亞低溫狀態(tài)5周游泳運(yùn)動(dòng)預(yù)防非酒精性脂肪肝大鼠肝組織勻漿指標(biāo)的變化

秦智 周敏 王曉昆

探討在SD大鼠NAFLD模型建造前，對其實(shí)施亞低溫狀態(tài)下游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，實(shí)驗(yàn)研究預(yù)防NAFLD的效果和機(jī)制。方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（control，C）、高脂組（fat，F(xiàn)）、亞低溫游泳高脂組（hypothermia swimming fat，HS）和常溫游泳高脂組（temperature swimming fat，TS），每組各10只。第0-5周，各組統(tǒng)一給予普通飼料喂養(yǎng)，TH和TS組實(shí)施游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)。第6-10周，F(xiàn)、HS和TS組采用高脂飼料喂養(yǎng)建造NAFLD動(dòng)物模型，C組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)。第10周結(jié)束，處死各組SD大鼠，檢測肝臟組織中MDA、SOD、GSH和Caspase-3、Caspase-12、TNF-α、IL-6、HSP70的表達(dá)。MDA、Caspase-3、Caspase-12、TNF-α和IL-6五項(xiàng)指標(biāo)，F(xiàn)組比C組顯著升高（p<0.05）;HS組則有顯著性降低（p<0.05）;TS組MDA、Caspase-3和Caspase-12相比F組均有降低，但是無顯著性差異（p>0.05），TNF-α和IL-6相比F組均出現(xiàn)顯著性降低（p<0.05）。F組GSH和SOD比C組有非常顯著性降低（p<0.01），HS組比F組顯著上升（p<0.05），TS組比F組升高，但是均無顯著性差異（p>0.05）。結(jié)論：5周亞低溫狀態(tài)下游泳干預(yù)組相比常溫游泳組SD大鼠NAFLD動(dòng)物模型更具有顯著性預(yù)防或減輕非酒精性脂肪肝發(fā)生的效果。

隨著人類生活水平提高和運(yùn)動(dòng)的減少，非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）在全球高發(fā)，其平均發(fā)病率20%左右。臨床上，針對NAFLD的治療仍然缺乏特效藥。21世紀(jì)，我國的衛(wèi)生服務(wù)將屬于衛(wèi)生保健型體制，突出預(yù)防為主和群眾性的自我保健，許多醫(yī)院都開設(shè)了未病科。探討預(yù)防NAFLD機(jī)制的研究是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。近年來，研究表明：低溫具有抗炎、鎮(zhèn)痛和提高免疫力等功能。亞低溫狀態(tài)特指：動(dòng)物直腸溫度維持在33℃左右，比常溫動(dòng)物直腸溫度平均相差3～4℃。整合應(yīng)用亞低溫狀態(tài)聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)或許成為預(yù)防NAFLD的有效手段。本研究采用在SD大鼠NAFLD模型建造過程前，通過觀察亞低溫狀態(tài)5周游泳運(yùn)動(dòng)預(yù)防非酒精性脂肪肝大鼠肝組織勻漿各項(xiàng)指標(biāo)的變化，旨在探討研究預(yù)防NAFLD 的方法，為探尋預(yù)防NAFLD有效措施研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 NAFLD動(dòng)物模型的建造

借鑒美國Charles等研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用高脂液體飼料喂養(yǎng)SD大鼠（供給能量分別為脂肪71%，碳水化合物11%，蛋白18%），5周后取材制備肝組織切片HE染色，完成NAFLD動(dòng)物造模。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡SPF級雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠40只，體重200±20（g），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0002粵監(jiān)證字2008D007。每籠4-5只，飼養(yǎng)溫度20±2℃，濕度55%左右。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)（普通飼料）一周后，隨機(jī)分為對照組（control，C）、高脂組（fat，F(xiàn)）、亞低溫游泳高脂組（hypothermia swimming fat，HS）和常溫游泳高脂組（temperature swimming fat，TS），每組各10只。第0-5周，各組統(tǒng)一給予普通飼料喂養(yǎng)，HS組和TS組實(shí)施游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)。第6-10周，F(xiàn)、TH和TS組采用高脂飼料喂養(yǎng)建造NAFLD動(dòng)物模型，C組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)開始之前（第0周）、5周游泳干預(yù)結(jié)束之后（第5周），以及第6-10周NAFLD模型建造結(jié)束后（第10周）分別對各組大鼠進(jìn)行稱重，并觀察了其運(yùn)動(dòng)和生活的一般狀態(tài)。

1.3 游泳運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度設(shè)置方案

本研究游泳方式為無負(fù)重，游泳場地為內(nèi)壁光滑的大水桶，水桶高為70cm，直徑60cm，水深55cm。每次每桶5只大鼠進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，確保每只大鼠的游泳面積均大于500cm2。HS組水溫28±1℃，TS組水溫33±1℃。參照Iemitsu Motoyuki等的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置本研究運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度方案：HS和TS組大鼠第一天開始進(jìn)行泳訓(xùn)練15min，在1周內(nèi)逐漸增加至每天1小時(shí)的游泳運(yùn)動(dòng)，每周6天，共計(jì)5周的游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間。訓(xùn)練過程中，HS和TS組各有1只大鼠溺水死亡，解剖尸體診斷無其他疾病，故第10周末，HS和TS組的樣本量均為9只。

1.4 亞低溫設(shè)置方案與監(jiān)測設(shè)備

參照于立君等文獻(xiàn)結(jié)合課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置HS組大鼠直腸溫度維持在33℃左右 ，而TS組大鼠肛溫維持在37℃左右，兩組大鼠間肛溫平均相差3～4℃。因此，設(shè)置室內(nèi)溫度為30±1℃、常溫水溫度為33±1℃、亞低溫干預(yù)水溫度為28±1℃。

1.5 肝組織勻漿指標(biāo)測試

第10周末，各組大鼠禁食12h后處死取材。將肝組織制成10%組織勻漿，取上清備用。按照試劑盒說明書：肝組織丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）采用黃嘌呤氧化酶法，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）采用比色法測試。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測試，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）采用雙抗體夾心ELISA法測試。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，各均值用多個(gè)Independent-Samples T Test;關(guān)聯(lián)度高的反映同功能的生理指標(biāo)則采用Paired-Samples T Test 處理，顯著性差異為P<0.05，非常顯著性差異為P<0.01。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組體重的變化

第0周和第5周各組之間體重?zé)o明顯差異（見表1）。第10周，F(xiàn)組體重比C組明顯上升P<0.05，HS和TS組體重比F組呈顯著性下降P<0.05。各組大鼠在NAFLD造模前精神狀態(tài)和活動(dòng)度均良好，且無明顯差異。第6-10周，隨著NAFLD造模進(jìn)行，F(xiàn)組大鼠活動(dòng)度明顯降低。其他生活狀態(tài)均無差異。

2.2 各組肝臟形態(tài)學(xué)變化

第10周處死各組大鼠，取肝臟進(jìn)行大體進(jìn)行觀察，并取相同部分進(jìn)行HE染色觀察病變。如圖2所示，C組肝臟光滑完整，F(xiàn)組可見明顯多個(gè)散發(fā)的脂肪囊腫，HS組肝臟較為光滑，偶見個(gè)別小脂肪囊腫，TS組肝臟靠近肝門處脂肪囊腫散發(fā)。HE染色所示：C組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，可見明顯有規(guī)律排列的肝細(xì)胞索;F組肝小葉與肝細(xì)胞索消失，肝細(xì)胞內(nèi)可見大量（>90%視野）脂肪小空泡，伴有多發(fā)大空泡融合成大小不一的脂囊;HS組肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，但肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)有些紊亂。肝細(xì)胞內(nèi)可見中量（>50%視野）脂肪小空泡，偶有融合性大空泡出現(xiàn);TS組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝細(xì)胞內(nèi)可見較多（>75%視野）脂肪空泡，肝細(xì)胞體積增大，胞漿疏松呈網(wǎng)狀、半透明。

2.3 肝組織勻漿指標(biāo)的變化

如表2所示，F(xiàn)組肝組織MDA比C組非常明顯升高（P<0.01）;而GSH、SOD的表達(dá)則比C組顯著降低（P<0.01）。HS組肝組織MDA比F組顯著降低（P<0.05）;GSH、SOD的表達(dá)比F組顯著上升（P<0.05）。F組肝組織Caspase-3和Caspase-12比C組顯著升高（P<0.01）;而HS組肝組織Caspase-3和Caspase-12的表達(dá)比F組顯著降低（P<0.05）。TS組肝組織MDA、GSH、SOD 、Caspase-3和Caspase-12與F組相比，均無明顯性變化（P>0.05）。F組肝組織TNF-α和IL-6比C組顯著升高（P<0.01）;而HS組TNF-α和IL-6的表達(dá)比F組明顯降低（P<0.01）;TS組肝組織TNF-α和IL-6比F組顯著降低（P<0.05）。

3 討論

本研究歸納認(rèn)為：現(xiàn)在廣大研究者廣泛認(rèn)可的NAFLD致病機(jī)制是“二次打擊假說”。第一次打擊是脂肪蓄積在肝中，這個(gè)過程的發(fā)生和胰島素抵抗有著緊密的聯(lián)系，這也是為什么許多研究者并沒有在脂肪肝患者中發(fā)現(xiàn)大量或嚴(yán)重的炎癥改變。第二次打擊是源于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)促線粒體細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，再加上細(xì)胞因子的異常分泌從而導(dǎo)致了NAFLD炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展以及壞死、纖維化最終演變?yōu)镹ASH。

諸多研究初步證明，有氧運(yùn)動(dòng)（aerobic exercise）可通過減少機(jī)體受自由基損傷的程度來增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御功能;從“適宜運(yùn)動(dòng)”理論來看，20分鐘有氧運(yùn)動(dòng)組的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度在各運(yùn)動(dòng)組中最為合適，這種適宜的運(yùn)動(dòng)形式產(chǎn)生積極的運(yùn)動(dòng)效應(yīng)的機(jī)理與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制正相反，表現(xiàn)為：①適宜的運(yùn)動(dòng)促進(jìn)bcl-2基因表達(dá)、抑制bax基因表達(dá)、使bcl-2/bax比值發(fā)生優(yōu)化，②適宜的運(yùn)動(dòng)可以減少自由基的生成，并通過提高SOD等抗氧化酶活性加大對自由基清除的力度 ，③使線粒體體積和數(shù)目的同時(shí)增加，酶合成增加，增強(qiáng)活性和線粒體氧化磷酸化能力，④減少機(jī)械損傷的發(fā)生;在國內(nèi)文獻(xiàn)中，鮮有相關(guān)報(bào)道。關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的抗炎癥反應(yīng)機(jī)制，大多集中在IL-6和TNF-α兩種細(xì)胞因子。

低溫醫(yī)學(xué)集組織學(xué)、工程學(xué)、醫(yī)學(xué)之大成，發(fā)展成為一門新興邊緣學(xué)科。低溫具有抗炎、鎮(zhèn)痛、散熱及提高機(jī)體免疫力等廣泛、綜合生物學(xué)效應(yīng)，已廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后的康復(fù)治療。它還應(yīng)用于治療炎癥，肌肉痙攣和疼痛。

本研究結(jié)果顯示，HS組肝組織MDA的表達(dá)比F組顯著降低（P<0.05）;HS組肝組織GSH、SOD同F(xiàn)組比較，有顯著性升高（P<0.05）。在建造NAFLD動(dòng)物模型前，預(yù)先實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，可以明顯增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。這可能是由于有氧運(yùn)動(dòng)能增加機(jī)體SOD等抗氧化酶的數(shù)量和活性，亞低溫狀態(tài)使得機(jī)體生成氧自由基的數(shù)量減少，而實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，可能會(huì)使得NAFLD肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力產(chǎn)生疊加效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，HS組肝組織Caspase-3和Caspase-12的表達(dá)比F組明顯降低（P<0.05）。在建造NAFLD動(dòng)物模型前，預(yù)先實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，可以明顯減少NAFLD肝細(xì)胞線粒體凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。這些可能與上述NAFLD血清FFA減少和肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的提高有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，HS組肝組織TNF-α和IL-6的表達(dá)比F組顯著降低（P<0.01）。在建造NAFLD動(dòng)物模型前，預(yù)先實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施可以明顯減少NAFLD肝細(xì)胞炎癥因子的生成，達(dá)到預(yù)防NAFLD炎癥的形成。

4 結(jié)語

在SD大鼠NAFLD模型建造前，實(shí)施亞低溫狀態(tài)下游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)5周，可以減少肝細(xì)胞線粒體凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生、增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力和減少肝細(xì)胞炎癥因子的生成，從而達(dá)到預(yù)防NAFLD的發(fā)生的效果。

本文系2018年度湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目“不同運(yùn)動(dòng)形式對非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用及機(jī)理”（B2018226）。

通訊作者：王曉昆

（作者單位：1.武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)院;2.武漢航海職業(yè)技術(shù)學(xué)院）