pH對(duì)毛蕊花糖苷穩(wěn)定性影響及降解產(chǎn)物分析

武改麗，霍志鵬，王 玉，張依倩，劉元雪，黃芝娟，李瑞明，何 毅*

pH對(duì)毛蕊花糖苷穩(wěn)定性影響及降解產(chǎn)物分析

武改麗1, 2, 3，霍志鵬1, 2, 3，王 玉2, 3, 4，張依倩2, 3，劉元雪2, 3，黃芝娟2, 3，李瑞明2, 3，何 毅2, 3*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 2. 天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研究院 現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410 3. 天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司 創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410 4. 天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072

研究不同pH條件下毛蕊花糖苷的降解規(guī)律，鑒定降解產(chǎn)物并推測(cè)降解途徑。采用HPLC-UV法研究毛蕊花糖苷在不同pH下的降解規(guī)律；采用高效液相色譜-離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-IT-TOF-MS）鑒定其降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.5%醋酸水溶液（A）-甲醇（B），體積流量1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL；質(zhì)譜分析使用電噴霧離子源（ESI），在正離子模式下掃描，掃描范圍均為/100～800。通過比較毛蕊花糖苷在不同pH條件下色譜峰面積，分析其降解規(guī)律；并通過對(duì)照品比對(duì)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)等對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。在不同pH緩沖溶液中，毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷降解速率隨pH值的增加而加快，降解產(chǎn)物有水解產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物及同分異構(gòu)體異毛蕊花糖苷等。分析了不同pH條件下毛蕊花糖苷的降解規(guī)律、降解產(chǎn)物和降解途徑，研究結(jié)果可為含毛蕊花糖苷的中藥的質(zhì)量控制提供參考。

毛蕊花糖苷；異毛蕊花糖苷；pH；穩(wěn)定性；降解規(guī)律；降解產(chǎn)物

車前子是中醫(yī)常用的利尿通淋藥，《中國(guó)藥典》2020年版車前子項(xiàng)下含量測(cè)定要求檢測(cè)毛蕊花糖苷，且含量不低于0.4%[1]。研究表明車前子中毛蕊花糖苷會(huì)受溫度、加熱時(shí)間、pH等影響而發(fā)生變化[2-6]。谷彩梅等[2]分析了車前子鹽炙品與生品，發(fā)現(xiàn)炮制后的車前子中毛蕊花糖苷含量升高，同時(shí)鹽炙品中異毛蕊花糖苷含量變化顯著。田偉等[3]發(fā)現(xiàn)車前子中的毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量隨煎煮時(shí)間、溫度、pH值的變化發(fā)生一定程度的變化，推測(cè)毛蕊花糖苷可能發(fā)生酯鍵斷裂生成咖啡酸，并部分轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷。本實(shí)驗(yàn)以毛蕊花糖苷為研究對(duì)象，深入研究pH對(duì)毛蕊花糖苷穩(wěn)定性的影響，明確其變化規(guī)律及可能的轉(zhuǎn)化機(jī)制。

毛蕊花糖苷是車前子中主要的苯乙醇苷類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，為連接咖啡?；谋揭掖级擒铡，F(xiàn)代藥理研究表明，毛蕊花糖苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，能修復(fù)阿爾茨海默病的受損神經(jīng)元，改善學(xué)習(xí)和記憶功能[7-9]；能通過抑制間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（c-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）的表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲起到殺死腫瘤的作用[10]；此外毛蕊花糖苷還具有抗炎[11]、抗氧化[12]、抗病原微生物[13]等作用。毛蕊花糖苷在植物中廣泛存在，其毒性小、生物活性多樣，因而具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。但毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)酚羥基，易被氧化，化學(xué)穩(wěn)定性較差，限制了它的臨床應(yīng)用。為了進(jìn)一步探索毛蕊花糖苷的降解特征和降解途徑，本研究采用高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）和高分辨質(zhì)譜（HPLC-IT- TOF-MS）技術(shù)分析了毛蕊花糖苷在不同pH溶液中加熱降解速率，并鑒定了降解產(chǎn)物，初步闡明了其降解規(guī)律。

圖1 毛蕊花糖苷(A) 與異毛蕊花糖苷(B) 結(jié)構(gòu)

1 材料與儀器

1.1 儀器

Prominence型超快速高效液相色譜離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括LC-20AD型二元泵，SLI-20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A型柱溫箱，SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司），安捷倫1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），XS205DU型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），ST16R型冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾公司），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司），KQ-500DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SevenEasy S20 pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

毛蕊花糖苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)19082201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）、異毛蕊花糖苷（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq20050603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.3%）、磷酸二氫鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20190904，分析純）、無水磷酸氫二鈉（天津市威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司，批號(hào)20140411，分析純）、冰乙酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20200301，色譜純）、甲醇（默克公司）、實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.5%醋酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～40 min，5%～60%B；40～50 min，5%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，體積流量為1 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離離子源（ESI），正離子模式掃描，正離子模式下噴霧電壓設(shè)定為4.5 kV，一級(jí)、二級(jí)離子掃描范圍均為/100～800，采用三氟乙酸鈉作為校正液，霧化氣為氮?dú)猓w積流量為1.5 mL/min，碰撞誘導(dǎo)解離能量50%；曲型脫溶劑管溫度200 ℃，離子累積時(shí)間為30 ms，檢測(cè)器電壓1.75 kV。

2.3 溶液配制

2.3.1 毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液 稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加20%甲醇水溶解，并定容至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 異毛蕊化糖苷對(duì)照品溶液 稱取異毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加20%甲醇水溶解，并定容至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 磷酸緩沖液 分別稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉適量，以水為溶劑，配制pH 5、6、7的磷酸緩沖溶液。

2.4 毛蕊花糖苷降解實(shí)驗(yàn)

精密量取“2.3.1”項(xiàng)毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液，分別與pH5、6、7磷酸緩沖液混勻（2∶1），振蕩搖勻后于沸水浴中反應(yīng)，按0、30、60、90、120、150、180、210、240、300 min時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取反應(yīng)液500 μL于1.5 mL離心管中，離心（12 000 r/min，10 min），取上清液于2 mL棕色液相小瓶中。

2.5 毛蕊花糖苷降解規(guī)律分析

對(duì)“2.3.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)樣品，采用HPLC技術(shù)進(jìn)行分析，色譜圖見圖2。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，每個(gè)取樣點(diǎn)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制其在加熱過程中變化規(guī)律，見圖3。從圖3可見，pH值越高，毛蕊花糖苷降解速度越快。其中pH5時(shí)毛蕊花糖苷降解緩慢，pH 7在90 min時(shí)毛蕊花糖苷幾乎全部降解；異毛蕊花糖苷在pH 5時(shí)，其含量呈升高趨勢(shì)，隨pH升高后，其含量先升高后降低，說明毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在接近中性的水溶液中容易降解，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷適合在低pH條件下保存。在不同pH條件下，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷二者總含量均在降低，推測(cè)毛蕊花糖苷在降解過程中，生成異毛蕊花糖苷和其他降解產(chǎn)物，異毛蕊花糖苷在較高pH值還會(huì)繼續(xù)降解成其他產(chǎn)物。

pH 5、6、7條件下毛蕊花糖苷的降解動(dòng)力學(xué)擬合見圖4。毛蕊花糖苷在pH 5時(shí)降解方程為＝0.002＋0.005 4，2＝0.999 1；在pH 6時(shí)降解方程為＝0.013＋0.28，2＝0.988 3；在pH 7時(shí)降解方程為＝0.182 6＋0.327，2＝0.865 1；毛蕊花糖苷?ln（t/0）與的關(guān)系函數(shù)斜率即pH 5、6、7中毛蕊花糖苷的反應(yīng)速率常數(shù)k呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且pH 5、6中毛蕊花糖苷?ln（t/0）與的線性相關(guān)系數(shù)（2）均接近1，可見相關(guān)性很好，降解反應(yīng)屬于一級(jí)反應(yīng)；pH 7降解速率較快，數(shù)據(jù)較少，2為0.865 1。pH 5、6、7條件下毛蕊花糖苷的降解半衰期分別為346.5、51.9、3.73 min。隨pH值增加，毛蕊花糖苷的降解反應(yīng)速率增大，半衰期減小。通過分析毛蕊花糖苷在不同pH條件下降解反應(yīng)常數(shù)及其半衰期，提示在低pH條件下毛蕊花糖苷穩(wěn)定下較好，適合在低pH條件下保存。

A-毛蕊花糖苷溶液（pH 6，加熱180 min） B-毛蕊花糖苷溶液（pH 6，加熱60 min） C-異毛蕊花糖苷 D-毛蕊花糖苷

MRHTG-毛蕊花糖苷 YMRHTG-異毛蕊花糖苷 M＋YM-毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷總面積

圖4 不同pH條件下毛蕊花糖苷?ln (Ct/C0) 與t關(guān)系圖

2.6 降解產(chǎn)物的HPLC-IT-TOF-MS鑒定

對(duì)“2.3.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)樣品，采用HPLC-IT-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行分析。典型樣品的總體離子流圖見圖5，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間、質(zhì)荷比及裂解規(guī)律信息推斷化合物結(jié)構(gòu)。毛蕊花糖苷降解產(chǎn)物的HPLC-IT-TOF-MS信息見表1。

2.6.1 毛蕊花糖苷原形 峰15，保留時(shí)間為26.245 min，其準(zhǔn)分子離子峰為/642.238 1 [M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H36O15，誤差為?2.6×10?6，峰15與毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷相對(duì)分子質(zhì)量相同；在MSE質(zhì)譜圖中，主要碎片有脫去1羥基酪醇（C8H10O3，154）的碎片/471.151 5 [M＋H－NH4－C8H10O3]+以及脫去1鼠李糖基的（C6H10O4，146）碎片/325.091 8 [M＋H－C8H10O3－C6H10O4]+，可能的裂解規(guī)律見圖6。通過與毛蕊花糖苷對(duì)照品比對(duì)，鑒定峰15為毛蕊花糖苷。

2.6.2 異構(gòu)化產(chǎn)物 峰19，保留時(shí)間為28.412 min，其準(zhǔn)分子離子峰為/642.237 9 [M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H36O15，誤差為?3.0×10?6，峰19與毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷相對(duì)分子質(zhì)量相同；在MSE質(zhì)譜圖中，主要碎片離子/625.211 5 [M＋H]+，/471.150 0 [M＋H－C8H10O3]+，/325.093 3 [M＋H－C8H10O3－C6H10O4]+，同峰15的裂解規(guī)律相同，通過與異毛蕊花糖苷對(duì)照品比對(duì)，鑒定峰19為異毛蕊花糖苷。

A-毛蕊花糖苷溶液（pH 7，加熱90 min） B-毛蕊花糖苷溶液（pH 6，加熱180 min） C-毛蕊花糖苷溶液（pH6，加熱60 min） D-異毛蕊花糖苷 E-毛蕊花糖苷

2.6.3 水解產(chǎn)物 毛蕊花糖苷在加熱過程中發(fā)生水解反應(yīng)，可能水解掉咖啡酰基、鼠李糖基、羥基酪醇等結(jié)構(gòu)，水解產(chǎn)物包括峰6、7、8。

峰6，保留時(shí)間為11.645 min，準(zhǔn)分子離子峰為/480.209 0 [M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C20H30O12，誤差為1.9×10?6，峰6相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了1咖啡?；–9H6O3，162）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去一羥基酪醇（C8H10O3，154）產(chǎn)生的碎片/309.112 9 [M＋H－C8H10O3－NH4]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰6為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷水解掉一咖啡?；–9H6O3，162）的產(chǎn)物，其可能的裂解規(guī)律見圖7。

峰8，保留時(shí)間為12.812 min，準(zhǔn)分子離子峰為/506.184 6 [M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C21H28O13，誤差為?2.3×10?6，峰8相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了1羥基酪醇（C8H10O3，154）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去1咖啡酰基（C9H6O3，162）產(chǎn)生的碎片/325.090 7 [M＋H－C9H6O3]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰8為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷水解掉1羥基酪醇（C8H10O3，154）的產(chǎn)物，其可能的裂解規(guī)律見圖8。毛蕊花糖苷在加熱過程中生成的水解產(chǎn)物還包括峰7、10、18，其可能的結(jié)構(gòu)見圖9。

表1 毛蕊花糖苷降解產(chǎn)物的HPLC-IT-TOF-MS分析(pH6)

Table 1 HPLC-IT-TOF-MS analysis of degradation products of verbascoside (pH6)

序號(hào)tR/min分子式實(shí)測(cè)值（m/z）誤差（×10?6）MS/MS（m/z）化合物 11.378C11H8O6237.040 2[M＋H]+3.5 未知 22.212C7H8O6206.066 7[M＋NH4]+1.1189.037 4 [M＋H－NH4]+, 171.032 4 [M＋H－NH4－H2O]+未知 32.512C14H24O12402.159 8[M＋NH4]+?3.4309.111 0, 273.101 1, 147.248 0未知 43.378C7H6O5171.029 4[M＋H]+3.5 沒食子酸 58.245C10H16O5234.134 1[M＋NH4]+?0.2 未知 611.645C20H30O12480.209 0[M＋NH4]+1.9463.181 6 [M＋H－NH4]+, 309.112 9 [M＋H－NH4－C8H10O3]+水解掉1分子咖啡?；a(chǎn)物 712.312C14H20O7318.154 4[M＋NH4]+?2.8301.130 6 [M＋H－NH4]+, 121.063 6 [M＋H－NH4－C6H12O6]+水解掉1分子咖啡?；褪罄钐腔a(chǎn)物 812.812C21H28O13506.186 2[M＋NH4]+?2.3325.091 3 [M＋H－C9H6O3]+水解掉1分子羥基酪醇產(chǎn)物 916.912C29H32O16654.200 0[M＋NH4]+?5.2637.184 1 [M＋H－NH4]+, 491.118 3 [M＋H－NH4－C6H10O4]+, 329.062 2 [M＋H－NH4－C6H10O4－C9H6O3]+鄰苯酚羥基氧化產(chǎn)物 1018.012C15H18O9343.103 9[M＋H]+4.5325.089 2 [M＋H－H2O]+, 163.039 8 [M＋H－H2O－C6H8O5]+水解掉1分子鼠李糖基和羥基酪醇的鄰苯酚羥基氧化產(chǎn)物 1121.245C23H28O13513.160 5[M＋H]+0.4325.092 4 [M＋H－H2O]+, 307.081 4 [M＋H－2H2O]+, 163.043 3 [M＋H－C14H22O10]+未知 1222.612C29H34O15640.223 1[M＋NH4]+?1.6623.197 9 [M＋H－NH4]+, 477.137 4 [M＋H－NH4－C6H10O4]+, 459.127 5 [M＋H－NH4－C6H10O4－H2O]+, 315.085 3 [M＋H－NH4－C6H10O4－C9H6O3]+鄰苯酚羥基氧化產(chǎn)物 1323.212C17H12O6313.070 4[M＋H]+?0.9295.055 9 [M＋H－H2O]+未知 1425.012C29H34O15640.224 8[M＋NH4]+1.0623.197 4 [M＋H－NH4－2H]+, 477.140 4 [M＋H－NH4－C6H10O4]+, 459.129 9 [M＋H－NH4－C6H10O4－H2O]+, 315.086 1 [M＋H－NH4－C6H10O4－C9H6O3]+鄰苯酚羥基氧化產(chǎn)物 1526.245C29H36O15642.238 1[M＋NH4]+?2.6625.222 8 [M＋H－NH4]+, 471.151 5 [M＋H－C8H10O3－NH4]+, 325.091 8 [M＋H－C8H10O3－C6H10O4－NH4]+毛蕊花糖苷原型 1627.012C29H34O15640.223 3[M＋NH4]+?1.3623.208 3 [M＋H－NH4－2H]+, 477.137 0 [M＋H－NH4－C6H10O4]+, 459.137 3 [M＋H－NH4－C6H10O4－H2O]+, 315.087 5 [M＋H－NH4－C6H10O4－C9H6O3]+鄰苯酚羥基氧化產(chǎn)物 1727.580C16H28O7350.216 4[M＋NH4]+?4.2 未知 1827.862C23H24O11477.140 7[M＋H]+3.3297.076 1 [M＋H－C6H12O6]+, 163.048 7 [M＋H－C6H12O6－C6H8O5]+水解1分子鼠李糖基的鄰苯酚羥基氧化產(chǎn)物 1928.412C29H36O15642.237 9[M＋NH4]+?3.0625.211 5 [M＋H－NH4]+, 471.150 0 [M＋H－C8H10O3－NH4]+, 325.093 3 [M＋H－C8H10O3－C6H10O4－NH4]+異毛蕊花糖苷

2.6.4 氧化產(chǎn)物 研究[14-15]表明，鄰苯酚類化合物在過量氧存在時(shí)會(huì)發(fā)生自氧化，生成相應(yīng)的半醌或醌類化合物。毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中均有2個(gè)鄰苯酚存在，在過量氧存在時(shí)，發(fā)生自氧化。由于結(jié)構(gòu)中鄰苯酚位置不同，因此氧化產(chǎn)物不同，分別為峰9、10、12、14、16和18。

峰9，保留時(shí)間為16.912 min，準(zhǔn)分子離子峰為/654.200 8 [M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H32O16，誤差為?5.2×10?6，峰9相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了4個(gè)H（4H）、加了1羥基（OH）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去1鼠李糖基（C6H10O4，146）產(chǎn)生的碎片/491.118 3 [M＋H－NH4－C6H10O4]+，再脫去1咖啡?；–9H6O3，162）產(chǎn)生的碎片/329.062 2 [M＋H－NH4－C6H10O4－C9H6O3]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰9為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷2個(gè)鄰苯酚羥基均被氧化的產(chǎn)物，其可能的裂解規(guī)律見圖10。

圖8 峰8可能的裂解途徑及MS/MS圖

圖9 峰7 (A)、10 (B)、18 (C) 可能的結(jié)構(gòu)

峰12，保留時(shí)間為22.612 min，準(zhǔn)分子離子峰為/640.223 1 [M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H34O15，誤差為?1.6×10?6，峰12相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了2個(gè)H（2H）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去1鼠李糖基（C6H10O4，146）產(chǎn)生的碎片/477.137 4 [M＋H－NH4－C6H10O4]+，再脫去1咖啡?；–9H6O3，162）產(chǎn)生的碎片離子為/315.085 3 [M＋H－NH4－C6H10O4－H2O－C9H6O3]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰初步推測(cè)峰12為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷鄰苯酚羥基被氧化的產(chǎn)物；峰12、14和16有相同碎片和裂解規(guī)律，推測(cè)三者可能是同分異構(gòu)體，其可能的裂解途徑見圖11。

2.6.5 其他類 毛蕊花糖苷在加熱過程中發(fā)生水解、氧化反應(yīng)，還可能發(fā)生聚合、還原等其他反應(yīng)。峰4準(zhǔn)分子離子峰為/171.029 4 [M＋H]+，推測(cè)的分子式為C7H6O5，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷及參考文獻(xiàn)報(bào)道[16]，鑒定峰4為沒食子酸。圖12為推測(cè)峰4、11、13可能的結(jié)構(gòu)。

峰11，保留時(shí)間為21.245 min，準(zhǔn)分子離子峰為/513.160 5 [M＋H]+，誤差為0.4×10?6，推測(cè)峰11可能是由毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中鄰苯酚羥基發(fā)生氧化，再失去1苯二酚（C6H6O2，110）產(chǎn)生的化合物C23H28O13。峰13，保留時(shí)間為23.212 min，準(zhǔn)分子離子峰為313.070 4 [M＋H]+，誤差為?0.9×10?6，推測(cè)峰13可能是由碎片咖啡酸（C9H8O4，180）和羥基酪醇（C8H10O3，154）結(jié)合生成的化合物C17H12O6。圖13為峰11、13可能的生成途徑。

3 討論

多酚中特殊的多酚羥基結(jié)構(gòu)，尤其是鄰位酚羥基，在堿性條件下容易氧化，使多酚的應(yīng)用受到了很大的限制[17-18]。毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中存在4個(gè)酚羥基，在不同pH條件下，毛蕊花糖苷存在不同程度的降解。在弱酸性條件下，毛蕊花糖苷溶液降解緩慢；在pH 7條件下其降解加快，且在90 min時(shí)幾乎全部降解。Zhou等[19]研究表明在常溫條件下，毛蕊花糖苷水溶液在pH 5條件下比在pH 9條件下穩(wěn)定，降解速率慢，高pH降解速率加快。此研究結(jié)論與本研究結(jié)果一致，但本研究還鑒定了其降解產(chǎn)物，并對(duì)降解途徑做了系統(tǒng)的推測(cè)，見圖14。毛蕊化糖苷降解可能的途徑包括異構(gòu)、水解、氧化等。研究結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷可部分降解為異毛蕊花糖苷，毛蕊花糖苷與生成的異毛蕊花糖苷繼續(xù)發(fā)生水解及氧化等降解反應(yīng)，異毛蕊花糖苷含量在pH較高時(shí)呈先升高再降低趨勢(shì)，水解與氧化降解的比例隨pH升高增加。

圖12 峰4、11、13可能的結(jié)構(gòu)

圖13 峰11 (A)、13 (B) 可能的生成途徑

田偉等[3]的研究顯示，車前子煎煮過程中毛蕊花糖苷含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，且隨時(shí)間的增加，其含量繼續(xù)降低，異毛蕊花糖苷含量在煎煮過程中呈增加的趨勢(shì)。本研究前期對(duì)車前子水煎液的pH進(jìn)行了測(cè)定，其pH值為6.2，介于本試驗(yàn)考察的pH 6與7條件之間，推測(cè)車前子水煎液中毛蕊花糖苷的變化規(guī)律可能與本研究結(jié)果相似。毛蕊花糖苷的降解產(chǎn)物可能在車前子水煎液存在并發(fā)揮藥效，提示應(yīng)關(guān)注車前子、地黃、肉蓯蓉等含毛蕊花糖苷藥材的煎液中毛蕊花糖苷的降解產(chǎn)物。

本研究結(jié)果顯示毛蕊花糖苷在弱酸性條件向異毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化率較高?，F(xiàn)代藥理研究表明，毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用[20]；毛蕊花糖苷具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]，異毛蕊花糖苷可能通過上調(diào)神經(jīng)型尼古丁受體亞單位蛋白來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]，毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷均具有抗氧化作用[22]；毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷具有相似的藥理活性，因此建議開展毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷相關(guān)藥效等效性試驗(yàn)，明確二者藥效關(guān)系。

本研究探討了影響毛蕊花糖苷穩(wěn)定性的因素并對(duì)其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，為毛蕊花糖苷提取、純化及車前子、地黃、肉蓯蓉等富含毛蕊花糖苷的中藥的質(zhì)量控制提供了參考。

圖14 毛蕊花糖苷的可能降解途徑

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 69-70.

[2] 谷彩梅, 王增繪, 鄭司浩, 等. 基于UPLC-Q-TOF/MS法分析車前子生品和鹽炙品化學(xué)成分研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2016, 18(1): 77-81.

[3] 田偉, 甄亞欽, 董秋菊, 等. 車前子煎煮過程中4種化學(xué)成分含量變化規(guī)律研究 [J]. 中國(guó)新藥雜志, 2018, 27(16): 1927-1931.

[4] 曾金祥, 許兵兵, 王娟, 等. 車前子中毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷降低急性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平及其機(jī)制 [J]. 中成藥, 2016, 38(7): 1449-1454.

[5] 盧丹逸, 黃婉茹, 馬志國(guó). 鹽炙對(duì)車前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量的影響 [A]//2014年全國(guó)中藥炮制學(xué)術(shù)年會(huì)暨中藥飲片創(chuàng)新發(fā)展論壇及協(xié)同創(chuàng)新聯(lián)盟會(huì)議論文集 [C]. 南京: 中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì), 2014: 176.

[6] 許兵兵, 黃碧濤, 曾金祥, 等. 車前子及車前草中毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷的含量比較 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2016, 22(18): 64-67.

[7] 王建, 李曉琳, 李茂星, 等. 苯乙醇苷類化合物通過PI3K/Akt/mTOR-HIF-1α信號(hào)通路對(duì)高原低氧大鼠認(rèn)知功能損傷的保護(hù)作用 [J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2020, 47(12): 1137-1145.

[8] 胡航. 毛蕊花糖苷對(duì)阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)治療作用研究 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 18(12): 21-24.

[9] 曲彥潔, 甄蓉蓉, 安紅梅. 毛蕊花糖苷治療神經(jīng)退行性疾病作用及機(jī)制 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2021, 39(2): 69-72.

[10] Hei B, Wang J, Wu G Y,. Verbascoside suppresses the migration and invasion of human glioblastoma cells via targeting c-Met-mediated epithelial-mesenchymal transition [J]., 2019, 514(4): 1270-1277.

[11] Pesce M, Franceschelli S, Ferrone A,. Verbascoside down-regulates some pro-inflammatory signal transduction pathways by increasing the activity of tyrosine phosphatase SHP-1 in the U937 cell line [J]., 2015, 19(7): 1548-1556.

[12] 熊麗娜, 毛淑琴, 陸柏益, 等. 桂花提取物及毛蕊花糖苷抗-半乳糖致小鼠衰老作用研究 [A] //中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第十一屆年會(huì)論文集 [C]. 杭州: 中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì), 2014: 139-140.

[13] 趙小然. β-谷甾醇和毛蕊花糖苷對(duì)肺炎鏈球菌溶血素的抑制作用及機(jī)制 [D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2017.

[14] 彭素萍, 鞏珺, 苗瑞娟, 等. 連翹酯苷B與毛蕊花糖苷穩(wěn)定性研究 [J]. 今日藥學(xué), 2012, 22(6): 326-328.

[15] 袁倬斌, 高若梅. 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究 [J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 18(9): 1438-1441.

[16] 周丹丹, 鄒秦文, 林瑞超. 基于超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜的胃復(fù)春片化學(xué)成分研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2020, 15(13): 1841-1848.

[17] 張阿惜, 連英竹, 沈月峰, 等. 不同溫度、pH、光照條件下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué) [J]. 食品工業(yè)科技, 2020, 41(21): 48-52.

[18] 陳曉云, 張峻, 吉偉之, 等. 高溫操作及貯存過程中葡萄多酚的穩(wěn)定性 [J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 9(2): 18-21.

[19] Zhou F, Zhao Y J, Li M Q,. Degradation of phenylethanoid glycosides inLour. flowers and its effect on anti-hypoxia activity [J]., 2017, 7(1): 10068.

[20] 唐永富, 黃丹菲, 謝明勇, 等. 毛蕊花苷和異毛蕊花苷對(duì)樹突狀細(xì)胞增殖的影響 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2008, 43(23): 1785-1787.

[21] 齊曉嵐, 肖海濤, 肖雁, 等. 松果菊苷及異麥角甾苷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞尼古丁受體表達(dá)的影響 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2011, 22(7): 1561-1563.

[22] 楊建華, 胡君萍, 熱娜·卡斯木, 等. 肉蓯蓉屬植物中六種苯乙醇苷類化合物抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究 [J]. 中藥材, 2009, 32(7): 1067-1069.

Effect of pH on tability of verbascoside and analysis degradation products

WU Gai-li1, 2, 3, HUO Zhi-peng1, 2, 3, WANG Yu2, 3, 4, ZHANG Yi-qian2, 3, LIU Yuan-xue2, 3, HUANG Zhi-juan2, 3, LI Rui-ming2, 3, HE Yi2, 3

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Development Center of Modern Chinese Medicine, Research Institute of Tasly Pharmaceutical Group Co. Ltd., Tianjin 300410, China 3. State Key Laboratory of Critical Technology in Innovative Chinese Medicine, Tasly Pharmaceutical Group Co. Ltd., Tianjin 300410, China 4. School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

The degradation rule of verbascoside under different pH conditions was studied, degradation products was identified, and degradation pathways was speculated.HPLC-UV was used to study the degradation rule of verbascoside at different pH values; High performance liquid chromatography tandem ion trap time-of-flight mass spectrometry (HPLC-IT-TOF-MS) was used to identify structures of degradation products. An Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18column (4.6×150 mm, 5 μm) was used. The mobile phase consists of 0.5% acetic acid aqueous solution (A)-methanol (B). The flow rate was 1 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was 254 nm, and the injection volume was 10 μL. Mass spectrometry were acquired on a mass spectrometer with an electrospray ion source (ESI), and scanned in positive ion mode, with a scanning range of/100－800. The degradation behaviors were analyzed by comparing the chromatographic peak areas of verbascoside at different pH values. Structures of degradation products were identified by comparing with the reference-substances and the mass spectrometry.In different pH buffer solutions, the degradation rate of verbascoside and isoverbascoside accelerated as increase of the pH value. The degradation products included hydrolysis products, oxidation products and isomeric products, etc.In this study, the degradation rule, degradation products, and degradation pathways of verbascoside at different pH conditions were analyzed. It may provide a reference for the quality control of traditional Chinese medicines containing verbascoside.

verbascoside; isoverbascoside; pH; stability; degradation rule; degradation products

R284.1

A

0253-2670(2022)11- 3295 -11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.004

2021-11-24

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2017ZX09301005）

武改麗，在讀碩士，從事中藥藥物開發(fā)研究。Tel: 15735641103 E-mail: gailiwu@163.com

何 毅，研究員，從事中藥新藥開發(fā)與研究工作。Tel: (022)86343860 E-mail: heyi@tasly.com

[責(zé)任編輯 王文倩]