yī)藥、保健、食品、防風(fēng)固沙、美化環(huán)境等多方面具有顯著的生態(tài)、保健、藥用、觀賞價值，是將生態(tài)效益與經(jīng)濟效益有效結(jié)合的典范[3-4]。歐李果實香氣濃郁，口味獨特，不僅含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、維生素C等活性物質(zhì)，還因其鈣含量高而被稱為“鈣果”[5-8]。果仁中含有大量具有鎮(zhèn)痛止咳和抗炎作用的苦杏仁甙而作為一種常用中藥[9]。歐李生長勢旺，莖葉柔軟，葉量大，莖葉均無刺，富含糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，可作為牛羊優(yōu)質(zhì)飼料的來源[10-11]。其根系發(fā)達，具抗旱、耐貧瘠的特性，是防風(fēng)固沙、保持水土的優(yōu)良樹種[12-13]。所以，歐李全株可開發(fā)，具有很高的綜合開發(fā)利用價值和良好的發(fā)展前景。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖率高、生長周期短、管理便捷以及保持母本優(yōu)良性狀等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于各大花卉生產(chǎn)基地及科學(xué)研究領(lǐng)域。歐李通常以異花授粉為主，種子育苗變異系數(shù)非常大，扦插會受到季節(jié)和溫度的影響，所以，組織培養(yǎng)是有效實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的最佳路徑。1994年錢國珍等[14]就以嫩莖和葉誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織再分化誘導(dǎo)不定芽開始了歐李組培繁殖的研究，并分別篩選了葉和莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基，認為葉愈傷組織誘導(dǎo)以MS+1.2 mg/L NAA+0.16 mg/L BA效果最好；莖段愈傷組織誘導(dǎo)以MS+0.4 mg/L 2,4-D+0.08 mg/L ZT效果最好；誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基是1/4MS+2 mg/L ZT。其后，越來越多的研究者對不同品種歐李組織培養(yǎng)體系進行優(yōu)化。杜國榮[15]以葉片為外植體、李勁等[16]以莖葉為外植體經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、焦淑華等[17]以綠枝為外植體、王正德等[18]以幼莖為外植體，研究了不同外植體的再生效率，目前認為，新生帶有腋芽的幼嫩莖段作為外植體能夠獲得較好的再生效率。賈海燕等[19]以‘京歐1號’、‘京歐2號’為材料的研究認為，誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最適繼代擴繁培養(yǎng)基‘京歐1號’為MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA，‘京歐2號’為MS+0.1 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA；較適宜生根培養(yǎng)基‘京歐1號’為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA，‘京歐2號’為1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L IAA。孫曉麗[20]以‘歐李2號’增殖培養(yǎng)階段試管苗為試材，篩選認為最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+6 g/L瓊脂+40 g/L蔗糖。劉天牧等[21]以歐李‘大磨盤’為材料的研究認為，適宜啟動培養(yǎng)的生長素為IBA，并篩選得到最佳叢生芽培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，最佳分化培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。這些研究都表明，在歐李分化和增殖階段6-BA是關(guān)鍵的激素。其中，劉天牧等[22]篩選的擴繁培養(yǎng)基將歐李繁育速度提高了20倍，并申報科技成果，為歐李推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究針對目前歐李種苗品種混雜、質(zhì)量良莠不齊等現(xiàn)狀，人工繁育存在再生頻率低、生根難、移栽成活率低等技術(shù)瓶頸，通過外植體的處理、分化、生根等階段的培養(yǎng)，篩選最適基本培養(yǎng)基、激素配比和濃度，確定歐李3個品種（系）的再生體系，以期為歐李高效快速規(guī)模化繁殖提供技術(shù)性支持。

1 材料與方法

1.1 材料

寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞所田間種植的3個歐李優(yōu)良種質(zhì)資源SN6、SN7、YC24。

1.2 方法

1.2.1 材料表面消毒和接種 田間剪取歐李苗木上部嫩枝，流水沖洗10 min，置于無菌操作臺，75%乙醇浸泡30 s后，立刻用無菌水漂洗3～4次；0.1%升汞浸泡8 min，再用無菌水漂洗5～6次；接著用無菌濾紙吸干嫩枝多余水分，剪成含有2個腋芽以上的莖段（莖段長為2～5 cm），最后接種到培養(yǎng)基上，在貫流組培箱培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照條件16 h黑暗/8 h光照，光照強度2000 lx。

（1）分化培養(yǎng)基。4.42 g/LMS、30 g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂，添加4種植物生長調(diào)節(jié)劑構(gòu)成4種不同分化培養(yǎng)基，如表1，調(diào)節(jié)pH 5.8左右。每個處理重復(fù)3次，40天后觀察分化情況并統(tǒng)計分化率[式(1)]和分化系數(shù)[式(2)]。

表1 分化培養(yǎng)基激素組合

（2）生根培養(yǎng)基。4.42 g/L1/2MS、30 g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂，添加3種不同的植物生長調(diào)節(jié)劑和1種附加物，配制11種生根培養(yǎng)基，如表2，調(diào)節(jié)pH 5.8左右。每個處理重復(fù)3次，40天后觀察生根情況并統(tǒng)計生根率[式(3)]。

表2 生根培養(yǎng)基激素組合

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 選用SPSS 13.0 One-Way ANOVE程序完成數(shù)據(jù)采集，用Duncan檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素濃度對歐李外植體內(nèi)生菌的影響

植物組織培養(yǎng)中，內(nèi)生菌造成的污染是影響植物再生體系建立的重要限制因素。為有效消除歐李外植體內(nèi)生菌，提高成活率，減少污染率，在培養(yǎng)基中添加4種不同濃度的頭孢霉素。如表3，隨著頭孢霉素濃度的提高，外植體的污染率逐漸降低，成活率顯著提高。頭孢霉素濃度為100 mg/L時，外植體成活率最高，污染率最低。

表3 頭孢霉素濃度對歐李外植體內(nèi)生菌的影響

2.2 歐李的分化培養(yǎng)

將消毒滅菌后的莖段外植體接種于不同激素組合的培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)。10天后腋芽部形成幼小再生株系，40天后形成叢生芽（圖1）。統(tǒng)計不同品種在不同激素組合上的分化率，結(jié)果如圖2。激素組合1和2在3個品種中的分化率都較好，其中2號組合表現(xiàn)最佳。就品種而言，YC24的分化率最高，SN6次之，SN7最低。根據(jù)結(jié)果，認為2號激素組合是適宜本地種植的3個優(yōu)良種質(zhì)的最佳分化培養(yǎng)基。

圖1 分化培養(yǎng)過程

圖2 3個歐李品種在不同激素組合培養(yǎng)基上的分化情況

2.3 分化周期對歐李增殖的影響

將歐李繼代培養(yǎng)于篩選出的分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間設(shè)置為20、25、30、35、40、45天，各處理連續(xù)繼代5次，觀察統(tǒng)計繼代周期對歐李增殖分化影響。結(jié)果（圖3）表明，隨著繼代周期的延長，叢生芽苗的生長勢增強，繼代周期為30～35天的芽苗的生長分化速度最快。繼代超過40天，芽的生長速度明顯減慢。因此，確定芽苗在增殖過程中繼代周期以30～35天為宜。

圖3 不同繼代周期對增殖培養(yǎng)影響

2.4 歐李的生根培養(yǎng)

將分化培養(yǎng)所得的組培苗接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10天左右可觀察到白色不定根，40天左右根系較發(fā)達、分支多（圖4）。各培養(yǎng)基的生根率如表4，激素組合6號和7號在3個品種中的生根率較其他組合有顯著差異。其中SN6的最高生根率可達67.0%，SN7和YC24最高生根率為33.1%、30.0%。因此，認為3號激素組合培養(yǎng)基是SN6的最適生根培養(yǎng)基，但SN7和YC24生根效果不理想。

圖4 生根培養(yǎng)過程

表4 3個歐李品種在不同激素組合培養(yǎng)基上的生根率 %

2.5 矮壯素對歐李生長的影響

針對優(yōu)良品系SN7和YC24組培過程中生根速度慢、生根率低、苗細弱等問題，以生根率較高的6號激素組合生根培養(yǎng)基為對照，設(shè)計添加3種不同濃度的矮壯素(CCC)處理，30天后觀察統(tǒng)計不同處理對優(yōu)良品種（系）生根情況。結(jié)果表明，添加CCC后，歐李株高顯著降低，莖稈表現(xiàn)較未加CCC粗壯，葉片顯著增大（圖5）；隨著CCC濃度的增加，生根率呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，當(dāng)CCC濃度達到15 mg/L時，對歐李生根具有顯著的促進作用，YC24、SN7生根率分別達到53.3%和46.7%，分別較對照提高了23.3和13.7個百分點（表5）。綜上，初步篩選獲得了適合歐李優(yōu)良品種（系）壯苗與生根一步培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

圖5 矮壯素對生長的影響

表5 矮壯素對歐李優(yōu)良品種組培苗生長指標(biāo)的影響

3 結(jié)論

研究明確了不同抗菌素濃度對3個歐李優(yōu)良品種（系）內(nèi)生菌的抑制效果，有效降低了外植體污染率。篩選獲得適宜歐李分化與增殖培養(yǎng)的激素組合和分化周期，3個優(yōu)良品種（系）分化系數(shù)均達14以上。在明確11種激素組合對歐李生根培養(yǎng)影響的基礎(chǔ)上，針對YC24等優(yōu)系生根率低、速度慢等問題，篩選獲得了生根壯苗一步培養(yǎng)基，使組培苗生根率由25.0%提高至53.3%。

試驗通過探索外植體表面消毒、分化和生根的最適培養(yǎng)基和濃度，建立了歐李嫩枝快速繁殖體系，確定了適宜本地種植的3個優(yōu)良種質(zhì)的最適培養(yǎng)基和激素濃度。為優(yōu)良種質(zhì)的后續(xù)練苗移栽、擴大培養(yǎng)和推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 討論

利用植物組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)，可以在很短時間內(nèi)建立高效的快速繁殖體系，但是在離體快繁過程中，特別是初代啟動培養(yǎng)過程中，外植體的帶菌狀況會直接影響培養(yǎng)體系的建立，所以有必要對采自田間的外植體消毒滅菌。目前關(guān)于外植體的消毒研究主要集中在消毒劑的選擇與消毒時間探索[23-25]，本試驗在結(jié)合前人探索的基礎(chǔ)上，在初代培養(yǎng)過程中加入100 mg/L頭孢霉素，進一步降低了污染率、提高了成活率，為無菌培養(yǎng)體系奠定了基礎(chǔ)。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物細胞的分裂、分化產(chǎn)生影響。一定濃度配比的細胞分裂素和生長素對叢生芽的誘導(dǎo)、增殖和生根發(fā)揮著重要作用[26]。分化培養(yǎng)階段，細胞分裂素IBA的存在較生長素NAA有更高的分化率，說明細胞分裂素在歐李外植體分化階段起著至關(guān)重要的作用。而較高濃度的細胞分裂素ZT與IBA的組合使用，能夠獲得更高的分化率。IBA濃度與梁偉玲[27]的結(jié)果相同，不同之處在于本試驗添加ZT獲得了更高的分化率。生根培養(yǎng)階段，較低濃度的IBA有利于根形成，這與杜艷豐[28]1.0 mg/L IBA是最適生根濃度的結(jié)果不同。這可能是由于歐李品系不同，枝條生長特性有差異。適當(dāng)濃度的生長素NAA能夠促進生根率提高，表明生長素有利于根的生成，這與邢一帆[29]在其研究中生根培養(yǎng)階段NAA具有關(guān)鍵作用的結(jié)論一致。生根培養(yǎng)時加入少量活性炭，能夠防止褐變，并通過創(chuàng)造黑暗環(huán)境和吸附非極性物質(zhì)和色素等有害物質(zhì)而有利于生根[30]。但活性炭的濃度加入超過1.0 g/L時，會使外植體變黃，逐漸枯死。許建蘭[31]在以Damas1869李腋芽為材料的研究中，加入0.05%活性炭獲得了最佳的生根效率。本試驗中加入0.2 g/L獲得了較好的生根率。趙文魁[32]的研究表明，適量濃度的矮壯素對馬鈴薯脫毒試管苗有較好的生根壯苗效果。在木本植物楊樹的組培過程中添加適量濃度的矮壯素能夠促進其生根并提高移栽成活率[33]。本試驗中篩選得出歐李優(yōu)良品種的最適矮壯素添加濃度為15 mg/L。

本試驗以引進和自育的歐李優(yōu)良品種（品系）為研究對象，通過系統(tǒng)研究芽誘導(dǎo)、增殖、生根等組織培養(yǎng)中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，建立高效的組培快繁技術(shù)體系，為歐李快速規(guī)模化繁育提供技術(shù)支撐。其中歐李組培苗生根培養(yǎng)是工廠化種苗繁育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，針對歐李生根速度慢、生根率的問題，通過調(diào)整生根培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素配比，添加附加物等方法，篩選獲得了生根壯苗一步培養(yǎng)法，有效縮短了生根時間，大幅提高了生根率，為歐李組培高效快繁體系的建立提供了參考。