PCR技術(shù)對發(fā)酵食品中 微生物檢測的效果分析

食品中微生物含量的檢測主要包括菌落總數(shù)、大腸桿菌群落以及病原微生物三個(gè)方面的檢測。檢測人員需要先對食品進(jìn)行特殊的處理，在相對特定的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，然后檢測相關(guān)重要指標(biāo)。除了益生菌之外，其他細(xì)菌群落的數(shù)量越多，就代表著食品中因?yàn)槲⑸飳?dǎo)致的污染越嚴(yán)重，最終導(dǎo)致食品的安全性能較差。傳統(tǒng)的顯微鏡鏡檢法主要是利用微生物的形態(tài)以及數(shù)量來進(jìn)行檢測，雖然靈敏度相對比較高，但是檢測的流程較為復(fù)雜，檢測的時(shí)間也很長，效率不高。再加上部分食品的保質(zhì)期相對較短，傳統(tǒng)檢測方法的局限性就很容易影響食品在市場上的流通。為此，在發(fā)酵食品的微生物檢測中探求一種準(zhǔn)確且快速的檢測方法，對于預(yù)防食品安全問題的發(fā)生具有十分重要的意義。

一、檢測與方法

1.樣品前處理及核酸提取。四甲基吡嗪（TTMP）是一種含氮的雜環(huán)化合物，天然存在于水果、堅(jiān)果、豆制品、乳制品以及各種酒類等發(fā)酵食品中。因?yàn)榘l(fā)酵食品中TTMP的含量相對較低，而且相對于其他組成成分來說較為復(fù)雜，所以要想對發(fā)酵食品中微生物的含量進(jìn)行檢測，必須首先對發(fā)酵食品進(jìn)行前處理，去除一些干擾物質(zhì)，并且增加TTMP的含量。前處理最常使用的是溶劑萃取技術(shù)、分散液相微萃取技術(shù)以及固相微萃取技術(shù)中的頂空萃取方法。

（1）溶劑萃取技術(shù)。在溶劑萃取方法中，常用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，通過三氯甲烷來萃取食品中的TTMP，再使用0.5mol/L的鹽酸溶液將TTMP萃取到由金屬離子組成的水溶液狀態(tài)，然后使用高效液相色譜來進(jìn)行檢測，回收率高達(dá)85%以上。另一種萃取方法就是使用重蒸溶液對飽和狀態(tài)下的氯化鈉溶液進(jìn)行萃取，通過調(diào)節(jié)氫離子的濃度可以將其逐漸分成酸性、堿性以及中性三個(gè)部分，將其干燥之后再使用氣相色譜來進(jìn)行檢測。

（2）分散液相微萃取技術(shù)。分散液相微萃取技術(shù)能夠減少有機(jī)溶劑的使用，并且提高檢測效率，在樣品的前處理工作中應(yīng)用廣泛。通過分散液相微萃取技術(shù)也可以提取發(fā)酵食品中TTMP的含量，先用400μmol/L的二氯甲烷來進(jìn)行萃取，再用4mL的乙醇溶劑來進(jìn)行分散，回收率可高達(dá)97%以上。為了減少萃取所用的時(shí)間，還可以利用超聲以及渦旋的方式來進(jìn)行輔助，通過60s的超聲或者是渦旋可以使萃取的過程達(dá)到平衡狀態(tài)。

（3）固相微萃取技術(shù)中的頂空萃取方法。固相微萃取技術(shù)中的頂空萃取方法無須使用溶劑，檢測成本較低，檢測速度相對較快，因此被廣泛應(yīng)用在低分子或者低沸點(diǎn)的化合物檢測中。

通過上述方法可以得知TTMP生成的路徑，具體如圖1所示。因?yàn)楹芏嗍称分形⑸锏臐舛认鄬^低，所以在對樣品進(jìn)行前處理之后要使其濃度達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)，而且樣品前處理之后的反應(yīng)很難使其中的分子靈敏度達(dá)到極限狀態(tài)，還容易出現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量損失的情況，因此需要將其內(nèi)部核酸顯露出來，這樣才可以準(zhǔn)確地對其進(jìn)行檢測。處理的方法大多是對其進(jìn)行加熱、重復(fù)地凍融以及利用化學(xué)試劑來進(jìn)行裂解，當(dāng)直接使用化學(xué)試劑來進(jìn)行細(xì)菌裂解時(shí)，需要注意細(xì)菌中的蛋白質(zhì)可能會(huì)壓抑Taq酶的活性。只要細(xì)菌濃度不超過150cfu/μL，細(xì)菌裂解之后的核酸就不需要再進(jìn)一步純化。使用FHLP和FGLP兩種膜進(jìn)行水樣過濾之后，經(jīng)過多次的凍融以及在不移走過濾膜的前提下，可以對其進(jìn)行核酸提取。

2.PCR擴(kuò)增與合成檢測。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（簡稱PCR）是一種可以快速對DNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法，可以使某一特定序列上的微量DNA片段在非常短的時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對DNA進(jìn)行擴(kuò)增通常是由20-40個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)組合而成，并且每一個(gè)反應(yīng)都是由高溫變性、低溫退火、適溫延伸這三個(gè)步驟組合而成。在經(jīng)過高溫的過程中，DNA性質(zhì)發(fā)生改變，氫鍵被打開之后，雙鏈就可以轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂?，這一步驟就可以作為擴(kuò)增過程中的模板;在經(jīng)過低溫的過程中，左端和右端的引物可以與擴(kuò)增模板中的兩條單鏈進(jìn)行互補(bǔ)，這一過程稱為退火;在達(dá)到適合溫度的狀態(tài)時(shí)，利用DNA中的聚合酶可以將四種脫氧核苷的三磷酸酯按照堿基互補(bǔ)的方式來進(jìn)行配對，將其增加到引物的末端位置并按照一定方向延伸到新的DNA中，將單鏈模式變?yōu)殡p鏈模式，然后將雙鏈模式下的DNA重復(fù)上述的過程，可以使引物的DNA數(shù)量成倍增加。

通常情況下，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在進(jìn)行變性過程中，溫度應(yīng)該維持在95℃，如果還沒進(jìn)行擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的聚合酶所占比例過高，就可以適當(dāng)提高溫度。退火狀態(tài)下的溫度跟DNA堿基中聚合酶的含量存在一定關(guān)系，具體如下式所示：

TH=TJ -5=4×（A+B）+2×（C+D）-5

在上式中，TJ表示解鏈的溫度，A和B表示DNA堿基中聚合酶的數(shù)量，C和D表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。通過在TH的附近進(jìn)行測試，確定退火狀態(tài)下最佳的溫度形態(tài)。如果延伸的溫度在75℃時(shí)，DNA中聚合酶的速度為1500（堿基）/min，那么聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)就是將DNA擴(kuò)增模板、左右端引物、聚合酶、混合液、混沖液、雙蒸水以及鎂離子等混合至微型管子中，并在儀器上完成。其中，鎂離子為聚合酶中活力因子所需要的金屬離子，濃度通常為2-3.5mol/L。因?yàn)橐锏腄NA數(shù)量是成倍增加的，所以可以得到聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來進(jìn)行微生物含量檢測，就是需要對DNA進(jìn)行擴(kuò)增。從理論上來說，就是在微生物含量高的區(qū)域設(shè)置左右端引物，這樣就可以將微生物利用片段擴(kuò)散而出。如果在微生物含量屬特異性區(qū)域內(nèi)設(shè)置左右端引物，那么只有本屬狀態(tài)下的微生物才可以被擴(kuò)散;如果在微生物含量種特異性區(qū)域內(nèi)設(shè)置左右端引物，那么就只有特定區(qū)域內(nèi)的微生物才可以被擴(kuò)散。最終可以根據(jù)已了解的微生物信息，設(shè)計(jì)出一種特定的左右端引物，來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。一旦擴(kuò)增的產(chǎn)物達(dá)到一定長度，就說明擴(kuò)增的模板為該微生物的DNA，表示待測微生物存在一定的數(shù)量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的時(shí)間較短，可以將傳統(tǒng)檢測方法所需的數(shù)天縮短至幾小時(shí)。

例如，用瓊脂糖凝膠電泳法可以準(zhǔn)確檢測出發(fā)酵食品中的微生物含量，由于凝膠電泳法中的瓊脂糖質(zhì)量在1%-2.5%，并且質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)根據(jù)片段大小而決定，因此等待分離狀態(tài)下的片段中分子含量越小，就代表瓊脂糖質(zhì)量越大。使用凝膠電泳法之后還需要使用溴化乙錠進(jìn)行染色，將其插入到DNA的堿基中，經(jīng)過紫外線放射后呈現(xiàn)出熒光，這樣就可以準(zhǔn)確地識(shí)別出發(fā)酵食品中的微生物及其含量大小。

二、應(yīng)用與分析

為了驗(yàn)證本研究提出的微生物含量檢測方法的可靠程度和實(shí)際應(yīng)用效果，本次檢驗(yàn)主要對發(fā)酵食品樣品中最主要的三種微生物進(jìn)行檢測，分別為酵母菌、霉菌以及細(xì)菌，并對其結(jié)果進(jìn)行分析，以此判定該發(fā)酵食品樣品的安全性。

實(shí)驗(yàn)所需要的主要材料是蛋白胨、瓊脂、酵母浸膏以及蒸餾水，在進(jìn)行檢測之前還需要對發(fā)酵食品中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法如下：一是原始溶液制作。從送檢的發(fā)酵食品中取出2份質(zhì)量相同（均為12g）的樣品裝入燒杯中，加入1500mL的生理鹽水，其中蛋白胨的含量在1%左右，混合之后將其攪拌3-5h;在無菌的條件下，使用洗脫液進(jìn)行過濾處理，混合均勻即可。二是微生物培養(yǎng)。取5mL的原始溶液，放置在80℃的水中靜置10min，再取1mL靜置之后的原始溶液、1mL的十進(jìn)制稀釋液以及15mL的瓊脂混合均勻，待其凝固之后，使用5mL相同的培養(yǎng)基對其表層進(jìn)行覆蓋，并將平皿倒置在厭氧罐中，最后在恒溫培養(yǎng)箱中對其進(jìn)行24-96h的培養(yǎng)。

在準(zhǔn)備好所需要的材料之后，對微生物的培養(yǎng)分別設(shè)置24h、48h、72h、96h這4個(gè)不同的時(shí)間梯度，并且在攪拌溫度、攪拌速度以及攪拌時(shí)間均相同的情況下，分別使用兩種不同方法進(jìn)行檢測，所得到的結(jié)果對比如圖3所示。

由圖3可知，培養(yǎng)時(shí)間從0h增加到24h時(shí)，傳統(tǒng)方法檢測出的微生物含量為2×105cfu·g-1，生物化學(xué)方法檢測出的微生物含量則為6×105cfu·g-1;培養(yǎng)時(shí)間從24h增加到72h時(shí)，雖然微生物含量的發(fā)展?fàn)顩r是趨于平緩的狀態(tài)，但是兩種方法檢測出的微生物含量還是存在一定差距，傳統(tǒng)方法檢測出的微生物含量為2×105-4×105cfu·g-1，生物化學(xué)方法檢測出的微生物含量則為6×105-8×105cfu·g-1;培養(yǎng)時(shí)間從72h增加到96h時(shí)，生物化學(xué)方法檢測出的微生物含量明顯增多，具體結(jié)果為10×105cfu·g-1，而傳統(tǒng)方法檢測出的微生物含量只有5×105cfu·g-1。

此次研究的微生物含量檢測方法是在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合核酸提取以及PCR擴(kuò)增技術(shù)來提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度以及有效縮短檢測時(shí)間，為有效預(yù)防食品安全問題的發(fā)生以及完善食品微生物檢測體系提供了更加完整的理論基礎(chǔ)。由于此方法也有一定的局限性，對實(shí)驗(yàn)操作過程要求較高，因此今后可以進(jìn)一步探索高效且準(zhǔn)確度高的技術(shù)手段，從而更加準(zhǔn)確地檢測出食品中微生物的含量，以此達(dá)到有效預(yù)防食物中毒的效果。

作者簡介：支曉潔（1984-），女，陜西咸陽人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)檢測。