萬(wàn)壽菊類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因CCD1克隆與表達(dá)分析

劉曉叢，曾麗,2，劉國(guó)鋒，彭勇政，陶懿偉，張邀月，王夢(mèng)茹

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（南方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；3華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

萬(wàn)壽菊類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因CCD1克隆與表達(dá)分析

劉曉叢1，曾麗1,2，劉國(guó)鋒3，彭勇政1，陶懿偉1，張邀月1，王夢(mèng)茹1

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（南方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；3華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

【目的】克隆萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L.‘Scarletade’）類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因CCD1（TeCCD1），分析其序列特征和表達(dá)特性，為闡明其在類(lèi)胡蘿卜素降解途徑中生物學(xué)功能及進(jìn)一步探討萬(wàn)壽菊花色形成機(jī)理提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳罁?jù)萬(wàn)壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用同源序列比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆獲得萬(wàn)壽菊CCD1 cDNA全長(zhǎng)，分析其序列特征；利用Real-time PCR分析舌狀花未開(kāi)花蕾、半開(kāi)花蕾、開(kāi)放的頭狀花序和完全開(kāi)放的頭狀花序4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】克隆獲得萬(wàn)壽菊CCD1（GenBank登錄號(hào)：KX557488）的cDNA全長(zhǎng)序列為1 746 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度1 626 bp，編碼541個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)分析表明TeCCD1為不穩(wěn)定蛋白，不含信號(hào)肽，屬RPE65超家族（登錄號(hào)：PF03055），包含CCD家族保守結(jié)構(gòu)域，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。萬(wàn)壽菊CCD1核酸序列與除蟲(chóng)菊CCD1同源性最高，為89%；氨基酸序列分析表明萬(wàn)壽菊CCD1與除蟲(chóng)菊CCD1同源性高達(dá)93%，與其他19個(gè)不同種屬的CCD1同源性在75%—83%，說(shuō)明TeCCD1是高度保守的基因；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示TeCCD1的進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化規(guī)律，并具有明顯的種屬特征，萬(wàn)壽菊與菊科同源基因親緣關(guān)系最近。Real-time PCR分析表明TeCCD1在舌狀花發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，隨舌狀花的開(kāi)放逐漸升高，S4期達(dá)到最大值?！窘Y(jié)論】克隆獲得萬(wàn)壽菊舌狀花的CCD1，是典型的CCD家族成員，為高度保守的基因，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，萬(wàn)壽菊舌狀花顏色變淺可能與CCD1表達(dá)量增加導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素降解有關(guān)。

萬(wàn)壽菊；類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因；花色；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L.）為菊科萬(wàn)壽菊屬的高附加值經(jīng)濟(jì)花卉，根據(jù)其用途可分為觀賞萬(wàn)壽菊和色素萬(wàn)壽菊，觀賞萬(wàn)壽菊是重要的花壇花卉之一，色素萬(wàn)壽菊是提取葉黃素（Lutein）的優(yōu)質(zhì)植物源材料[1]。萬(wàn)壽菊廣泛用于園林綠化、食品添加劑、醫(yī)藥、化妝品、保健品、生物農(nóng)藥及飼料添加劑等方面[2-4]，中國(guó)是全世界萬(wàn)壽菊種植面積最大的國(guó)家之一，在云南、山東諸城、吉林、山西及內(nèi)蒙赤峰等地均有大面積種植，并取得了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。研究萬(wàn)壽菊類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑中裂解雙加氧酶基因CCD1，為闡明萬(wàn)壽菊花色機(jī)理提供候選基因和理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類(lèi)胡蘿卜素是植物重要的光合色素之一，作為可吸收光的輔助色素鑲嵌于有色體和葉綠體膜中，是植物光合作用和植物呈色色素的重要組成部分。1950年，PORTER和LINCOLN[5]首次提出植物類(lèi)胡蘿卜素的合成途徑，1997年TAN等[6]在玉米種子中第一次鑒定出類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶，為類(lèi)胡蘿卜素積累的研究提供了新方向，YUAN 等[7]系統(tǒng)總結(jié)了園藝作物類(lèi)胡蘿卜素合成與降解途徑，進(jìn)一步完善了園藝植物類(lèi)胡蘿卜素合成和降解的代謝途徑。目前催化類(lèi)胡蘿卜素合成代謝途徑的相關(guān)核心基因和酶已確定，而降解代謝途徑相關(guān)酶基因在擬南芥、煙草、枇杷、菊科、牡丹、甜瓜、黃瓜、甜橙、番紅花、黃桃、葡萄、桂花、杜鵑花及百合等多種不同科屬植物中也已被克隆與研究[8-21]，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)參與擬南芥類(lèi)胡蘿卜素降解代謝途徑的關(guān)鍵酶基因有9個(gè)，統(tǒng)稱(chēng)為類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因，英文簡(jiǎn)稱(chēng)CCDs，其中5個(gè)命名為NCED，與ABA合成有關(guān)，包括NCED2、NCED3、NCED5、 NCED6 及NCED9；4個(gè)命名為CCD，與β-檸烏素、β-紫羅酮及獨(dú)腳金內(nèi)酯等合成有關(guān)，包括CCD1、CCD4、CCD7及CCD8[22]。在幾種CCD中，CCD1主要催化裂解類(lèi)胡蘿卜素9-10和9’-10’雙鍵，具廣泛的底物特異性，且是唯一功能定位于細(xì)胞質(zhì)的類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶，前人多通過(guò)CCD1研究植物類(lèi)胡蘿卜素積累、花色變化及香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，楊永霞等[9]研究CCD1在煙草中的表達(dá)，花中表達(dá)量高于其莖、葉及根。HAN 等[19]研究表明在2個(gè)桂花品種中CCD1和CCD4兩個(gè)基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其花瓣中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素幾乎無(wú)積累。AULDRIDGE等[23]敲除CCD1導(dǎo)致擬南芥成熟種子中類(lèi)胡蘿卜素含量顯著增加。另外還發(fā)現(xiàn)CCD1影響矮牽牛、葡萄、枸杞及番茄等果實(shí)色澤和香氣的產(chǎn)生及變化[24-25]。【本研究切入點(diǎn)】前人已通過(guò)同源克隆的方法獲得了萬(wàn)壽菊舌狀花中類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中各種關(guān)鍵酶基因[26]，MOEHS[27]、王國(guó)蘭[28]和林登貴[29]等研究了葉黃素合成關(guān)鍵酶基因LCY，當(dāng)LCYe表達(dá)量高，LCYb表達(dá)低時(shí)，則導(dǎo)致α-胡蘿卜素含量較高，葉黃素含量低，推測(cè)LCYe和LCYb可能是萬(wàn)壽菊類(lèi)胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因。張嬪[30]研究了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萬(wàn)壽菊PSY遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響因素。但目前有關(guān)萬(wàn)壽菊降解代謝途徑關(guān)鍵酶基因方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬通過(guò)同源克隆得到萬(wàn)壽菊CCD1序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并與NCBI中已發(fā)表的近源物種相關(guān)基因做系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)合Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在萬(wàn)壽菊舌狀花4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，初步推測(cè)萬(wàn)壽菊舌狀花不同發(fā)育時(shí)期花色變化與類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶之間的關(guān)系，為闡明其在類(lèi)胡蘿卜素降解途徑中生物學(xué)功能及進(jìn)一步探討萬(wàn)壽菊花色機(jī)理提供候選基因和理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015年在上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘猩紅色’萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L. ‘Scarletade’）（花色深橙色），種子購(gòu)自美國(guó)泛美種子公司（PanAmerican Seed），種植于試驗(yàn)田。參照DEL VILLAR-MARTíNEZ等[26]方法，2015年7—9月分別采集萬(wàn)壽菊頭狀花序4個(gè)不同花發(fā)育時(shí)期的材料（圖1）：S1期，未開(kāi)花蕾；S2期，半開(kāi)花蕾；S3期，開(kāi)放的頭狀花序；S4期，完全開(kāi)放的頭狀花序，立即冷凍于液氮中，保存于-80℃的冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑和試劑盒 膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司（AXYGEN）；RNA提取試劑盒、Trans2K DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及ClontechRace試劑盒等購(gòu)自北京TransGen生物技術(shù)有限公司（Transgen）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞trans5α、PMD18-T載體、普通Taq酶及dNTP購(gòu)自寶生物工程有限公司（TaKaRa）；引物和樣品測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及單鏈cDNA的合成 取4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的萬(wàn)壽菊頭狀花序外緣第2—3層舌狀花，去掉基部，選用舌狀花中上部約0.1 g，混合，按照TransGen公司Transzol Up Plus RNA Kit試劑盒步驟提取RNA，NanoDrop2000測(cè)其濃度及純度，凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄總RNA為2 μg，按照TaKaRa公司的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0使用說(shuō)明構(gòu)建反應(yīng)體系。

圖1 萬(wàn)壽菊‘Scarletade’品種舌狀花發(fā)育時(shí)期Fig. 1 Ray floret development of ‘Scarletade’

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及 cDNA全長(zhǎng)序列的克隆 通過(guò)DNAMAN對(duì)萬(wàn)壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何燕紅副教授提供）中查找到的目的基因與 NCBI中已報(bào)道的CCD1序列進(jìn)行比對(duì)，初步判斷序列編碼起始終止位點(diǎn)，并利用軟件Premier primer 5.0設(shè)計(jì)引物。TeCCD1全長(zhǎng)克隆 PCR引物為 CCD1-F：TTCTATCTCCACACACACCAACTCT，CCD1-R：TAATTCTGGCATCCCATATACTCAT；PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，退火溫度為60℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析。擴(kuò)增產(chǎn)物按照 TransGen公司 EasyPure Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收，回收目的片段連接pMD18-T載體，置于連接儀16℃過(guò)夜，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌trans5α，涂布于含100 mg·mL-1氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基，過(guò)夜篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 基因的生物信息學(xué)分析 通過(guò)NCBI上Blast工具驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，確認(rèn)獲得目的基因序列，利用DNAMAN Translation工具將測(cè)序得到的核酸序列翻譯成氨基酸序列，得到編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸組成。結(jié)合ProtParam、TMpred、NPS@中的DPM、SignalP 4.1 Server、ProtScale（親/疏水性）、NCBI、和 SOPMA等網(wǎng)站或在線軟件工具對(duì)目的基因所編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生理功能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；利用DNAMAN比對(duì)不同物種間同源基因核酸序列和氨基酸序列，并采用Mega 6.0構(gòu)建Neighbor Joining進(jìn)化樹(shù)（1 000 bootstraps）。

1.2.4 基因表達(dá)分析 分別取S1、S2、S3及S4 4個(gè)不同時(shí)期的萬(wàn)壽菊舌狀花，取材方法同1.2.1，提取RNA，每時(shí)期3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)克隆所得基因序列設(shè)計(jì)熒光定量 PCR引物，TeCCD1熒光定量引物為CCD1-F：CAGCACCTTTC ATTTCAT，CCD1-R：CAATCTCCGCCTCAGTAG；內(nèi)參基因 EF1α（基因登錄號(hào)：EF413022.1）引物為E-F：TGATTACGGGTACATCCCAAGC；E-R：TGACACCAAGAGTGAAAGCAAGA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、cDNA模版1 μL、正反向引物各0.4 μL、RNase free ddH2O 8.2 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)在Bio-Rad CFX Connect TM Real-Time System 上進(jìn)行。反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定每個(gè)基因相應(yīng)的 Ct值，以 EF1α為內(nèi)參，相對(duì)量采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算[31]。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及理化性質(zhì)分析

利用特異性引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，得到TeCCD1目的條帶（圖2）；測(cè)序后DNAMAN和ProtParam分析表明TeCCD1全長(zhǎng)序列為1 746 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度1 626 bp，推測(cè)其編碼541個(gè)氨基酸（圖3），分子量60 953.9 Da，等電點(diǎn) 5.79，脂肪族指數(shù)為 29.10，不穩(wěn)定系數(shù)為 40.25，表明其為不穩(wěn)定蛋白，GenBank登錄號(hào)KX557488。

利用 TMpred分析預(yù)測(cè) TeCCD1跨膜區(qū)域?yàn)?36—156；通過(guò)ProtScale預(yù)測(cè)TeCCD1中氨基酸的疏水性/親水性，第149位氨基酸疏水性最大，為2.0，第 410位氨基酸親水性最大，為-2.567，總親水性系數(shù)為0.706，表明TeCCD1為疏水性蛋白。

用SignalP 4.1 Server對(duì)TeCCD1蛋白進(jìn)行分析并預(yù)測(cè)信號(hào)肽，TeCCD1預(yù)測(cè)結(jié)果為‘NO’，表明不含信號(hào)肽。

采用 PSORT WWW Server中 PSORT ⅡPrediction工具確定其細(xì)胞定位，TeCCD1出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、囊泡分泌系統(tǒng)、細(xì)胞骨架和線粒體的可能性分別為65.2%、21.7%、4.3%、4.3%和4.3%，表明TeCCD1可能主要定位于細(xì)胞質(zhì)。

利用NCBI中CDD分析其功能保守域，表明TeCCD1屬于RPE65超家族，為包含CCD家族類(lèi)胡蘿卜素裂解氧化酶特殊保守結(jié)構(gòu)域的一類(lèi)超家族。

利用NPS@中的DPM方法預(yù)測(cè)CCD1編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α螺旋、β折疊、無(wú)規(guī)則卷曲及延伸鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型的氨基酸殘基數(shù)占氨基酸總數(shù)的比例分別為30.50%、4.80%、53.42%和11.28%。

圖2 萬(wàn)壽菊CCD1克隆電泳圖Fig. 2 The electrophoresis results of TeCCD1 gene products

2.2 不同物種同源序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

NCBI上下載已報(bào)道的 CCD1核酸序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，萬(wàn)壽菊CCD1核苷酸序列與除蟲(chóng)菊CCD1同源性最高，可達(dá)89%，與麻瘋樹(shù)、葡萄、蘋(píng)果、胡蘿卜、楊樹(shù)及梅花CCD1的同源性均為79%。利用DNAMAN對(duì)19個(gè)不同種屬CCD1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，圖4結(jié)果表明與萬(wàn)壽菊同源性最高的為除蟲(chóng)菊，可高達(dá)93%，與其他種屬植物同源性在75%—83%，表明在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中TeCCD1是高度保守的基因。

圖5表明TeCCD1的進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化規(guī)律，并具有明顯的種屬特征。TeCCD1進(jìn)化樹(shù)存在雙子葉植物和單子葉植物兩個(gè)分支，水稻、玉米與同屬于單子葉植物的番紅花CCD1聚于單子葉進(jìn)化分支；而雙子葉植物中萬(wàn)壽菊與同屬菊科的除蟲(chóng)菊同源基因親緣關(guān)系最近，其次是薔薇科的玫瑰、草莓、梅花以及楊柳科的楊樹(shù)。將 19個(gè)不同種屬的 CCD1與玫瑰、桂花及擬南芥的CCD4氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CCD1與CCD4蛋白同屬于CCD家族，具同源性，但兩者又分屬于不同進(jìn)化分支，表明克隆出的目的基因?yàn)镃CD1，與CCD4在進(jìn)化上有明顯差異。

圖3 萬(wàn)壽菊CCD1核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of TeCCD1 cDNA

2.3 TeCCD1表達(dá)特性

萬(wàn)壽菊舌狀花S1、S2、S3及S4 4個(gè)時(shí)期顏色分別為黃綠色、淡黃色、深橙色、淺橙色，S3期顏色最深。圖6表明萬(wàn)壽菊舌狀花發(fā)育4個(gè)時(shí)期CCD1均有表達(dá)，呈先低后高的變化趨勢(shì)，且各個(gè)時(shí)期存在顯著差異，S4 期TeCCD1相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)期，S1期最低，S2與S3期差異不顯著；S2和S3期均為S1期的30倍左右，S4期為S2和S3期的3倍左右，表明TeCCD1相對(duì)表達(dá)量高低可能與萬(wàn)壽菊花色變化有關(guān)。

3 討論

TeCCD1與除蟲(chóng)菊CCD1同源性最高，與其他物種已知CCD1同源性也較高，均在75%—83%，表明該基因在進(jìn)化過(guò)程中具有高保守性[32]。PSORT ⅡPrediction預(yù)測(cè) TeCCD1在細(xì)胞內(nèi)功能定位于細(xì)胞質(zhì)的概率最大，表明TeCCD1可能主要定位在細(xì)胞質(zhì)，這與趙軍林[33]和高軍平[34]等研究結(jié)果一致。

進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明TeCCD1的進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化規(guī)律，并具有明顯的種屬特征，存在雙子葉植物和單子葉植物兩個(gè)進(jìn)化分支和種屬進(jìn)化特征，王曉慶等[12]和韋艷萍等[35]分別在牡丹和菊科植物中研究發(fā)現(xiàn)CCD家族成員基因進(jìn)化樹(shù)存在進(jìn)化差異和種屬特征，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖4 萬(wàn)壽菊CCD1與其他植物CCD1蛋白質(zhì)同源性比對(duì)Fig. 4 Alignment of the deduced CCD1 proteins of African marigold and other species

前人研究結(jié)果表明植物花色變化取決于所含色素種類(lèi)及含量，萬(wàn)壽菊花色主要與所含類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)及含量有關(guān)，而色素種類(lèi)及含量又受合成與降解相關(guān)酶基因調(diào)控。色素種類(lèi)及含量是決定花色形成的最主要的因子，如萬(wàn)壽菊、金盞菊、黃色薔薇、百合等植物花色主要與類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)及含量有關(guān)，花色范圍從黃色至深橙色[36]。DEL VILLAR-MARTíNEZ等[26]研究發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊舌狀花初期花色為白綠色，含有葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素，隨花朵開(kāi)放，花色變?yōu)榈S色或黃色，舌狀花僅有類(lèi)胡蘿卜素。本研究發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊‘Scarletade’品種舌狀花4個(gè)時(shí)期顏色分別為黃綠色、淡黃色、深橙色和淺橙色，S3期顏色最深，林登貴[29]通過(guò)HPLC檢測(cè)了萬(wàn)壽菊‘Scarletade’品種的葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、番茄紅素 5種類(lèi)胡蘿卜素的總含量，在S1期最低，S2與S3期無(wú)顯著差異，S4期顯著低于S2與S3期，結(jié)合其結(jié)果，表明萬(wàn)壽菊‘Scarletade’品種花色與類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)及含量有關(guān)。

圖5 CCD1系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of CCD1

圖 6 不同發(fā)育時(shí)期舌狀花類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶TeCCD1相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Expression profile of CCD1 in ray floret of ‘Scarletade’at different developmental stages

本研究通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)TeCCD1在萬(wàn)壽菊舌狀花4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量，結(jié)果表明TeCCD1 在4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，表達(dá)量隨舌狀花的開(kāi)放逐漸升高。有研究標(biāo)明5種類(lèi)胡蘿卜素總含量的變化趨勢(shì)為‘低-高-低’[29]，與本研究結(jié)果TeCCD1 S1期表達(dá)量較低，S4期較高的變化趨勢(shì)基本一致。這可能是由于萬(wàn)壽菊S1期舌狀花顏色偏綠色，其中含有較多的葉綠素而非類(lèi)胡蘿卜素，可被分解的底物少，TeCCD1表達(dá)水平較低；而其他 3個(gè)時(shí)期主要色素為類(lèi)胡蘿卜素，S4期TeCCD1高表達(dá)可能導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素降解，表現(xiàn)為舌狀花外觀顏色變淺。在甜瓜、矮牽牛、番茄、枸杞、菌根和擬南芥等植物中的研究也發(fā)現(xiàn) CCD1表達(dá)量與類(lèi)胡蘿卜素含量變化有關(guān)，周莉[13]研究發(fā)現(xiàn)桔色果肉甜瓜中檢測(cè)到成熟期前類(lèi)胡蘿卜素總量持續(xù)升高，CCD1表達(dá)量也增加，但衰老期CCD1表達(dá)量最高，類(lèi)胡蘿卜素卻明顯下降，同時(shí)在白綠色果肉甜瓜中CCD1整體表達(dá)趨勢(shì)均較低；SIMKIN等[24,37]及 TIAN等[25]發(fā)現(xiàn)在矮牽牛、番茄和枸杞中CCD1表達(dá)量降低可以減少類(lèi)胡蘿卜素降解為可揮發(fā)香氣物質(zhì) β-紫羅蘭酮；AULDRIDGE等[23]在擬南芥成熟種子中敲除 CCD1導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素合成增加；FLOSS等[38]在Medicago truncatula菌根中RNA干涉CCD1，導(dǎo)致菌根內(nèi)積累大量C27脫輔基類(lèi)胡蘿卜素，白色菌根變成黃橙色；IBDAH等[39]為驗(yàn)證CCD1功能，在Escherichia coli菌株中過(guò)表達(dá)CmCCD1，導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素降解，橙黃色菌落變?yōu)闇\白色；因此，推測(cè)萬(wàn)壽菊舌狀花顏色變淺可能與TeCCD1表達(dá)量增加，導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素降解有關(guān)。

萬(wàn)壽菊花色變化與基因表達(dá)量之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究，舌狀花顏色變淺可能是由于CCD1與一個(gè)或多個(gè)CCD家族基因或其他降解相關(guān)基因相互協(xié)同或拮抗作用。除了結(jié)構(gòu)基因影響類(lèi)胡蘿卜素積累外，光照、外源激素及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)等也會(huì)影響類(lèi)胡蘿卜素含量[40-43]，萬(wàn)壽菊舌狀花不同發(fā)育時(shí)期花色變化與類(lèi)胡蘿卜素降解途徑中起關(guān)鍵作用的酶基因及其他影響因子的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得萬(wàn)壽菊舌狀花類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因 TeCCD1；其編碼的蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)；蛋白質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)TeCCD1不含信號(hào)肽，有跨膜結(jié)構(gòu)，為疏水性蛋白，屬RPE65超家族，具類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶家族共同的保守結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)。同源性分析表明萬(wàn)壽菊CCD1為高度保守的基因；TeCCD1的進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化規(guī)律，并具有明顯的種屬特征。TeCCD1在舌狀花發(fā)育 4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量差異顯著，S4期達(dá)到最大值，與花色變化趨勢(shì)一致，表明萬(wàn)壽菊舌狀花顏色變淺可能與TeCCD1表達(dá)量增加，從而導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素降解有關(guān)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Cloning and Expression Analysis of Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1 (CCD1) Gene in Tagetes erecta L.

LIU XiaoCong1, ZENG Li1,2, LIU GuoFeng3, PENG YongZheng1, TAO YiWei1, ZHANG YaoYue1, WANG MengRu1
(1School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240;2Key Laboratory of Urban Agriculture (South) Ministry of Agriculture, Shanghai 200240;3College of Horticulture and Forestry Science, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology of Ministry of Education, Wuhan 430070)

【Objective】Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1 gene of Tagetes erecta L. ‘Scarletade’ (TeCCD1) was cloned for bioinformatics and gene expression analysis, which can help clarifying its biological functions in carotenoid degradation pathway and providing a theoretical foundation to further clarify the mechanism of African marigold flower color formation.【Method】According to the transcriptome of African marigold flower bud, the full-length cDNA of TeCCD1 had been obtained, and gene expression profile of ray florets at developmental stages of closed bud, semi-open bud, open flower and fully open flower was studied by Real-time PCR.【Result】The full-length sequence of CCD1 cDNA obtained from African marigold is 1 746 bp (GenBank accession number: KX557488), with a coding region length of 1 626 bp, putatively encoding 541 amino acids. Protein analysis indicated that TeCCD1 is an unstable protein and has no signal peptide, which belongs to the RPE65 superfamily (GenBank accession number is PF03055) having the same conserved domain of CCD family, and it is mainly located in the cytoplasm. CCD1nucleic acid sequence of African marigold is 89% homologous to that of Pyrethrum. Amino acid sequence analysis suggested that CCD1 of African marigold is 93% homologous to that of Pyrethrum, and 75%-83% homologous to that of 19 different species, indicating that TeCCD1 is highly conserved gene. Phylogenetic analysis showed that the evolution of TeCCD1 is basically in accordance with the evolution law of plant taxonomy and has obvious characteristics of species, which has a closest relationship with that of the species in Compositae. The results of Real-time PCR demonstrated that expression of TeCCD1 increased along with the development of ray florets and reached the maximum value at S4 stage.【Conclusion】CCD1 homolog was cloned in Tagetes erecta L. ‘Scarletade’ identified to be a typical member of the CCD family, which is a highly conserved gene located in the cytoplasm. The color fading of ray florets during the late development phase is possibly caused by the increase of expression of TeCCD1, which contributes to a decrease in carotenoid content.

Tagetes erecta L.; carotenoid cleavage dioxygenase 1 (CCD1); flower color; gene expression

2016-10-19；接受日期：2017-01-18

教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”（IRT13065）

聯(lián)系方式：劉曉叢，E-mail：lxc05012013@163.com。通信作者曾麗，E-mail：zljs@sjtu.edu.cn。通信作者劉國(guó)鋒，E-mail：gfliu@mail.hzau.edu.cn