加味獨(dú)活寄生合劑對兔膝骨關(guān)節(jié)炎顯微結(jié)構(gòu)的影響

黃璐　譚旭儀　鄺高艷　盧敏

【摘 要】目的：觀察加味獨(dú)活寄生合劑對兔膝骨關(guān)節(jié)炎顯微結(jié)構(gòu)的影響。方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將80只白兔分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和獨(dú)活寄生組，每組20只。除正常對照組外，其余組均成功制備KOA模型。獨(dú)活寄生組給予加味獨(dú)活寄生合劑6.8 mL·kg^-1·d^-1灌胃，陽性對照組給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊0.07 g·kg^-1·d^-1灌胃，正常對照組和模型對照組給予等劑量生理鹽水灌胃。在實(shí)驗(yàn)干預(yù)前、干預(yù)第2，4，8周時(shí)，對關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并采用番紅固綠染色進(jìn)行Mankins關(guān)節(jié)軟骨評分。結(jié)果：與模型對照組比較，獨(dú)活寄生組膝關(guān)節(jié)大體觀察得到有效改善。模型對照組、陽性對照組、獨(dú)活寄生組Mankins軟骨評分在干預(yù)前和干預(yù)第2，4，8周均高于正常對照組，且陽性對照組、獨(dú)活寄生組Mankins軟骨評分在干預(yù)第2，4，8周均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：加味獨(dú)活寄生合劑可有效改善KOA關(guān)節(jié)軟骨顯微結(jié)構(gòu)，這可能是其治療KOA的作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎;加味獨(dú)活寄生合劑;軟骨;顯微結(jié)構(gòu);實(shí)驗(yàn)研究;白兔

Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Heji（加味獨(dú)活寄生合劑）on Microstructure of Rabbit Knee Osteoarthritis

HUANG Lu，TAN Xu-yi，KUANG Gao-yan，LU Min

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Jiawei Duhuo Jisheng Heji（加味獨(dú)活寄生合劑）

on the microstructure of rabbit knee osteoarthritis（KOA）.Methods：Eighty white rabbits were randomly divided into a normal control group，a model control group，a positive control group and a Duhuo Jisheng group，with

20 rabbits in each.KOA models were successfully prepared in all groups except the normal control group.The Duhuo Jisheng group was given 6.8 mL·kg^-1·d^-1of Jiawei Duhuo Jisheng Heji by gavage，the positive control group was given 0.07 g·kg^-1·d^-1of glucosamine hydrochloride capsule by gavage，and the normal control group and model control group were given the same dose of normal saline by gavage.The morphology and microstructure of articular cartilage were observed before the experimental intervention and at the 2nd，4th and 8th weeks of the intervention，and the Mankins articular cartilage score was performed by safranine solid green staining.Results：Compared with the model control group，by general observation the knee joint in the Duhuo Jisheng group was effectively improved，Mankins cartilage in model control group，positive control group，Angelica pubescens parasitic group.The scores were higher than those of normal control before intervention and at 2，4 and?8 weeks after intervention Group，and mankins cartilage score of positive control group and Angelica pubescens parasitic group.At 2，4，and 8 weeks of intervention，it was lower than that in the model control group，the difference being statistically significant（P < 0.05）.Conclusion：Jiawei Duhuo Jisheng Heji can effectively improve the microstructure of KOA articular cartilage，which may be the mechanism of its treatment of KOA.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Jiawei Duhuo Jisheng Heji（加味獨(dú)活寄生合劑）;cartilage;microstructure;

experimental research;white rabbit

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，系軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者降解與合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果，故軟骨的退變與本病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-5]。筆者前期提出KOA存在“虛、瘀、毒”病機(jī)特點(diǎn)，以此組方而成的加味獨(dú)活寄生合劑對KOA臨床驗(yàn)效頗佳[6-14]。本研究擬觀察加味獨(dú)活寄生合劑對KOA軟骨顯微形態(tài)的影響，進(jìn)一步探討其對KOA的作用機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級新西蘭健康成年大耳白兔共80只，雌雄各半，體質(zhì)量約2.0 kg，由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)室代購，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK（湘）2020-0008。飼養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度50%左右，自由飲水及進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加味獨(dú)活寄生合劑（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科院內(nèi)制劑，產(chǎn)品批號20180625，規(guī)格250 mL），功效為補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、行氣活血、解毒通痹。藥物組成：獨(dú)活6 g、桑寄生18 g、杜仲12 g、牛膝6 g、細(xì)辛3 g、秦艽6 g、茯苓12 g、肉桂3 g、防風(fēng)6 g、川芎6 g、黨參12 g、甘草3 g、當(dāng)歸12 g、白芍10 g、熟地黃15 g、制天南星6 g、黃芩6 g、木瓜12 g、威靈仙12 g。鹽酸氨基葡萄糖膠囊（澳美制藥有限公司，產(chǎn)品批號6171778，規(guī)格0.75 g）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 番紅固綠染色試劑盒（Wellbio公司，產(chǎn)品批號WB03015A）;石蠟（上海國藥生物公司，產(chǎn)品批號20190106）;中性樹膠（上海懿洋儀器有限公司，產(chǎn)品批號20190116）;磷酸鹽緩沖溶液（Wellbio公司，產(chǎn)品批號WB20190127）;體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，產(chǎn)品批號180602）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 切片機(jī)（浙江金華益迪試驗(yàn)器材公司，型號YD-315）;切片刀（德國萊卡公司，型號M199型）;包埋機(jī)（常州中威電子儀器公司，型號BMJ-A）;生物顯微鏡（麥克奧迪MOTIC公司，型號BA210T）;蓋玻片（江蘇海門市遠(yuǎn)泰實(shí)驗(yàn)器材廠，型號DY89-1）;載玻片（江蘇海門市遠(yuǎn)泰實(shí)驗(yàn)器材廠，型號AY89-2）;石膏繃帶（上海華埠醫(yī)療科技有限公司，規(guī)格10 cm×460 cm）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法，按照體質(zhì)量均衡性原則將80只新西蘭健康成年大耳白兔隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和獨(dú)活寄生組，每組20只。

2.2 動物造模 模型對照組、陽性對照組和獨(dú)活寄生組白兔參照張洪等[15]報(bào)道石膏制動制作KOA動物模型方法。采用右后膝關(guān)節(jié)伸直位石膏管型固定方法持續(xù)固定6周制備兔KOA模型。此時(shí)，白兔右后膝稍腫脹，關(guān)節(jié)主動、被動活動差，結(jié)合干預(yù)前各組關(guān)節(jié)軟骨及滑膜大體觀察、關(guān)節(jié)軟骨顯微結(jié)構(gòu)確定KOA造模成功。

2.3 藥物干預(yù) 模型驗(yàn)證KOA造模成功后，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人-白兔等效劑量折算公式[16]計(jì)算出灌胃劑量，獨(dú)活寄生組給予加味獨(dú)活寄生合劑6.8 mL·kg^-1·d^-1（稀釋到10 mL·kg^-1·d^-1），即4.5152 g·kg^-1·d^-1灌胃。陽性對照組給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊0.07 g·kg^-1·d^-1灌胃，正常對照組、模型對照組給予等劑量生理鹽水10 mL·kg-1·d-1灌胃。

2.4 觀察指標(biāo) 在藥物干預(yù)前，干預(yù)第2，4，8周時(shí)，各組分別隨機(jī)選擇5只白兔，取股骨內(nèi)髁，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定后，進(jìn)行脫鈣、固定、切片等;采用番紅固綠染色觀察軟骨顯微形態(tài)，并參照改良Mankins關(guān)節(jié)軟骨評分，從軟骨結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)染色等3個(gè)方面進(jìn)行評價(jià)。評分越高，說明關(guān)節(jié)軟骨損傷的程度越嚴(yán)重。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)采用單因素方差分析（LSD法）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組白兔膝關(guān)節(jié)大體觀察 各組白兔均成活到預(yù)定觀察時(shí)間，其中正常對照組關(guān)節(jié)面完整，色澤正常，軟骨表面光滑，有光澤。模型對照組關(guān)節(jié)面粗糙，有糜爛或潰瘍形成，色澤灰暗，軟骨缺損深達(dá)軟骨表中層。陽性對照組和獨(dú)活寄生組在干預(yù)前關(guān)節(jié)面粗糙，色澤灰暗;隨著藥物干預(yù)后，關(guān)節(jié)面色澤灰暗逐漸好轉(zhuǎn)。見圖1至圖4。

3.2 各組白兔膝關(guān)節(jié)軟骨顯微結(jié)構(gòu)觀察和Mankins軟骨評分比較 經(jīng)造模后，模型對照組、陽性對照組、獨(dú)活寄生組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，潮線稍有模糊或斷裂，染色不均勻，可見失染現(xiàn)象。經(jīng)藥物干預(yù)后，陽性對照組、獨(dú)活寄生組膝關(guān)節(jié)軟骨組織表面稍有不平整，軟骨細(xì)胞排列有序，潮線較清晰，染色逐漸均勻。根據(jù)兔膝關(guān)節(jié)Mankins軟骨評分進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)模型對照組、陽性對照組、獨(dú)活寄生組Mankins軟骨評分在干預(yù)前和干預(yù)第2，4，8周均高于正常對照組，且陽性對照組、獨(dú)活寄生組Mankins軟骨評分在干預(yù)第2，4，8周均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1，圖5至圖8。

4 討 論

KOA主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動受限、行走能力下降，有時(shí)可出現(xiàn)關(guān)節(jié)響聲，嚴(yán)重時(shí)關(guān)節(jié)畸形（如膝內(nèi)翻或外翻畸形）[17-20]。目前，KOA的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。近年來，學(xué)者從不同角度進(jìn)行了大量研究，并提出了許多學(xué)說，如細(xì)胞因子學(xué)說、骨內(nèi)高壓學(xué)說、自由基學(xué)說、軟骨酶降解學(xué)說等[21-22]。在力學(xué)和生物學(xué)等多因素共同作用下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者降解與合成偶聯(lián)失衡，導(dǎo)致KOA的發(fā)生和發(fā)展，出現(xiàn)軟骨變性破壞等病理改變。

加味獨(dú)活寄生合劑系在獨(dú)活寄生湯基礎(chǔ)加木瓜、威靈仙、黃芩、制天南星制備而成。木瓜舒經(jīng)活絡(luò)，祛濕除痹;威靈仙辛散溫通，性猛善走，兩者配伍剛?cè)嵯酀?jì)，入腑通絡(luò)。黃芩為反佐藥物，取其苦寒清熱燥濕，制約全方溫燥之性;制天南星善入經(jīng)絡(luò)祛風(fēng)解痙治療風(fēng)痰證，二藥寒熱相互制約，防止過寒過熱，更降低制天南星的毒性和燥性，增強(qiáng)清熱化痰息風(fēng)的作用，對于關(guān)節(jié)灼熱腫脹或寒邪阻滯經(jīng)絡(luò)所致的活動不利、筋脈攣縮均有治療作用[23-28]。諸藥合用，共奏補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、行氣活血、解毒通痹之功效。前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)加味獨(dú)活寄生合劑可調(diào)控KOA軟骨Wnt/β-catenin信號通路，減少軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的增殖修復(fù)[29-30]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型對照組、陽性對照組、獨(dú)活寄生組在干預(yù)前和干預(yù)第2，4，8周，Mankins軟骨評分上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與模型對照組比較，獨(dú)活寄生組膝關(guān)節(jié)大體觀察和Mankins軟骨評分得到有效改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。提示加味獨(dú)活寄生合劑可有效改善KOA關(guān)節(jié)軟骨顯微結(jié)構(gòu)，這可能是其治療KOA的作用機(jī)制。

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收稿日期：2021-10-15;修回日期：2021-12-21