人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿致小鼠神經(jīng)炎癥和認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用研究

劉昌福 鄧鋼 歐陽(yáng)敏 吳劍華

摘要：目的 探究人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿誘發(fā)的C57BL/6J小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其作用機(jī)制。方法 36只雄性C57BL/6J小鼠經(jīng)訓(xùn)練合格隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽(yáng)性組，以及人參皂苷Re低、中、高劑量組。正常組注射等體積生理鹽水，其他組腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿溶液。同時(shí)，陽(yáng)性組給予10 mg/kg多奈哌齊溶液，人參皂苷Re低、中、高劑量組分別給予10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人參皂苷Re溶液，其他組灌胃等體積生理鹽水。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的記憶能力。取腦組織，HE染色和試劑盒方法測(cè)定腦組織中AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6水平。結(jié)果 與正常組相比，模型組小鼠上臺(tái)潛伏期顯著增加，TNF-α、MDA、IL-6水平顯著升高，AChE、ChAT、GSH含量和海馬神經(jīng)細(xì)胞明顯減少;相比模型組，5 mg/kg多奈哌齊和10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人參皂苷Re給藥后上臺(tái)潛伏期顯著降低，腦內(nèi)AChE、ChAT、GSH顯著升高，而TNF-α、MDA、IL-6水平顯著降低，改善神經(jīng)細(xì)胞損傷。結(jié)論 人參皂苷Re可以通過(guò)下調(diào)大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及修復(fù)海馬的損傷來(lái)改善C57BL/6J小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

關(guān)鍵詞：人參皂苷Re;記憶障礙;炎癥

阿爾茨海默?。ˋD）是老年人中常見(jiàn)的進(jìn)行性癡呆癥之一，影響患者記憶、思維、語(yǔ)言，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生不利影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，AD的可能病因包括膽堿能和β-淀粉樣蛋白（Aβ）水平、腦血流量、神經(jīng)遞質(zhì)波動(dòng)、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)展[2]。在AD中，海馬和新皮質(zhì)等大腦區(qū)域處理記憶、行為、學(xué)習(xí)和情緒反應(yīng)，患者的膽堿能功能受損，乙酰膽堿（ACh）水平降低。乙酰膽堿酯酶（AChE）負(fù)責(zé)乙酰膽堿的水解[3]。因此，抑制乙酰膽堿酯酶是治療AD的關(guān)鍵[4]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，其特征是自由基生成速率與身體抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡[5]。有研究表明，人參皂苷Re作為人參中微量的有效成分，有助于預(yù)防健康問(wèn)題，緩解腦缺血損傷[6]，提高大鼠大腦中抗凋亡介質(zhì)的水平[7]，以及改善老年癡呆的線粒體病理[8]。

因此，本研究將依據(jù)東莨菪堿造模的常規(guī)途徑，研究人參皂苷Re對(duì)C57BL/6J小鼠記憶障礙的氧化還原、炎癥應(yīng)激等作用，為人參皂苷Re整體入藥改善學(xué)習(xí)記憶作用的科學(xué)機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

取適量人參皂苷Re（大連美侖生物公司，貨號(hào)：MB6952）溶于生理鹽水中，超聲至澄清，配置成4 mg/mL人參皂苷Re溶液備用。取50片多奈哌齊片（大連美侖生物有限公司，批號(hào)：20213102E3217，規(guī)格：5 mg /片，）研磨后溶于50 mL生理鹽水中，攪拌至澄清，配置成10 mg/mL溶液備用。精密稱量60.07 mg東莨菪堿，加入300 mL生理鹽水中，超聲至澄清，即得0.2 mg/mL的東莨菪堿溶液，以上溶液均4 ℃保存。

1.2 動(dòng)物分組與給藥

雄性C57BL/6J小鼠，重量36～41 g（湖南斯萊克動(dòng)物公司提供），所有程序均符合《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程》，合格證號(hào)：SCXK（贛）2022-0015。環(huán)境溫度控制在25±2 ℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天之后開始實(shí)驗(yàn)。

分組實(shí)驗(yàn)前，對(duì)C57BL/6J雄性小鼠進(jìn)行3天的Morris水迷宮（上海移數(shù)有限公司，MWM-M）游泳訓(xùn)練，剔除平臺(tái)潛伏期大于1 min的小鼠。將合格的36只小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（多奈哌齊，10 mg/kg）、人參皂苷Re低（10.02 mg/kg）、人參皂苷Re中（20.1 mg/kg）、人參皂苷Re高（40.2 mg/kg）劑量組。其中，正常組和模型組給予0.9%生理鹽水，灌胃體積為0.4 ml/20 g小鼠體重。每天上午9點(diǎn)稱重后，模型對(duì)照組與給藥組均腹腔注射東莨菪堿注射液，空白組腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，共給藥兩周。每天下午3點(diǎn)，正常組灌胃等體積0.9%生理鹽水，其他組灌胃給藥30 min后，灌胃2 mg/kg東莨菪堿溶液。

1.3 試劑

AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

1.4 儀器

Morris水迷宮（上海移數(shù)有限公司，MWM -M）;MGO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛中國(guó)分公司）。

1.5 方法

1.5.1 行為學(xué)測(cè)定

在試驗(yàn)開始前的兩天內(nèi)，允許所有動(dòng)物每天在沒(méi)有平臺(tái)的泳池中游泳60 s，以評(píng)估它們的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和對(duì)周圍環(huán)境條件的適應(yīng)能力。隨后5 d，放置平臺(tái)后小鼠被允許在迷宮中探索60 s，如果小鼠無(wú)法自己找到平臺(tái)，小鼠會(huì)被輕輕地引導(dǎo)到平臺(tái)上。無(wú)論是否找到平臺(tái)，都將其在平臺(tái)上停留15 s，每天進(jìn)行兩次試驗(yàn)。最后1 d，在同一個(gè)象限中放置小鼠，測(cè)量小鼠上臺(tái)時(shí)間。

1.5.2 大腦生化指標(biāo)測(cè)定

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，二氧化碳安樂(lè)死。每組半數(shù)迅速取出小鼠腦海馬組織，稱重后，置于液氮中保存。勻漿后用試劑盒法測(cè)定海馬組織腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）、谷胱甘肽（GSH）。

1.5.3 病理染色

每組剩余小鼠取腦組織用水合氯醛處理、脫水、透明和封固等步驟后，切片（20-30μm厚），做HE染色，并在尼康倒置顯微鏡下觀察并拍攝染色圖片，通過(guò)Image-Pro Plus 5.0對(duì)切片中神經(jīng)元椎體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用比率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

模型組小鼠上臺(tái)時(shí)間（45.28±4.49） s明顯高于對(duì)照組（23.56±5.71） s，P<0.01。多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組小鼠上臺(tái)時(shí)間（41.28±6.82） s、（34.67±5.12） s、（29.86±3.63） s、

（26.32±6.67）s，明顯低于模型組，P<0.01。

2.2 人參皂苷Re對(duì)小鼠腦中相關(guān)生化因子的影響

模型組小鼠腦內(nèi)海馬的MDA、IL-6、TNF-α含量（187.45±10.37）ng/ml、（168.13±9.16）ng/ml、

（123.51±8.19） ng/ml，高于對(duì)照組（130.37±12.86） ng/ml、（118.62±7.39）ng/ml、（98.79±10.63）ng/ml，P<0.01;而AChE、ChAT、GSH（187.45±10.37） ng/ml、（167.13±9.16）ng/ml、（183.51±8.19）ng/ml，

低于對(duì)照組（236.47±15.88）ng/ml、（221.50±23.18） ng/ml、（237.85±16.73）ng/ml，P<0.01。另外，多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組腦中MDA含量分別為（141.30±9.52） ng/ml、（160.48±9.37） ng/ml、（153.45±11.56）ng/ml、（149.20±13.75） ng/ml，IL-6含量分別為（123.11±12.80）ng/ml、（145.72±10.74）ng/ml、（139.72±9.42）ng/ml、

（134±14.83）ng/ml，TNF-α含量分別為（102.49± 8.53）ng/ml、（110.36±10.68）ng/ml、（108.45±7.68）ng/ml、（106.76±9.55）ng/ml，均低于模型組;P<0.01，且高劑量組的降低作用最為顯著。而多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組腦海馬中AChE的含量分別為（229.42±14.68）ng/ml、（203.15±16.85）ng/ml、（211.92±13.78）ng/ml、（224.73±17.94）ng/ml，ChAT的含量分別為（199.11±8.75）ng/ml、（187.42±10.63）ng/ml、（191.75±11.53）ng/ml、（202.15±10.86）ng/ml，GSH的含量分別為（228.16±8.92） ng/ml、（198.14±13.76） ng/ml、（210.75±11.93）ng/ml、（231.59±16.82） ng/ml，高于模型組，P<0.01，且高劑量組的增加作用最為顯著。

2.3 人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠神經(jīng)組織元的影響

模型組HE染色切片中神經(jīng)錐體細(xì)胞數(shù)量（403±27）個(gè)明顯少于對(duì)照組（576±34）個(gè)，P<0.01。多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組HE染色切片中神經(jīng)錐體細(xì)胞數(shù)量（520.67±43）個(gè)、（470±25）個(gè)、（503±28）個(gè)、（545±30）個(gè)，明顯高于模型組，P<0.01。

3討論

東莨菪堿會(huì)導(dǎo)致野生型小鼠膽堿能下降、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)、腦組織病理學(xué)變化[7]，口服人參皂苷Re小鼠上臺(tái)時(shí)間明顯降低，說(shuō)明人參皂苷Re能改善東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。大腦中AChE、ChAT、GSH水平的降低是導(dǎo)致AD患者認(rèn)知發(fā)生障礙的原因之一，同樣MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，它能加劇神經(jīng)元的損傷[8]?？诜藚⒃碥誖e使小鼠腦內(nèi)AChE、ChAT、GSH升高，MDA降低。因此，人參皂苷Re的記憶改善作用可能與增強(qiáng)膽堿能、抗氧化功能有關(guān)。

東莨菪堿導(dǎo)致C57BL/6J小鼠大腦中皮層出現(xiàn)高水平的IL-6和TNF-α。IL-6和TNF-α作為神經(jīng)細(xì)胞釋放的炎癥因子，會(huì)引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，引發(fā)癡呆。本研究中，給予人參皂苷Re能夠顯著抑制小鼠腦內(nèi)IL-6和TNF-α水平，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

綜上，人參皂苷Re具有改善C57BL/6J小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作用，該作用可能與增加AChE、ChAT含量改善膽堿能系統(tǒng)，增加GSH含量的抗氧化作用，及抑制MDA、IL-6，TNF-α的抗炎作用有關(guān)，為人參皂苷Re的臨床應(yīng)用提供重要理論基礎(chǔ)。

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