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    柱前衍生化HPLC法測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸含量

    2022-05-30 16:43:28李運(yùn)張國強(qiáng)高鵬李紅玉景明魏鋒
    關(guān)鍵詞:藏藥高效液相色譜法種子

    李運(yùn) 張國強(qiáng) 高鵬 李紅玉 景明 魏鋒

    【摘要】目的:建立柱前衍生化HPLC法測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量。方法:供試品在一定量6 moL·L-1鹽酸中110 ℃水解6 h,與異硫氰酸苯酯進(jìn)行衍生化反應(yīng)。采用CAPCELL PAK-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以80%乙腈溶液(A)-0.056 moL·L-1乙酸鈉緩沖液(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45 min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A),流速為1.0 mL·min-1,檢測波長254 nm,色譜柱溫度40 ℃。結(jié)果:15種氨基酸衍生物能夠達(dá)到基線分離,在0.96~58.56 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r≥0.9991,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值分別小于2.73%、2.85%、2.89%,加樣回收率介于95.2%~104.4%之間,RSD值均小于2.46%。經(jīng)測定,3 批熏倒牛種子中氨基酸總含量分別為1.64%、1.55%和1.08%。結(jié)論:此法簡便易行,可用于藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量測定。

    【關(guān)鍵詞】藏藥;熏倒牛;種子;氨基酸含量;高效液相色譜法

    【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2022)04-0048-05

    Determination of 15 amino acids in Biebersteinia heterostemon Maxim seeds by precolumn derivation HPLC

    LI Yun1,2ZHANG Guoqiang3GAO Peng1LI Hongyu2JING Ming3WEI Feng4

    1.Lanzhou Institute for Food and Drug Control /Gansu Engineering Research Center for Monitoring

    Exogenous Harmful Residues in Traditional Chinese Medicines, Lanzhou 730030, China;

    2.Pharmacy College of Lanzhou University,Lanzhou 730000, China;

    3.Pharmacy Collage of Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000, China;

    4.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

    Abstract:Objective To establish a precolumn derivation HPLC method for the determination of 15 amino acids in Biebersteinia heterostemon Maxim seeds. Methods The sample was hydrolyzed in 6 moL·L-1 hydrochloric acid at 110 ℃ for 6 hours,and derivatized with phenyl isothiocyanate (PITC).The analysis was carried out on a CAPCELL PAK-C18 chromatographic column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with 80% acetonitrile(A)- 0.056 mol·L-1 sodium acetate buffer (B) as mobile phase by gradient elution(0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A),at a flow rate of 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was 254 nm, the column temperature was set at 40 ℃. Results The 15 amino acids were able to achieve baseline separation in a good linear range of 0.96~58.56 μg·mL-1(r≥0.9991).The RSD values of precision, repeatability and stability tests were respectively less than 2.73%、2.85%、2.89%, and the recoveries of the 15 amino acids (n=6,RSD<2.46%) were between 95.2% and 104.4%. The total contents of the amino acids in three batches of Biebersteinia heterostemon Maxim seeds were 1.64%、1.55%和1.08%.Conclusion This method is simple and easy to operate. It can be used for the determination of 15 amino acids in Tibetan medicine Biebersteinia heterostemon Maxim seeds.

    Keywords:Tibetan Medicine; Biebersteinia heterostemon Maxim;Seeds; Amino Acid Contents; HPLC

    藏藥熏倒牛(Biebersteinia heterostemon Maxim.)為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物,是藏藥“明見賽?!钡脑参飦碓粗?[1]。具有清熱解毒、散腫止痛、清血熱、祛風(fēng)毒的功效,用于治療各種炎癥、結(jié)核癥、丹毒、瘧疾、咽喉腫痛、胃痛、全身水腫、中風(fēng)等疾病[2]。目前,國內(nèi)外學(xué)者主要側(cè)重于熏倒牛中主要化學(xué)成分的分離鑒定及初步的藥理活性研究,發(fā)現(xiàn)其主要含有黃酮、生物堿、苯丙素、香豆素、甾醇、糖類、揮發(fā)油和萜類等化合物[3-6],并具有抗氧化[7]、降血糖[8]等活性,民間用于治療小兒驚厥、抽搐、感冒發(fā)熱等。在藏區(qū)的走訪調(diào)研中發(fā)現(xiàn),熏倒牛種子可用于治療各種炎癥類、膽囊類疾病及喉蛾、疔瘡等。民族藥用于疾病的治療,藥效的發(fā)揮往往基于多成分多靶點(diǎn)的共同作用,對(duì)于熏倒牛種子的研究,僅見于對(duì)其籽油中脂肪酸成分的分析[9],從其中鑒定出11種脂肪酸類化合物,主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等成分,不飽和脂肪酸為74.23%,其中亞油酸含量為73.04%。

    氨基酸類成分是重要的生命物質(zhì),是組成蛋白質(zhì)和酶的基本單元,能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝等[10]。對(duì)于熏倒牛種子中氨基酸的相關(guān)研究,未見報(bào)道。本文采用柱前衍生化法,利用氨基酸在偏堿性環(huán)境下,與異硫氰酸苯酯反應(yīng)生成硫脲,經(jīng)分子內(nèi)環(huán)化,生成乙內(nèi)酰苯硫脲類化合物,可用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。通過掌握熏倒牛種子中的氨基酸含量,以期為進(jìn)一步研究藏藥熏倒牛藥材中的化學(xué)成分,深入挖掘其用藥潛力和價(jià)值提供參考。

    1儀器與材料

    1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、Waters 2998 PDA 檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器及 Empower工作站,美國Waters公司);MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士Mettle Toledo公司);Milli-Q IQ 7000超純水系統(tǒng)(德國默克密理博公司);SBL-10DT超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);微量移液器(德國eppendorf股份公司)。

    1.2材料谷氨酸(批號(hào):140690-201604,含量99.9%)、甘氨酸(批號(hào):140689-201605,含量100%)、精氨酸(批號(hào):140685-201707,含量99.9%)、蘇氨酸(批號(hào):140682-201302,含量99.9%)、丙氨酸(批號(hào):140680-201604,含量100%)、酪氨酸(批號(hào):140609-201513,含量99.8%)、纈氨酸(批號(hào):140681-201703,含量99.5%)、異亮氨酸(批號(hào):140683-201302,含量99.9%)、亮氨酸(批號(hào):140687-201804,含量99.9%)、苯丙氨酸(批號(hào):140676-201706,含量100%)、鹽酸賴氨酸(批號(hào):140673-201509,含量99.9%),均由中國食品藥品檢定研究院提供;L-絲氨酸(批號(hào):B21932,含量98.0%)、L-脯氨酸(批號(hào):B21914,含量99.0%)、L-蛋氨酸(批號(hào):B21913,含量98.0%)、L-色氨酸(批號(hào):B21930,含量98.0%),均由上海源葉生物科技有限公司提供;乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

    實(shí)驗(yàn)所用熏倒牛種子,分別采自于甘肅省合作市(樣品編號(hào)S1、S2)、甘肅省定西市安定區(qū)(樣品編號(hào)S3),并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物Biebersteinia heterostemon Maxim.的干燥成熟種子。

    2方法與結(jié)果

    2.1色譜條件采用色譜柱:CAPCELL PAK-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為80%乙腈溶液(A)-0.056 mol·L-1乙酸鈉緩沖液(B);流速為1 mL·min-1;檢測波長254 nm;色譜柱溫度40 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL。梯度洗脫程序:0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45 min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A。

    2.2溶液的制備

    2.2.1乙酸鈉緩沖溶液取三水合乙酸鈉7.587 g,加水850 mL,冰醋酸調(diào)節(jié)PH=6.5(約2滴),加水75 mL,乙腈70 mL,配制成濃度為0.056 moL·L-1的乙酸鈉緩沖液。

    2.2.20.1moL·L-1的異硫氰酸苯酯(PITC)精密移取 PITC 0.30 mL,加入乙腈定容至25 mL,搖勻即得。

    2.2.31.0moL·L-1三乙胺溶液移取三乙胺3.475 mL,加入乙腈定容至 25 mL,搖勻即得。

    2.2.4對(duì)照品溶液衍生化溶液的配制分別精密稱取15種氨基酸對(duì)照品適量,用0.1 moL·L-1鹽酸定容于10 mL容量瓶,配制成一定濃度的對(duì)照品溶液,分別取各濃度氨基酸對(duì)照品溶液適量,配制成每1毫升含有谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鹽酸賴氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸分別為58.56 μg、11.38 μg、20.56 μg、18.88 μg、10.36 μg、21.04 μg、21.92 μg、10.02 μg、9.62 μg、10.72 μg、10.1 μg、19.48 μg、10.04 μg、10.04 μg、19.68 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,取上述溶液1 mL,加入0.1 moL·L-1的PITC及1moL·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL。

    2.2.5供試品衍生化溶液的制備取藏藥熏倒牛種子粗粉約0.2 g,置于10 mL玻璃頂空瓶中,加6 moL·L-1鹽酸溶液5 mL,充氮?dú)夂髩荷w密封,于110 ℃烘箱中水解6 h,取出后放冷,揮干溶劑,殘?jiān)?.1 moL·L-1鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中;取其1 mL分別加入0.1 moL·L-1的PITC乙腈溶液、1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL,充分混勻,放置1 h,加入2 mL正己烷,混勻,靜置10 min,取2 mL定容于5 mL容量瓶中,即得。

    2.2.6空白衍生化溶液的制備用0.1 moL·L-1鹽酸溶液代替樣品,同“2.2.5”項(xiàng)下方法制備,即得。

    2.3方法學(xué)考察

    2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和“2.2.5”項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果表明,供試品中各氨基酸色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液各色譜峰保留時(shí)間一致,目標(biāo)峰與相鄰色譜峰的分離度均>1.5,理論塔板數(shù)以谷氨酸峰計(jì)大于9000,色譜圖如圖1所示。

    2.3.2線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液適量,按照供試品溶液中各氨基酸的實(shí)際含量,配制系列濃度的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL,測定色譜峰面積。以對(duì)照品溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),對(duì)照品溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,谷氨酸等15種氨基酸在各自的線性范圍內(nèi)與色譜峰面積的積分值呈良好線性關(guān)系,回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1。

    2.3.3精密度試驗(yàn)取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示,各氨基酸質(zhì)量濃度的RSD值均小于2.73%,表明儀器精密度良好。

    2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示,各氨基酸的平均含量和RSD值分別為1.947 mg·g-1、0.592 mg·g-1、1.783 mg·g-1、0.975 mg·g-1、0.556 mg·g-1、0.349 mg·g-1、1.264 mg·g-1、0.379 mg·g-1、0.440 mg·g-1、0.814 mg·g-1、0.331 mg·g-1、0.713 mg·g-1、0.407 mg·g-1、0.445 mg·g-1、0.864 mg·g-1和2.85%、1.67%、2.13%、1.97%、2.60%、1.67%、2.55%、0.91%、1.32%、0.62%、2.40%、2.12%、1.60%、0.79%、2.57 %。

    2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h測定,記錄各組分色譜峰,計(jì)算峰面積。測得各氨基酸成分的色譜峰面積的RSD值分別為1.43%、2.89%、2.65%、2.19%、1.97%、1.87%、1.11%、0.92%、2.58%、0.98%、2.44%、0.63%、1.92%、2.04%、2.60%,表明樣品在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

    2.3.6加樣回收率試驗(yàn)精密稱取編號(hào)S1的藏藥熏倒牛樣品0.1 g,共6份,加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,按照“2.2.5”項(xiàng)下制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1,加樣回收率試驗(yàn)中15種氨基酸的平均回收率及RSD值分別為95.16%、101.99%、104.02%、102.03%、96.99%、100.70%、95.35%、101.82%、95.59%、99.56%、104.37%、101.64%、99.86%、99.57%、102.62%和2.01%、1.96%、2.67%、2.46%、1.46%、2.29%、2.22%、2.33%、1.22%、1.78%、0.98%、2.24%、1.61%、1.17%、1.21%。

    2.3.7樣品含量測定結(jié)果精密稱取編號(hào)S1-S3的藏藥熏倒牛樣品各3份,每份0.2 g,加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,按照“2.2.5”項(xiàng)下制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,進(jìn)樣體積10 μL,測定樣品中各氨基酸的平均含量。結(jié)果見表2。

    3討論

    對(duì)于氨基酸的分析,常采用柱前、柱上及柱后衍生化3種方式。采用柱前衍生化,利用HPLC進(jìn)行測定,具有方法穩(wěn)定、普適性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究選用柱前衍生化法,首先對(duì)樣品的水解方式進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)合文獻(xiàn)[11-12],選擇以6 moL·L-1鹽酸為水解試劑,設(shè)置不同時(shí)間(1、6、12、24 h)進(jìn)行水解,以樣品中各氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn),優(yōu)選最佳的水解方法,最終選擇以水解溫度110 ℃,水解6 h為樣品水解方法,本方法下,樣品中各氨基酸能夠充分水解,且無焦化現(xiàn)象。其次,通過預(yù)實(shí)驗(yàn),遴選了最佳衍生化試劑。常見的衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛、PITC、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯和丹磺酰氯等[13]。其中用PITC乙腈溶液進(jìn)行衍生化處理具有產(chǎn)物單一、穩(wěn)定等特征[14-15],通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法,最終選擇以0.1 moL·L-1的異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液及1 moL·L-1三乙胺乙腈溶液,時(shí)間為1 h進(jìn)行衍生化處理。

    本研究結(jié)果提示,藏藥熏倒牛種子中含有豐富的人體必需氨基酸,約占樣品中氨基酸總量的37.4%~38.6%。同時(shí)谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、L-絲氨酸等氨基酸含量較高,3批熏倒牛樣品中,五種氨基酸的平均含量分別介于2.363~4.060 mg·g-1、1.403~1.982 mg·g-1、1.155~1.641 mg·g-1、0.830~1.314 mg·g-1、0.679~1.070 mg·g-1之間。

    本文通過建立柱前衍生化HPLC法同時(shí)測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量,具有操作簡單,準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),能夠?yàn)椴厮幯古7N子的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)、深入開發(fā)等提供基礎(chǔ)。

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    (收稿日期:2021-07-02編輯:陶希睿)

    基金項(xiàng)目:甘肅省藥品監(jiān)督管理局2020年度藥品科研項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2020GSMPA034);國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作研究與標(biāo)定(項(xiàng)目編號(hào):2020-W0204001)。

    作者簡介:李運(yùn)(1985-),男,漢族,碩士,高級(jí)工程師,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail:lyun04@163.com

    通信作者:景明(1963-),男,漢族,教授,研究方向?yàn)橹胁厮幃a(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail:jm@gszy.edu.cn

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