實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)多種食源性致病菌的研究

姬莉莉

【摘要】目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)（real time PCR）聯(lián)合檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。方法：針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結(jié)腸彎曲菌glyA基因，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，檢測(cè)多種病原菌的特異性和靈敏度，并對(duì)臨床樣本和模擬樣本進(jìn)行檢測(cè)，聯(lián)合鑒別多種食源性致病菌。結(jié)果：該方法特異性強(qiáng)，與單核細(xì)胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒A組、輪狀病毒B組、輪狀病毒C組、諾如病毒G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒核酸無(wú)交叉反應(yīng);靈敏度高，檢測(cè)陽(yáng)性樣品均可達(dá)102 copies/mL;檢測(cè)30份臨床樣本和50份模擬樣本，準(zhǔn)確性100%。結(jié)論：多種食源性致病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠、操作簡(jiǎn)單，今后可以大規(guī)模加速多種食源性致病菌的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)熒光PCR ;食源性致病菌;核酸檢測(cè);

【中圖分類號(hào)】R183【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-5249（2022）15-0178-04

食源性疾病是由于食用被病原體或其毒素污染的食物或水引起的一類疾病。引起食源性疾病的病原體通常被稱為食源性病原體，包括細(xì)菌，病毒，真菌和寄生蟲(chóng)。自上世紀(jì)90年代起，食源性疾病的發(fā)病率顯著增加，已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的報(bào)告[1]，全世界每年有6億人因食用受污染的食物而患病，其中420萬(wàn)人死亡。根據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）的報(bào)告，美國(guó)食源性疾病大約有4800萬(wàn)例次，每年有12.8萬(wàn)例住院治療，每年3000例死亡病例。近年來(lái)，中國(guó)也開(kāi)始監(jiān)測(cè)食源性疾病。2015年全國(guó)31個(gè)監(jiān)測(cè)地區(qū)共上報(bào)食源性疾病暴發(fā)事件2401起，累計(jì)發(fā)病21374例，死亡139例[2]。食源性病原體的傳播來(lái)源于各種無(wú)任何處理的即食產(chǎn)品、生食或食用未煮熟的食品（如水果、蔬菜、海鮮、肉類和家禽）[3]。鑒于食源性疾病給全球公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)的負(fù)擔(dān)，開(kāi)發(fā)可靠、快速的病原體檢測(cè)方法至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法仍被視為病原菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該技術(shù)有幾個(gè)缺點(diǎn)，如檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以定量分析，缺乏良好的靈敏度，不能同時(shí)檢測(cè)多種食源性病原體[4]。因此，需要一種快速、高度靈敏且價(jià)格低廉的檢測(cè)技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是最常用的分子檢測(cè)方法之一。 PCR 技術(shù)可以通過(guò)檢測(cè)病原體特定的目標(biāo)靶DNA 序列來(lái)檢測(cè)食物中存在的單一病原體。多重?zé)晒?PCR 技術(shù)因其更低檢測(cè)限、閉管實(shí)時(shí)檢測(cè)和兼容多款檢測(cè)設(shè)備，已成為目前應(yīng)用最廣的檢測(cè)技術(shù)。

本研究以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH 基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結(jié)腸彎曲菌glyA基因作為目標(biāo)基因，旨在建立一種可以同時(shí)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌8種食源性致病菌的多重PCR 檢測(cè)方法，為食源性疾病爆發(fā)和食物中毒應(yīng)急處置提供準(zhǔn)確、可靠、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與DNA制備

小腸結(jié)腸炎耶爾森、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌樣品。菌株DNA 提取采用細(xì)菌核酸提取試劑盒，并按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 儀器與試劑

SSNP-3000A 核酸提取儀（江蘇碩世生物科技股份有限公司），ABI 7500熒光定量 PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）。陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒（上海捷瑞生物技術(shù)有限公司），SDK60108細(xì)菌核酸提取試劑盒（江蘇碩世生物科技股份有限公司），One Step ZZ 核酸擴(kuò)增反應(yīng)液（上海碩穎生物科技有限公司）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

通過(guò) NCBI 查找小腸結(jié)腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌 TLH 基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結(jié)腸彎曲菌glyA基因的基因組序列，通過(guò) Primer Express3.0.1進(jìn)行序列比對(duì)，采用BioEdit在選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針。所用引物和探針均有上海碩穎生物科技有限公司合成。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)體系如下：在25μL 反應(yīng)體系中， One Step ZZ 核酸擴(kuò)增反應(yīng)液7.5μL、酶混合液5μL、引物探針?lè)磻?yīng)液7.5μL、模板溶液5.0μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL。實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s，55℃退火延伸30 s，經(jīng)40個(gè)循環(huán);55℃時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道選擇：FAM、VIC、 ROX、CY5。

1.5 特異性試驗(yàn)

選擇與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體核酸，包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒 A 組、輪狀病毒 B 組、輪狀病毒 C 組、諾如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒共計(jì)13種病原體核酸，對(duì)熒光 PCR 方法進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.6 靈敏度試驗(yàn)

選取8種食源性致病菌質(zhì)粒評(píng)價(jià)該方法的靈敏度。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以10倍梯度稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)品，選取101 copies/mL～105 copies/mL 共5個(gè)梯度進(jìn)行 DNA 核酸提取后再進(jìn)行熒光 PCR 檢測(cè)。每個(gè)濃度梯度稀釋液重復(fù)3份，每份進(jìn)行20次重復(fù)檢測(cè)，具有90%以上陽(yáng)性檢出率的濃度水平作為最低檢出限。

1.7 臨床樣本及模擬樣本檢測(cè)

本試驗(yàn)共收集30例臨床樣本和50例模擬樣本，提取細(xì)菌DNA，用1.4部分所述得方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)培養(yǎng)進(jìn)行比較，進(jìn)一步確定該方法得可靠性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果數(shù)據(jù)均采用 Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算陽(yáng)性檢出率。陽(yáng)性檢出率（%）=陽(yáng)性樣本檢出數(shù)（n）/待測(cè)樣本總數(shù)（N）×100%。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌均可檢測(cè)到相應(yīng)的典型擴(kuò)增曲線（圖1A 和 B），并且與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒 A 組、輪狀病毒 B 組、輪狀病毒 C 組、諾如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒共計(jì)13種病原體核酸無(wú)交叉反應(yīng)（圖1C），試驗(yàn)結(jié)果顯示特異性良好，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增信號(hào)。

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋度為102 copies/mL 的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性檢出率分別為92%、92%、97%、93%、90%、95%、93%、90%，陽(yáng)性檢出率均大于90%，故小腸結(jié)腸炎耶爾森、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌靈敏度均可達(dá)102 copies/mL（表1）。

2.3 樣本檢測(cè)結(jié)果

采用本試驗(yàn)所建立的方法對(duì)30例經(jīng)過(guò)培養(yǎng)法鑒定的臨床樣本和50例使用陽(yáng)性細(xì)菌制備的模擬樣本進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測(cè)到沙門氏菌10例，志賀氏菌10例，結(jié)腸彎曲菌10例，空腸彎曲菌10例，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌10例，腸出血性大腸桿菌 O15710例，副溶血弧菌10例，霍亂弧菌10例，與常規(guī)確認(rèn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，準(zhǔn)確性100%。

3 討論

在我國(guó)有研究報(bào)道2015年至2017年江西南昌食源性致病菌監(jiān)測(cè)694份樣品中共檢測(cè)出食源性致病菌57株，陽(yáng)性率達(dá)8.21%[5]。在2019年甘肅清水食源性爆發(fā)事件的研究報(bào)道，研究者對(duì)采集的986份食品中共檢出132株食源性致病菌，陽(yáng)性率達(dá)13.39%[6]。食源性致病菌導(dǎo)致人類胃腸炎、敗血癥等疾病，其發(fā)病率不斷增加，嚴(yán)重威脅人們的生命健康，引發(fā)全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。食源性致病菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)是預(yù)防疾病的重要手段，然而，常規(guī)微生物分離培養(yǎng)方法耗時(shí)且費(fèi)力，因此高靈敏的快速檢測(cè)方法是非常必要的。目前，檢測(cè)技術(shù)已由培養(yǎng)水平向分子水平方向發(fā)展，尤其以高效特異性強(qiáng)、快速、低成本為優(yōu)勢(shì)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)為主，包括常規(guī) PCR、多重 PCR、熒光實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)等[7]。PCR 技術(shù)是最常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法之一。PCR 技術(shù)早期已被廣泛應(yīng)用于許多食源性致病菌如單核細(xì)胞增生李斯特菌，大腸桿菌O157∶H7，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲桿菌，沙門氏菌和志賀氏菌的檢測(cè)[8]。但單重PCR 技術(shù)檢測(cè)通量不高，已經(jīng)逐漸被多重 PCR 技術(shù)和多重?zé)晒?PCR 技術(shù)替代。多重 qPCR 檢測(cè)也開(kāi)發(fā)用于多種食源性病原體的檢測(cè)和定量。楊國(guó)興等[9]采用多重 PCR 技術(shù)對(duì)肉制品標(biāo)本中的金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門氏菌SipB基因、志賀氏菌ipaH基因、單核細(xì)胞增生李斯特菌inlA基因4種常見(jiàn)食源性病原菌進(jìn)行檢測(cè)。魏霜等[10]建立多重富集定量 PCR 針對(duì)collagenase、gyrB、ompW、vvhA同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌。有研究者通過(guò)使用基于分子信標(biāo)的多重 qPCR 檢測(cè)腸道沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌 O157、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、空腸彎曲桿菌、阪崎腸桿菌和志賀氏菌的靶基因（ssaR、hlyA、rfbE、toxR、vvh、gyrA、16SrRNA 和ipaH）[11]。多重?zé)晒?PCR 技術(shù)因其更低檢測(cè)限、閉管實(shí)時(shí)檢測(cè)和兼容多款檢測(cè)設(shè)備，已成為目前應(yīng)用最廣的檢測(cè)技術(shù)。

本研究采用的多重?zé)晒?PCR 技術(shù)適用于待測(cè)樣本中多種靶基因核酸的定性檢測(cè)，即在一次 PCR 反應(yīng)中使用雙管同步檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌 O157 rfbE基因、副溶血弧菌 TLH 基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結(jié)腸彎曲菌glyA基因共8種食源性致病菌特異性基因。該方法特異性強(qiáng)，與常見(jiàn)腹瀉的其他病原體如單核細(xì)胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒 A 組、輪狀病毒 B 組、輪狀病毒 C 組、諾如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒等無(wú)交叉反應(yīng)。其靈敏度高，以具有90%以上陽(yáng)性檢出率的濃度水平作為最低檢出限進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究的食源性致病菌病原體的最低檢出限為102 copies/mL。楊夢(mèng)婕等建立的GeXP多重 PCR 檢測(cè)技術(shù)對(duì)測(cè)大腸桿菌 O157∶ H7、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門氏菌6種常見(jiàn)食源性致病的最低檢測(cè)下限為103 CFU/mL[12]。張靜等報(bào)道多重高分辨熔解曲線技術(shù)結(jié)合熒光實(shí)時(shí) PCR 同時(shí)檢測(cè)雞肉中的反應(yīng)體系檢測(cè)中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌的靈敏度均為102 copies/mL[13]。本研究建立的多重?zé)晒?PCR 檢測(cè)方法對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)靈敏度與此文獻(xiàn)報(bào)道相似。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)對(duì)30例經(jīng)過(guò)培養(yǎng)法鑒定的臨床樣本和50例使用陽(yáng)性細(xì)菌制備的模擬樣本進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明該熒光 PCR 方法與常規(guī)確認(rèn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，準(zhǔn)確性100%，表明該方法具有較好的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

本研究初步建立了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、結(jié)腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和霍亂弧菌8種食源性致病菌多重?zé)晒?PCR 檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)本方法的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性的分析評(píng)價(jià)，顯示該方法特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度較高，操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，具有適用于同步鑒別多病原靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)，適于推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2022-01-29）