采用HPLC-PED法測定硫酸小諾米星及其注射液有關(guān)物質(zhì)和組分的探討

趙敬丹?蔣孟虹?劉浩

摘要：目的 新建硫酸小諾米星及其注射液有關(guān)物質(zhì)和組分檢查的HPLC-脈沖安培電化學檢測（PED）法，并探討其用于評價硫酸小諾米星及其注射液質(zhì)量的合理性。方法 色譜柱為Welch Ultimate LP-C18（3.9 mm×300 mm，5 μm）；以1.5%三氟醋酸溶液（用50%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.6）-乙腈（98：2， V/V）為流動相，脈沖安培電化學檢測器檢測，金電極為工作電極，四電位波形工作模式，柱后加0.5 mol/L NaOH溶液，流速0.4 mL/min。結(jié)果 新建的電化學檢測法可實現(xiàn)小諾米星相關(guān)雜質(zhì)和小諾米星組分的準確定量，靈敏度是蒸發(fā)光散射檢測法（ELSD）的近40倍，對于國產(chǎn)硫酸小諾米星及其注射液質(zhì)量控制具有重要作用。結(jié)論 HPLC-PED法靈敏度高，重復性好，可替代或和現(xiàn)有蒸發(fā)光散射法聯(lián)合作為硫酸小諾米星及其注射液有關(guān)物質(zhì)和組分檢查的分析方法。

關(guān)鍵詞：小諾米星；慶大霉素C1a；雜質(zhì)；ELSD；脈沖安培檢測

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Detection of the related substances and component in micronomicin sulfate and its injection by HPLC-PED

Zhao Jing-dan， Jiang Meng-hong， and Liu Hao

（Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203）

Abstract Objective To establish an HPLC method with pulsed electrochemical detector （PED） for the analysis of micronomicin sulfate and its injection， and evaluate its rationality. Methods A Welch Ultimate LP-C18（3.9 mm×300 mm，5 μm）column was used， and the mobile phase was 1.5% trifluoroacetic acid solution （the pH of the aqueous solution was adjusted to 2.6 with 50% NaOH solution）-acetonitrile（98∶2）at a flow rate of 1.0 mL/min. A pulsed electrochemical detector was used. The electrochemical cell consisted of a working electrode，a pH-Ag/AgCl reference electrode， and a titanium counter electrode. The working electrode was a gold electrode （diameter 3 mm） and a quadruple-potential waveform was selected as the detection waveform. The 0.5 mol/L NaOH solution was added post column at a flow rate of 0.4 mL/min. Results The method can be used for comprehensive analysis of the impurity profile of micronomicin and its injection， and also the determination of the accurate amount of component of micronomicin. The sensitivity is nearly 40 times higher than that of ELSD， and thus it will play an important role in routine quality control. Conclusion The PED method was proved to be sensitive and repeatable， and can replace the ELSD method as a new method to detect related substances and component of micronomicin.

Key words Micronomicin; Gentamicin C1a; Impurity; ELSD; Pulsed amperometric detector

小諾米星（micronomicin）是小單胞菌及其變異株所產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素。小諾米星生物發(fā)酵提取混合液中含有C1a與C2b兩種主要組分，其中C2b為小諾米星[1]。由于為微生物發(fā)酵產(chǎn)生，硫酸小諾米星原料中除了慶大霉素C1a外，還含有許多其他成分，C2b的純度直接影響硫酸小諾米星的成品質(zhì)量。因此，建立一種可有效反映產(chǎn)品質(zhì)量的分析方法對于監(jiān)測藥品的質(zhì)量，提升臨床用藥的安全性非常重要。

目前，文獻報道的小諾米星組分和有關(guān)物質(zhì)測定的方法主要有王明娟等開發(fā)的HPLC-ELSD法[2]以及袁耀佐等開發(fā)的HPLC-PED法[3]。ELSD法即2020年版《中國藥典》中收錄的用于測定小諾米星組分的方法，該方法操作簡單，分析速度快，在小諾米星質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要作用。但是，蒸發(fā)光散射法檢測靈敏度較低，不適合作為現(xiàn)代分析方法用于小諾米星及其有關(guān)物質(zhì)的測定；PED法采用三氟乙酸、五氟丙酸和乙腈為流動相，電化學檢測，并且對主要的雜質(zhì)進行了質(zhì)譜鑒定。該方法重點關(guān)注雜質(zhì)的分離和初步鑒定，對于慶大霉素C1a等相關(guān)物質(zhì)的定量方式未進行系統(tǒng)地研究。但是，相比于ELSD法，PED法在靈敏度和方法的先進性方面具有明顯的優(yōu)勢，并且濃度與響應值呈線性關(guān)系被歐美藥典廣泛收載。近年來，江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院在硫酸新霉素[4]、硫酸核糖霉素[5]、硫酸依替米星[6]等氨基糖苷類抗生素PED法的開發(fā)方面進行了深入的研究，且硫酸依替米星成為首個采用PED法錄入《中國藥典》的氨基糖苷類品種。PED法以及其他靈敏度和專屬性高的方法有望作為ELSD法的可替代方法被錄入《中國藥典》。

鑒于目前缺乏對于硫酸小諾米星及其制劑有關(guān)物質(zhì)和組分共同定量測定的法定方法，且為了提高方法的普及性。本研究在《美國藥典》慶大霉素原料組分測定方法的基礎(chǔ)上，對流動相進行優(yōu)化，采用對電極損傷小的四電位波形為檢測電位，采用三氟乙酸-乙腈為流動相系統(tǒng)，避免了較為昂貴的五氟丙酸或七氟丁酸的使用，建立了可同時用于硫酸小諾米星及其制劑有關(guān)物質(zhì)和組分測定的HPLC-PED法，同時通過對慶大霉素C1a對照品的標化，對比了外標法、峰面積歸一化法和主成分自身對照法對有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果的影響，為提高定量結(jié)果的準確性提供了依據(jù)。該方法操作簡便，靈敏度高，實現(xiàn)小諾米星與其主要雜質(zhì)之間的良好分離，可作為小諾米星有關(guān)物質(zhì)及組分檢測的常規(guī)方法。

1 儀器與試藥

Thermo ICS-5000+型離子色譜儀，配備脈沖安培電化學檢測器（3 mm金電極）；Agilent 1100型高效液相色譜儀， 配備SEDEX90型蒸發(fā)光檢測器；Sartorius CPA225D型電子天平；Millipore純水系統(tǒng)。

硫酸小諾米星原料（江西制藥有限責任公司，批號：A和B）；硫酸慶大霉素標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130326-201716，含量：637 U/mg）；硫酸小諾米星標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130342-201404，含量：以小諾米星計51.8%）；慶大霉素C1a對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130515-201603）；西索米星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130635-201301，含量：56.0%）；硫酸小諾米星注射液來源于3個企業(yè)（河南科倫藥業(yè)有限公司，批號：C；云南大理藥業(yè)股份有限公司，批號：D；江西制藥有限責任公司，批號：E）；三氟醋酸，甲醇，乙腈和50%氫氧化鈉溶液均購自Merck公司，均為色譜純，水為Millipore超純水。

2 實驗方法

2.1 慶大霉素C1a對照品的標化

2.1.1 色譜系統(tǒng)

色譜柱：Welch Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.2 mol/L三氟醋酸溶液-甲醇（98：2）；流速：0.5 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL；蒸發(fā)光漂移管溫度50℃，載氣流量5.0 bar；增益值4。

2.1.2 溶液的配制

系統(tǒng)適用性溶液：取慶大霉素標準品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含慶大霉素總C組分2.5 mg/mL的溶液。

對照品溶液：分別取西索米星對照品和小諾米星標準品各適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成約含西索米星和小諾米星各25、50和100 μg/mL的溶液。

供試品溶液：取慶大霉素C1a對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含慶大霉素C1a 2.5 mg/mL的溶液。

2.2 小諾米星HPLC-PED法

2.2.1 色譜系統(tǒng)

色譜柱：Welch Ultimate LP-C18（3.9 mm×300 mm，5 μm）；流動相：1.5%三氟醋酸溶液（用50%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.6）-乙腈（98：2）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；積分脈沖安培電化學檢測器檢測；檢測電極：金電極（3 mm），參比電極：Ag/AgCl復合電極，鈦合金對電極；四波形電位（表1）；柱后堿溶液：50%氫氧化鈉溶液（1→25），流速：0.4 mL/min；進樣體積：25 μL。

2.2.2 溶液的配制

（1） 有關(guān)物質(zhì)

系統(tǒng)適用性溶液1：取小諾米星標準品適量，加流動相溶解并稀釋制成約含0.24 mg/mL的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液2：取慶大霉素標準品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含慶大霉素總C組分0.24 mg/mL的溶液。

對照品溶液：分別取慶大霉素C1a對照品和小諾米星標準品各適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素C1a和小諾米星各1、2.5、5、10和25 μg/mL的系列線性溶液。

硫酸小諾米星原料供試品溶液：取硫酸小諾米星原料適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含小諾米星0.24 mg/mL的溶液。

硫酸小諾米星注射液供試品溶液：精密量取硫酸小諾米星注射液適量，按標示量加流動相稀釋制成約含小諾米星0.24 mg/mL的溶液。

自身對照溶液：精密量取上述供試品溶液適量，加流動相定量稀釋制成約含小諾米星2.4 μg/mL的溶液。

（2） 小諾米星組分

硫酸小諾米星原料供試品溶液：取硫酸小諾米星原料適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含小諾米星0.1 mg/mL的溶液。

硫酸小諾米星注射液供試品溶液：精密量取硫酸小諾米星注射液適量，按標示量加流動相稀釋制成約含小諾米星0.1 mg/mL的溶液。

對照品溶液：取硫酸小諾米星標準品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含小諾米星0.1 mg/mL的溶液。

3 方法學驗證

3.1 方法專屬性

分別取“2.1.2”和“2.2.2”項下的系統(tǒng)適用性溶液，進樣分析，記錄色譜圖（圖1～3）；取小諾米星原料和注射液，分別經(jīng)酸、堿、氧化、光照和加熱破壞，照“2.2.1”項下的色譜系統(tǒng)，進樣分析。結(jié)果表明：慶大霉素C1a峰和西索米星峰之間，慶大霉素C2峰和小諾米星峰之間，小諾米星峰和慶大霉素C2a峰之間分離均良好，小諾米星主要降解雜質(zhì)均表現(xiàn)為弱保留，不干擾各相關(guān)已知雜質(zhì)之間的測定，方法專屬性良好。

3.2 線性與范圍

取硫酸小諾米星標準品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成約含小諾米星0.24 mg/mL的溶液，作為對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液適量，加流動相稀釋制成濃度分別為0.24、0.48、0.96、1.2、2.4、12、24、48和120 μg/mL的系列線性溶液。分別取上述溶液25 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以小諾米星峰面積A對濃度C進行線性回歸，得回歸方程為：A=2.3340C+3.3326，r=0.9997。結(jié)果顯示，小諾米星濃度在0.24～120 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.3 檢測限和定量限

以信噪比S/N=3計，小諾米星的檢測限約為2 ng；以信噪比S/N=10計，小諾米星的定量限約為6 ng。

3.4 重復性

取硫酸小諾米星原料適量，共6份，精密稱定，分別用流動相溶解并稀釋制成約含小諾米星0.24 mg/mL

的溶液，照“2.2.1”項下的色譜條件，測定其有關(guān)物質(zhì)，慶大霉素C1a的RSD為0.7%，其他單個最大雜質(zhì)的RSD為0.4%，其他雜質(zhì)總量的RSD為1.0%。結(jié)果表明：分析方法重復性良好。

3.5 溶液的穩(wěn)定性

取硫酸小諾米星原料適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成約含小諾米星0.24 mg/mL的溶液，于室溫放置0、1.5、3、5、7、8.5、10和12 h后，照“2.2.1”項下的色譜條件，測定其有關(guān)物質(zhì)。慶大霉素C1a、其他單個最大雜質(zhì)及其他雜質(zhì)總量的RSD均小于1.2%。結(jié)果表明：硫酸小諾米星溶液在室溫放置12 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

3.6 耐用性

考察3根不同品牌的C18色譜柱的分離情況，分別為Welch Ultimate LP-C18柱（3.9 mm×300 mm，5 μm）、Thermo Aminoglycoside（Beta）柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Diamonsil Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），各雜質(zhì)峰均能和小諾米星主峰及其他雜質(zhì)得到有效分離，說明本方法的耐用性較好。

4 相對響應因子的測定

4.1 慶大霉素C1a對照品的純度

采用西索米星峰和小諾米星的線性回歸方程分別計算慶大霉素C1a色譜圖中西索米星和小諾米星的含量，其他雜質(zhì)峰按西索米星線性回歸方程計算，得慶大霉素C1a對照品的純度為95.5%（n=6）。

4.2 慶大霉素C1a相對響應因子

取“2.2.2”項下的對照品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，分別繪制標準曲線，以慶大霉素C1a回歸直線斜率與小諾米星回歸直線斜率的比值計算相對響應因子。結(jié)果顯示，慶大霉素C1a相對響應因子為1.03，表明慶大霉素C1a和小諾米星在電化學色譜系統(tǒng)中響應基本一致。

5 樣品測定

采用PED法對2件硫酸小諾米星原料、硫酸小諾米星標準品以及3件硫酸小諾米星注射液按“2.2.1”項下色譜條件進行有關(guān)物質(zhì)檢查和組分分析，結(jié)果見表2，典型色譜圖見圖4。

6 討論

6.1 分離條件優(yōu)化

因氨基糖苷類抗生素極性大，在常規(guī)C18柱上不保留，現(xiàn)有各國法典中收錄的氨基糖苷類各品種檢測方法均采用在流動相中添加離子對試劑，如三氟乙酸、五氟丙酸或七氟丁酸等，改善色譜保留。研究過程發(fā)現(xiàn)：隨流動相中三氟乙酸、五氟丙酸濃度的增加，分離改善，但保留時間延長；在一定范圍內(nèi)（pH值2.0～4.0）調(diào)節(jié)流動相的pH值，可以改善色譜分離，色譜保留同樣增加；在流動相中添加乙腈，可縮短分析時間，但部分雜質(zhì)對流動相中乙腈的比例比較敏感。

隨著市場上不同種類色譜填料的出現(xiàn)，給色譜條件的優(yōu)化提供了便利，同時提高了試驗方法的重現(xiàn)性，試驗證實，本文采用的色譜填料在流動相中不添加五氟丙酸時，經(jīng)色譜條件的優(yōu)化，可以實現(xiàn)小諾米星及其相關(guān)雜質(zhì)的良好分離。根據(jù)主峰的保留時間、各已知雜質(zhì)峰之間的分離度、主峰與相鄰峰之間的分離度等，最終確定了流動相系統(tǒng)：1.5%三氟醋酸溶液（用50%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.6）-乙腈（98：2，V/V）。

6.2 有關(guān)物質(zhì)定量方式的選擇

分別以峰面積歸一化法、外標法和主成分自身對照法對2件硫酸小諾米星原料和硫酸小諾米星標準品進行了有關(guān)物質(zhì)測定（表3），以確定最佳定量方式。

由上述結(jié)果知，3種定量方法對慶大霉素C1a、其他單個最大雜質(zhì)和其他總雜質(zhì)的測定結(jié)果未見顯著影響。因此，可采用主成分自身對照法進行定量。

6.3 HPLC-ELSD法與HPLC-PED法對小諾米星組分測定結(jié)果的比較

對比了新建的HPLC-PED法和現(xiàn)有HPLC-ELSD法2件硫酸小諾米星原料和硫酸小諾米星標準品中小諾米星組分的測定結(jié)果（表4）。

由上述結(jié)果知，HPLC-PED法定量測定結(jié)果均比HPLC-ELSD法低約2%。分析原因可能與不同原理儀器的定量方式不同所致，后續(xù)可根據(jù)大量樣品的統(tǒng)計數(shù)據(jù)確定采用PED法進行定量時是否需要調(diào)整限度。

7 結(jié)論

本文建立的HPLC-PED法操作簡便，靈敏度高，可實現(xiàn)小諾米星與其主要雜質(zhì)之間的良好分離，可作為小諾米星有關(guān)物質(zhì)及組分檢測的常規(guī)方法。

參 考 文 獻

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收稿日期：2021-07-20

基金項目：2021年上海市藥品監(jiān)督管理局研究課題（No. LX-2021-08）

作者簡介：趙敬丹，女，生于1984年，主管藥師，主要從事抗生素的質(zhì)量分析與研究，E-mail： dannyzhaoj@163.com