鮮食核桃仁抑制褐變與脫色方法及貨架期保鮮效應(yīng)

劉朝斌，李書影，葉 妞，唐 燕，曹永新，馬惠玲

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

核桃是我國(guó)經(jīng)濟(jì)林重點(diǎn)支柱產(chǎn)業(yè)之一，近年來(lái)得到迅猛發(fā)展，在鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中發(fā)揮了重要作用。目前我國(guó)核桃年產(chǎn)量基本達(dá)到480萬(wàn) t（2021年國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)），占世界總產(chǎn)量的1/2，成為世界核桃生產(chǎn)第一大國(guó)。為了擴(kuò)大銷量，業(yè)內(nèi)都將目光投向新產(chǎn)品開發(fā)方面，以拉動(dòng)消費(fèi)、提高效益[1]。核桃堅(jiān)果富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有健腦、預(yù)防心血管病、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[2-3]等保健功效。鮮食核桃相對(duì)于干核桃，更具有口感香甜[4]，營(yíng)養(yǎng)全面的特色[5]，成為核桃消費(fèi)的又一主流形式。提前去殼的鮮核桃仁外形精美、食用方便、衛(wèi)生，是符合現(xiàn)代人美食觀念的原生態(tài)產(chǎn)品，具有很大的市場(chǎng)潛力。然而，鮮核桃仁含水量高，酶活力強(qiáng)，20 ℃以上室溫下貯藏2～3 d內(nèi)便會(huì)因氧化褐變和滋生微生物等發(fā)生變色變質(zhì)，造成營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)下降[6]，因此，其貨架壽命極短，至今尚未成功實(shí)現(xiàn)商品化。韓強(qiáng)等[7]采用40?mg/L ClO2處理加真空包裝可保持新疆主栽品種‘溫185’鮮核桃仁30 d不霉?fàn)€，提出了鮮核桃仁保鮮的可行性，但其保鮮工藝仍需改進(jìn)。

國(guó)內(nèi)外大量研究顯示，多種抗氧化劑或物理處理可抑制生鮮植物食材褐變。抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）作為一種多羥基化合物，可有效抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力，研究表明AsA能夠抑制番石榴、鮮切蘋果和板栗褐變[8-10]；同理，沒食子酸丙酯（propyl?gallate，PG）是含有3 個(gè)羥基的酚類物質(zhì)，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在PPO活力位點(diǎn)，抑制PPO活力。研究發(fā)現(xiàn)PG浸泡成功抑制了龍眼、高新梨的采后褐變[11-12]；加熱處理通過抑制生鮮植物產(chǎn)品PPO和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力，有效控制了龍眼和大果山楂的酶促褐變[13-14]。葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶復(fù)合處理有效降低了新鮮小麥面團(tuán)的褐變指數(shù)[15]。此外，關(guān)于生鮮植物食材脫色的技術(shù)也取得了實(shí)用性的進(jìn)展。H2O2是食品加工過程中常用的一種漂白劑，具有反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)殘毒、環(huán)境污染小、制作成本低、處理簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可使蘿卜[16]、杏仁[17]和小麥麩皮[18]脫色；AsA為偶合劑，可以將酶促褐變生成的醌雙鍵還原，使其不能再聚合成深色多聚物而對(duì)褐變蔗汁脫色[19]。依據(jù)上述國(guó)內(nèi)外研究成果，本研究采用不同褐變抑制劑處理新鮮核桃仁，不同脫色措施處理已褐變核桃仁，分別篩選出核桃仁褐變抑制、褐變核桃仁脫色方法，并結(jié)合無(wú)公害的短波紫外線（ultraviolet radiation C，UVC）殺菌處理和適宜自發(fā)氣調(diào)包裝，分析其對(duì)鮮核桃仁營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及微生物滋生的影響，探究鮮核桃仁的無(wú)公害處理和保鮮方法，評(píng)價(jià)配套工藝對(duì)產(chǎn)品低溫貨架期的影響，為核桃仁成品生產(chǎn)與銷售提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用‘香玲’（Juglance regiacv.?Xiangling），2017年9月8日（約核桃雌花盛開后130～135 d）采于陜西省藍(lán)田縣核桃良種種植園。2018年9月7日采樣，用于補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。采摘核桃為未開裂的青皮核桃，核桃大小適中，表皮無(wú)明顯病蟲斑和機(jī)械損傷，剪去果柄，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，室溫下放置12 h散去田間熱，再置于（5.0±0.5）℃冷庫(kù)保存。實(shí)驗(yàn)前人工脫去青皮、小心夾除果殼，得到較為完整的核桃仁，用0.01%次氯酸鈉浸泡2?min消毒，再用無(wú)菌水沖洗，空干水分，備用。

L-AsA、七水合硫酸亞鐵（FeSO4g7H2O）、β-巰基乙醇、過氧化氫（H2O2）、次氯酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（luria-bertani，LB）北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯瓊脂（potato dextrose?agar，PDA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、石油醚 成都市科隆化學(xué)品有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（tritonX-100） 天津市登峰化學(xué)試劑廠；交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（cross-linked polyvinylpyrrolidone，PVPP）、愈創(chuàng)木酚、木瓜蛋白酶、沒食子酸丙酯（propyl?gallate，PG） 北京索萊寶生物科技有限公司；鄰苯二酚 上海阿拉丁試劑有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene?diamine?tetraacetie?acid，EDTA） 成都市科龍化工試劑廠；L-苯丙氨酸 鄭州科邦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚乙烯（polyethene，PE）30包裝袋（即厚度30?μm低密度PE袋） 天津國(guó)家保鮮工程中心；TMZ06E-Y20石英紫外線燈管 北京好特光紫外線科技有限公司；UVC-254型紫外線強(qiáng)度計(jì) 上海旭常工業(yè)設(shè)備有限公司；CR-400色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；UV-3100紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；TP-114萬(wàn)分之一天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑制褐變處理

以貯藏期在1 個(gè)月內(nèi)的新鮮核桃仁（L*值接近48）為試材，準(zhǔn)備若干份，每份10 個(gè)，分別進(jìn)行以下處理：1）取4 份核桃仁，分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%、2.0% AsA和0.05%檸檬酸（citric acid，CA）溶液浸泡處理5?min；2）取4 份核桃仁，分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.10%、0.20%、0.30% PG浸泡處理5?min；3）取2 份核桃仁，分別于50 ℃加熱1?min和3?min；4）取4 份核桃仁，分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%、0.010%、0.050%、0.100%的木瓜蛋白酶浸泡處理10?min，溫度40 ℃，pH 6.0。

1.3.2 脫色處理

將于（5.0±0.5）℃冷庫(kù)貯藏1 個(gè)月以上的散裝青皮核桃分批取出，室溫（25 ℃）下放置7～10 d，剝?nèi)『颂胰?，得到發(fā)生了一定程度褐變（L*值小于35）的核桃仁試材，準(zhǔn)備若干份，每份10 個(gè)，分別進(jìn)行以下處理：1）取3 份核桃仁，分別在不同溫度（20、30、40 ℃）下采用1.0% AsA浸泡1 h；2）取2 份核桃仁，分別采用0.5%、1.0% H2O2浸泡處理5?min。

以上抑制褐變和脫色處理，均以相同溫度下去離子水浸泡相同時(shí)間為對(duì)照組。處理完畢將核桃仁放置于室溫（20 ℃）下，并用PE30袋包裝但不封口，0、1、2、3、4 d時(shí)測(cè)定核桃仁的色差值。

1.3.3 保鮮效應(yīng)觀測(cè)

1.3.3.1 抑制褐變效果觀測(cè)

從1.3.1節(jié)單因素試驗(yàn)中選取最佳的抑制褐變處理，分別單獨(dú)和復(fù)合1 kJ/m2UVC殺菌，得到抑制褐變后殺菌和不殺菌兩個(gè)處理組，PE30袋密封包裝，模擬低溫貨架期，于（5.0±0.5）℃下存放。以去離子水浸泡、PE 30袋密封包裝為對(duì)照組。

1.3.3.2 脫色效果觀測(cè)

從1.3.2節(jié)單因素試驗(yàn)中選取的最佳脫色處理，分別單獨(dú)和復(fù)合1 kJ/m2UVC殺菌，得到脫色后殺菌和不殺菌兩種處理組，PE30袋密封包裝，置于（5.0±0.5）℃存放。以去離子水浸泡、PE30袋密封包裝為對(duì)照組。

以上兩大組實(shí)驗(yàn)中，各處理均分裝足夠袋數(shù)，PE30袋規(guī)格為15?cmh19?cm，每袋分裝10 個(gè)核桃仁。處理完畢后，統(tǒng)一置于（5.0±0.5）℃冷庫(kù)，模擬低溫貨架期貯存。在0、7、14、21、28、35 d和56 d時(shí)各隨機(jī)抽取3 袋，每袋每個(gè)核桃仁取1/2切為0.5 cmh0.5 cmh0.5 cm碎塊，混勻，液氮速凍，保存于－80 ℃，留待測(cè)定含油率、酸價(jià)、過氧化值（peroxide value，POV）、PPO、POD、PAL活力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率、總抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）。0 d的初始樣品和各處理組21、35、56 d另取3 袋用于微生物檢測(cè)。

以上實(shí)驗(yàn)所用到PE30包裝袋和1 kJ/m2UVC處理?xiàng)l件均為前期實(shí)驗(yàn)[20]篩選所得。

1.3.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.4.1L*值測(cè)定

采用CR-400色差儀進(jìn)行測(cè)定。每組樣品在分心木處掰開，對(duì)最平整的兩個(gè)內(nèi)面各測(cè)一次，讀取亮度（L*）。

1.3.4.2 微生物檢測(cè)

參考GB 4789.2ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[21]方法進(jìn)行，稍有改動(dòng)。每重復(fù)中隨機(jī)抽取5 個(gè)核桃仁樣品，稱質(zhì)量（約40?g），加入100?mL無(wú)菌水，充分振蕩后取出樣品，進(jìn)行10、100 倍梯度稀釋。取每一梯度稀釋液1?mL涂布到LB平板培養(yǎng)基，（37±1）℃培養(yǎng)96 h，計(jì)錄細(xì)菌菌落數(shù)；另取每一梯度稀釋液1?mL涂布到PDA培養(yǎng)基上，在（28±1）℃培養(yǎng)7 d，記錄霉菌菌落數(shù)。各測(cè)定均重復(fù)6 個(gè)平板培養(yǎng)皿，每處理的細(xì)菌和霉菌數(shù)量均為6 次重復(fù)的平均值。微生物數(shù)量用以下公式計(jì)算。

1.3.4.3 核桃仁油脂品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

含油率和酸價(jià)參考GB 5009.229ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》[22]方法測(cè)定；POV測(cè)定參考GB 5009.227ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》[23]方法。

1.3.4.4 PPO活力測(cè)定

參考Yan Shijie等[24]方法，略有改動(dòng)。稱取0.5?g核桃仁，加0 ℃預(yù)冷的提取液（含0.1?mol/L pH 6.8磷酸緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% TritonX-100和4% PVPP），冰浴條件下研磨成勻漿，定容至9?mL，4 ℃ 10 000hg離心30?min。上清液即為酶提取液，5 ℃低溫保存?zhèn)溆茫ó?dāng)天提取當(dāng)天使用）。

反應(yīng)液中加入2?mL磷酸緩沖液、2?mL?50?mmol/L鄰苯二酚和0.5?mL酶提取液，410?nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度變化。以反應(yīng)體系每分鐘吸光度變化0.1為1 個(gè)酶活力單位（U），結(jié)果以U/g（鮮質(zhì)量）表示。

1.3.4.5 POD活力測(cè)定

參考Fang?Wei等[25]方法，略有改動(dòng)。酶提取液與上述PPO測(cè)定合用，反應(yīng)體系中加入1?mL?0.1?mol/L pH 6.8磷酸緩沖液、3?mL?50?mmol/L愈創(chuàng)木酚，1?mL酶提取液和1?mL?0.2% H2O2，于470?nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以反應(yīng)體系每分種吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U），結(jié)果以U/g（鮮質(zhì)量）表示。

1.3.4.6 PAL活力測(cè)定

參考Li Hua等[26]方法，略有改動(dòng)。稱取0.3?g核桃仁，加預(yù)冷提取液（含0.1?mol/L pH 8.8硼酸緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、5?mmol/Lβ-巰基乙醇、2?mmol/L EDTA），冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、10 000hg離心30?min。收集上清液備用。反應(yīng)體系中加入2?mL?0.1?mol/L pH 8.8硼酸緩沖液、1?mL?20?mmol/LL-苯丙氨酸和1?mL酶提取液，37 ℃溫育1 h。于290?nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以反應(yīng)體系每小時(shí)吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U），結(jié)果以U/g（鮮質(zhì)量）表示。

1.3.4.7 AsA抑制PPO動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

同1.3.4.4節(jié)，分別提取鮮核桃種皮和核桃仁的PPO酶液，測(cè)定PPO活力。反應(yīng)體系由2?mL磷酸緩沖提取液、2?mL鄰苯二酚底物液（濃度分別為0、0.02、0.04、0.05、0.067、0.08?mol/L和0.1?mol/L）、1?mL?AsA溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）和0.5?mL酶提取液組成，測(cè)定420?nm波長(zhǎng)處不同濃度鄰苯二酚和不同濃度AsA組合反應(yīng)液的吸光度，計(jì)算酶活力。以鄰苯二酚濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，每條斜線與X軸的交點(diǎn)即為酶與底物的親合常數(shù)的倒數(shù)（1/Km），與Y軸的交點(diǎn)即為各組溶液酶促反應(yīng)的最大速率倒數(shù)（1/Vmax），讀取兩交點(diǎn)值可計(jì)算各AsA濃度下PPO反應(yīng)的Km和Vmax。

1.3.4.8 DPPH自由基清除活性測(cè)定

稱取0.3?g核桃仁，95%乙醇溶液中冰浴研磨成勻漿，定容至2?mL，4 ℃ 10 000hg離心30?min。收集上清液備用。反應(yīng)體系中加入100 μL上清液，黑暗處?kù)o置30?min，于517?nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參考閆家凱等[27]方法計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4.9 總抗氧化活性測(cè)定

總抗氧化活性（ferric?reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定參考郭長(zhǎng)江等[28]的方法，略有改動(dòng)。稱取0.3?g核桃仁，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液中冰浴勻漿，定容至2?mL。4 ℃ 10 000hg離心30?min。反應(yīng)體系中加入0.2?mL提取液和3?mL?FRAP工作液，混勻后于37 ℃溫育10?min，593?nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以0.1～1.6?mmol/L FeSO4取代提取液反應(yīng)測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)提取液反應(yīng)后吸光度所對(duì)應(yīng)的FeSO4物質(zhì)的量計(jì)算樣品的FRAP，單位為mmol/g（鮮質(zhì)量）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)、作圖，采用SPSS 18.0軟件鄧肯氏（Duncan）多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑制褐變處理對(duì)核桃仁色值的影響

對(duì)比了4種方法對(duì)鮮核桃仁褐變的抑制作用，如圖1A所示，處理后室溫下4 d的觀測(cè)期內(nèi)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)AsA（0.5%～2.0%）＋0.05% CA處理均減緩了種皮亮度（L*）的下降速率，L*值全程高于對(duì)照組，且第2天及以后各處理組的觀測(cè)值均與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，1.0% AsA＋0.05% CA處理在1～4 d均維持了最高水平的L*值，且與1.5% AsA＋0.05%CA處理差異不顯著?？梢姡撎幚碛行а泳徚撕颂胰暑伾募由钭兓?，保持了較高的亮度，表現(xiàn)出抑制褐變效應(yīng)，處理適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%～1.5% AsA，與Goyeneche等[29]在AsA用于鮮切胡蘿卜褐變抑制中得到的最適用量范圍一致?？紤]到藥劑用量越少成本越低，選1.0%AsA＋0.05% CA處理為抑制褐變的最佳處理。

圖1B顯示，0.005%～0.050%的木瓜蛋白酶處理尚可延緩核桃仁亮度下降，在1～4 d期間L*值總體顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），且0.050%木瓜蛋白酶處理效果最佳。質(zhì)量分?jǐn)?shù)高至0.100%則效應(yīng)消失。Yang Tianyi等[15]在面團(tuán)脫色研究中得出木瓜蛋白酶抑制酚氧化的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，不同材料的木瓜蛋白酶最佳用量略有差異。

從圖1C可知，0.05%～0.30% PG處理較對(duì)照組均未能減少核桃仁L*值的下降速度，相反，PG處理均不同程度地促進(jìn)了亮度的下降，0.10%和0.30% PG組在3、4 d時(shí)與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），0.05%和0.20% PG組則于1、2、3、4 d的4 個(gè)觀測(cè)點(diǎn)下均與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。說明PG處理不但不能抑制核桃仁變色，反而加快褐變，與其他水果材料得到的結(jié)果[11-12]不一致。

由圖1D可見，50 ℃加熱1?min的L*值在2 d時(shí)顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），在3、4 d時(shí)L*值顯著小于對(duì)照組（P＜0.05），說明50 ℃加熱1?min在短期內(nèi)可以抑制核桃仁變色，但隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，抑制效應(yīng)消失，并加速褐變。50 ℃加熱3?min處理的L*值在0～3 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在4 d時(shí)還顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）。50 ℃短暫加熱只有2 d內(nèi)起到較弱的延緩褐變的作用，2 d后褐變加劇。50 ℃加熱3?min便失去抑制褐變作用，由于加熱時(shí)間再長(zhǎng)會(huì)造成核桃仁熟化和變味，因此，實(shí)驗(yàn)中沒有觀測(cè)更長(zhǎng)時(shí)間的加熱效應(yīng)?？梢姡?0 ℃熱水處理易造成鮮核桃仁熱傷害而總體加速褐變。

圖1 不同濃度抗壞血酸（A）、木瓜蛋白酶（B）、PG（C）和加熱處理（D）對(duì)核桃仁亮度（L*）的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of ascorbic acid (A), propyl gallate (B) and papain (C) or heating (D) on brightness (L*) of walnut kernels

2.2 不同脫色處理對(duì)核桃仁色值的影響

采用已發(fā)生明顯褐變，L*值低至33.8左右的核桃仁，經(jīng)不同溫度下1.0% AsA溶液浸泡處理，由圖2可見，處理后當(dāng)時(shí)的核桃仁褐變便得到不同程度脫除，表現(xiàn)為L(zhǎng)*值均顯著增大（P＜0.05），并在室溫貨架期保持至4 d。20 ℃和40 ℃處理較30 ℃的脫色效果更顯著，并且40 ℃處理的L*值在貨架期持續(xù)保持最大（P＜0.05）；20 ℃處理于貨架1 d后降為30 ℃同等水平。兩種濃度H2O2處理均降低了核桃仁的L*值（P＜0.05），在之后0～1 d內(nèi)逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平，3 d時(shí)0.5% H2O2處理組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。說明H2O2處理暫時(shí)增加了核桃仁褐變程度，并以0.5%較1.0% H2O2促進(jìn)褐變作用更強(qiáng)?？傮w上，依據(jù)L*值的提升和保持能力看出40 ℃ 1.0% AsA處理的脫色和抑制褐變能力最強(qiáng)，可是，在之后4 d貨架期中該組核桃仁出現(xiàn)霉變，表明40 ℃下核桃仁受到損傷，自身抗菌能力下降，降低了貨架期保鮮能力，因而選擇脫色效果僅次于它的20 ℃下1.0% AsA溶液為最佳處理?xiàng)l件。

圖2 不同脫色處理的核桃仁色值Fig. 2 Effect of different decolorization treatments on brightness (L*)value of walnut kernels

2.3 抑制褐變及脫色處理對(duì)核桃仁低溫貨架期褐變相關(guān)酶活力影響

2.3.1 對(duì)鮮核桃仁PPO、POD、PAL活力的影響

如圖3A所示，抑制褐變組的各處理核桃仁于低溫（5 ℃）貨架存放過程中，PPO活力整體呈上升趨勢(shì)。抑制褐變劑（1.00% AsA＋0.05% CA）單獨(dú)處理和與UVC的復(fù)合處理均對(duì)PPO活力升高具一定抑制作用，28 d前單獨(dú)處理均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），35 d后復(fù)合處理的抑制作用更強(qiáng)，顯著低于單獨(dú)處理，且PPO活力只有對(duì)照組的1/2，復(fù)合處理表現(xiàn)出較單獨(dú)處理對(duì)PPO活力更持久性抑制效果。

如圖3B所示，脫色處理組中，PPO活力整體也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，7 d后復(fù)合處理的PPO活力持續(xù)低于對(duì)照組（P＜0.05），單獨(dú)處理在28 d前作用不穩(wěn)定，并在前期出現(xiàn)暫時(shí)促進(jìn)褐變的現(xiàn)象；因此，脫色處理組亦為復(fù)合處理較單獨(dú)處理的作用更強(qiáng)。

POD也是參與多酚氧化，加促褐變的酶之一，但它需要H2O2作為氧供體，雖然它因消耗H2O2，可以減少活性氧對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的破壞[6]。如圖3C、D所示，低溫貨架期，抑制褐變和脫色處理核桃仁的POD活力均呈現(xiàn)起伏式上升趨勢(shì)，抑制褐變組中脫色單獨(dú)和復(fù)合兩處理在28 d前均顯著抑制了該酶活力的升高（P＜0.05），末期56 d時(shí)，單獨(dú)處理抑制效果又超過復(fù)合處理（圖3C）；脫色組中僅單獨(dú)處理在35 d后對(duì)POD活力表現(xiàn)出持續(xù)抑制作用，之前兩處理的作用均不穩(wěn)定（圖3D）。結(jié)果表明，就抑制POD活力而言，無(wú)論抑制褐變還是脫色處理效果，均為所選濃度的AsA單獨(dú)處理作用更強(qiáng)。

由圖3E、F可看出，抑制褐變和脫色兩組處理中，PAL活力均隨貨架期的延長(zhǎng)而增大。抑制褐變組的單獨(dú)處理和復(fù)合處理在14～21 d其PAL活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在脫色組中，單獨(dú)處理的PAL活力在14～21 d和35 d均顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），復(fù)合處理在21 d和35 d顯著高于AsA，表明AsA＋CA處理穩(wěn)定增強(qiáng)了鮮核桃仁貨架期PAL活力，UVC有一定的增效作用。

圖3 抑制褐變和脫色處理分別對(duì)核桃仁低溫（5 ℃）貨架期PPO（A、B）、POD（C、D）和PAL（E、F）活力的影響Fig. 3 Influence of browning inhibition and decolorization treatments on polyphenol oxidase (A, B), peroxidase (C, D) and phenylalanine ammonia lyase activity (E, F) in walnut kernels during low-temperature (5 ℃) storage

2.3.2 AsA抑制PPO酶動(dòng)力學(xué)分析

如圖4所示，種皮和核桃仁的PPO對(duì)各濃度底物的氧化反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）均隨AsA濃度的增大而增大，表明V隨AsA濃度的增大而遞減。各條線相交于第二象限，與X軸的交點(diǎn)隨著AsA濃度增大而絕對(duì)值減小，意味著1/Km的絕對(duì)值減小，Km增大，即PPO對(duì)底物的親合力隨AsA濃度增大而減少，同時(shí)，各條線與Y軸的交點(diǎn)隨AsA濃度增大有微弱增加，AsA在反應(yīng)液中的出現(xiàn)主要影響PPO對(duì)底物的親和力，對(duì)反應(yīng)最大速率（Vmax）影響較弱，即AsA抑制核桃仁種皮和核桃仁PPO活力的作用類型主要屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)抗壞血酸抑制核桃仁種皮（A）和核桃仁（B）PPO活力的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig. 4 Lineweaver-Burk double reciprocal plots for inhibition of various concentrations of ascorbic acid on PPO activity from walnut seed coat (A) and peeled kernel (B)

2.3.3 對(duì)鮮核桃仁DPPH自由基清除率、總抗氧化能力的影響

DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱可以反映果實(shí)的抗氧化能力，清除率越大果實(shí)的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖5A、B可見，抑制褐變組和脫色組核桃仁在低溫貨架期對(duì)DPPH自由基清除率均呈波動(dòng)性變化。抑制褐變實(shí)驗(yàn)中，僅單獨(dú)處理的DPPH自由基清除率于28、56 d顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），復(fù)合處理也于14、28 d均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其他觀測(cè)點(diǎn)兩處理與對(duì)照組沒有顯差異（P＞0.05）；脫色處理中，復(fù)合處理較AsA＋CA單獨(dú)處理表現(xiàn)出一定的增強(qiáng)DPPH自由基清除能力的作用，在21 d前和35 d保持DPPH自由基清除率最高，且35 d與對(duì)照組和單獨(dú)處理的差異顯著（P＜0.05）。圖5C、D顯示，進(jìn)入貨架期，對(duì)照組核桃仁FRAP均表現(xiàn)為前7 d增大之后下降。抑制褐變實(shí)驗(yàn)中，AsA＋CA處理降低了FRAP。復(fù)合處理對(duì)FRAP部分時(shí)間會(huì)促進(jìn)FRAP升高，21 d時(shí)高于對(duì)照組；脫色實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合處理組在貨架中期21～35 d其FRAP顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），AsA＋CA單獨(dú)處理組于14 d時(shí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）?？梢?，AsA單獨(dú)處理對(duì)核桃仁總抗氧化能力整體起負(fù)作用，復(fù)合處理具有局部促進(jìn)作用，UVC在促進(jìn)核桃仁抗氧化方面的作用強(qiáng)于AsA。

圖5 抑制褐變和脫色處理分別對(duì)核桃仁低溫（5 ℃）貨架期DPPH自由基清除率（A、B）、FPAP值（C、D）的影響Fig. 5 Influence of browning inhibition and decolorization treatments on DPPH scavenging capacity (A and B) and FRAP values (C and D) of walnut kernels during low-temperature (5 ℃) storage

2.3.4 抑制褐變和脫色處理對(duì)鮮核桃仁品質(zhì)變化和微生物生長(zhǎng)的影響

表1列出不同處理的核桃仁5 ℃（低溫）貨架期各品質(zhì)指標(biāo)取值和微生物數(shù)量的變化，對(duì)照組核桃仁的亮度（L*值）隨貨架期的延長(zhǎng)下降明顯，抑制褐變組兩處理在前21 d幾乎沒有下降，21～56 d降幅也只有對(duì)照組的1/3以下，使處理核桃仁在56 d時(shí)仍呈淺黃色，對(duì)照組已成為深褐色（圖6）；脫色處理組，在處理完畢時(shí)L*值提高7.4%，且在貨架21 d內(nèi)繼續(xù)有所增大，21～56 d內(nèi)小幅下降，終期56 d時(shí)處理核桃仁的L*值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，呈淺黃色，對(duì)照組已成為褐黃色（圖7）。兩組實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，UVC復(fù)合處理組均減少了56 d時(shí)樣品酸價(jià)的上升幅度，其他時(shí)間差異不顯著（P＞0.05）；抑制褐變實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)處理對(duì)酸價(jià)的影響與復(fù)合處理一致，脫色實(shí)驗(yàn)組中單獨(dú)處理影響不顯著（P＞0.05）。表明UVC較AsA在抑制核仁酸敗中發(fā)揮了更重要的作用。抑制褐變實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)和復(fù)合處理總體有促進(jìn)POV上升的趨勢(shì)，雖然21 d時(shí)處理組與對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05），35 d時(shí)單獨(dú)與復(fù)合處理均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），56 d時(shí)復(fù)合處理POV進(jìn)一步增大，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；脫色實(shí)驗(yàn)組的復(fù)合處理在56 d時(shí)POV顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

兩組實(shí)驗(yàn)中，處理組和對(duì)照組核桃仁低溫貨架56 d均未發(fā)生肉眼可見霉變（圖6、7）。經(jīng)微生物檢測(cè)可知，新剝?nèi)〉暮颂胰首詭Ъ?xì)菌。無(wú)論抑制褐變處理還是脫色處理，兩種處理后細(xì)菌數(shù)均大幅減少或檢測(cè)不出，說明浸泡處理對(duì)核桃仁有清潔作用。貨架中期（21 d），兩組實(shí)驗(yàn)中的處理核桃仁仍然保持著細(xì)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組的狀態(tài)；但貯存至35 d和56 d，AsA＋CA單獨(dú)處理都較對(duì)照組促進(jìn)了霉菌的滋生，UVC復(fù)合處理抵消了這一效應(yīng)，使處理核桃仁在35 d時(shí)霉菌數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），56 d時(shí)差異不顯著。60～70 d間對(duì)照組和處理組陸續(xù)出現(xiàn)可見霉變，不可再存。低溫貨架21 d時(shí)，各組核桃仁風(fēng)味正常可食，56 d時(shí)兩組實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組具有輕微的酸苦味，兩個(gè)處理組仍正?？墒?。

表1 不同處理的核桃仁低溫貨架期品質(zhì)變化的影響Table 1 Effects of different treatments on quality attributes of walnut kernels stored at low temperatures

圖6 抑制褐變處理核桃仁低溫貨架前后狀態(tài)Fig. 6 Appearance of walnut kernels subjected to browning inhibition before and after low-temperature storage

圖7 脫色處理核桃仁低溫貨架前后狀態(tài)Fig. 7 Appearance of decolorized walnut kernels before and after lowtemperature storage

3 討 論

3.1 核桃仁抑制褐變（護(hù)色）和脫色方法相似的原因分析

核桃仁種皮的L*值在貨架期間逐漸變小，核桃仁色澤逐漸變深，這與徐賽等[30]發(fā)現(xiàn)的常溫下貯藏荔枝L*值隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，荔枝的亮度逐漸降低的現(xiàn)象一致，屬于典型的酶促褐變現(xiàn)象。PG富含酚羥基，食品上推薦用于油脂類產(chǎn)品抗氧化。本研究中0.05%～0.3% PG反而促進(jìn)了核桃仁顏色的加深，與前人在龍眼[11]和高新梨[12]上取得結(jié)果不一致。由于0.01% PG自身產(chǎn)生顏色效應(yīng)，且GB 2760ü2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定其用量不得超過0.1?g/kg[31]，因此推測(cè)，供試濃度PG自身的著色效應(yīng)大于其抑制PPO而產(chǎn)生的減色效應(yīng)，不適合用于核桃仁此類非呈色產(chǎn)品，更高濃度PG處理將超越國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，也不必進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；熱處理在其他果實(shí)上取得抑制褐變的明顯效果[13]，本實(shí)驗(yàn)取得了類似結(jié)果，只是產(chǎn)生了風(fēng)味和質(zhì)地的改變，表明核桃仁對(duì)熱敏感，遇熱易于軟化和熟化等，不宜采用。蛋白酶可以使催化酶促褐變的酶系失活，其中木瓜蛋白酶是一種使用較普遍的褐變抑制劑[15]。但本研究中其效果不及AsA，可能與該酶最適作用溫度為55～65 ℃[32]，而本研究卻在20 ℃下應(yīng)用有關(guān)。此外，木瓜蛋白酶處理后的核桃仁因蛋白質(zhì)受損、仁衣易于碎化、產(chǎn)品外觀整齊度降低而效果不理想（資料未顯示），表明該酶更適合用于液體或面食等非有形食材的脫色。AsA是一種常見的褐變抑制劑，許彬[33]和連文綺[34]等研究發(fā)現(xiàn)其在抑制馬鈴薯、板栗和鮮切蘋果褐變都具有較好的效果；本研究結(jié)果表明，0.5%～2.0% AsA附加其強(qiáng)化劑CA處理5?min均可抑制核桃仁褐變，與馬鈴薯等材料上取得的結(jié)果一致。0.5% AsA＋0.05% CA在56 d低溫貨架期維持了最高水平的L*值，在所有處理中效果最佳。本研究發(fā)現(xiàn)，AsA作為PPO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑能夠降低PPO對(duì)多酚氧化反應(yīng)的活力，故而在抑制褐變實(shí)驗(yàn)中，使未發(fā)生褐變或輕微褐變的核桃仁的L*值下降延緩。

H2O2作為一種氧化型漂白劑在食品中應(yīng)用廣泛，其作用原理是利用H2O2與生色基團(tuán)或色素反應(yīng)，破壞色素基團(tuán)[18]。H2O2通過氧化破壞木質(zhì)素，可使纖維素及其產(chǎn)品成功脫色[17-18]。本研究在脫色方法的篩選中，0.5%和1.0% H2O2處理未能使褐變的核桃仁脫色，相反增加了核桃仁L*值，即褐變程度加重，這與H2O2破壞細(xì)胞分區(qū)隔室，促進(jìn)酚類氧化反應(yīng)有關(guān)[35]。這一結(jié)果也間接說明核桃仁種皮褐色物積累不含有木質(zhì)素形成因素。AsA作為強(qiáng)還原劑，供給氫質(zhì)子，使初級(jí)褐變產(chǎn)物醌還原為酚而褪色。甘伯中等[36]曾報(bào)道0.005% AsA可使枸杞汁脫色，本實(shí)驗(yàn)采用1.0% AsA浸泡1 h發(fā)現(xiàn)核桃仁L*值顯著增大，證實(shí)了AsA對(duì)固態(tài)植物組織也具脫色效應(yīng)，其后續(xù)56 d低溫貨架期L*值一直顯著低于對(duì)照組，表明該作用具有持續(xù)性。處理溫度升高至40 ℃增進(jìn)了脫色效果，顯示AsA將醌還原為酚的反應(yīng)受加熱促進(jìn)，但又會(huì)使核桃仁出現(xiàn)輕微破損而削弱對(duì)微生物的抗性，故1.0% AsA于20 ℃下浸泡1 h是核桃仁脫色處理的最佳選擇。因此，AsA既被選為最佳的抑制褐變劑，也是有效的脫色劑，是可應(yīng)用于生產(chǎn)的一種實(shí)用處理方法。

3.2 AsA抑制核桃仁氧化酶和促進(jìn)抗氧化活性作用的差異性

本研究測(cè)定發(fā)現(xiàn)，核桃仁在低溫貨架期，其PPO、POD活力持續(xù)上升，抑制褐變或脫色處理下該兩酶活力全程或部分被抑制，與范靈姣等[37]在柿果實(shí)、侯曉婉等[38]在菠蘿上得到的結(jié)果一致。附加UVC的復(fù)合處理對(duì)上述兩種酶活力抑制作用有加強(qiáng)趨勢(shì)，表明附加適宜劑量UVC處理也強(qiáng)化了對(duì)核桃仁氧化酶的抑制作用，許斌等[39]對(duì)黃蘑菇的研究得出，UVC照射增強(qiáng)了植物材料對(duì)逆境的適應(yīng)性，減少活性氧產(chǎn)生，而降低氧化酶活力。其他對(duì)植物的研究大多得出AsA含量升高或外源AsA處理促進(jìn)植物抗氧化活性的結(jié)果[40-41]，本研究發(fā)現(xiàn)，AsA單獨(dú)處理或與UVC復(fù)合處理均僅在局部階段提高了DPPH自由基清除率和增強(qiáng)了總抗氧化能力（FRAP），這兩種處理在脫色組增強(qiáng)抗氧化能力的作用強(qiáng)于抑制褐變組。由于抑制褐變材料僅輕微褐變（L*值為43.04），自身DPPH自由基清除率高（約80%）；脫色組材料褐變重（L*值為38.72），DPPH自由基清除率有所降低（約65%），可以推斷，未褐變或輕微褐變的新鮮核桃仁其抗氧化物質(zhì)含量接近飽和，外源AsA處理難以再產(chǎn)生增效；貯存后發(fā)生了一定程度褐變的核桃仁則可能因自身還原物質(zhì)的虧缺，對(duì)外源AsA響應(yīng)較為靈敏。且褐變的核桃仁經(jīng)處理后，除了AsA促進(jìn)其醌類氧化產(chǎn)物還原為無(wú)色化合物外[18]，其抗氧化活性也有所增強(qiáng)，有利于持續(xù)抑制氧化反應(yīng)，從而表現(xiàn)出脫色效應(yīng)的持久性。

3.3 抑制褐變處理與核桃仁品質(zhì)保持及微生物控制的關(guān)系

PAL對(duì)植物的抗病性具有重要作用[6]。AsA處理也顯著增強(qiáng)了貨架中前期（14～21 d）PAL活力，與Song?Mubo等[42]在菱角上得到的結(jié)果一致。可是，依據(jù)AsA處理促進(jìn)霉菌滋生的結(jié)果，雖然該處理促進(jìn)了苯丙氨酸途徑的合成作用，可能導(dǎo)致總酚含量升高，卻不足以達(dá)到在抵抗微生物侵染方面的顯著作用。因此，在以AsA為主劑的抑褐或脫色處理中，附加無(wú)公害的UVC或其他殺/抑菌處理是必要的。

油脂含量是評(píng)價(jià)核桃仁品質(zhì)的重要指標(biāo)，核桃仁中富含人體不能合成的亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，是其營(yíng)養(yǎng)與保健功效的重要成分[4]。結(jié)果表明，既使在低溫貯藏條件下，核桃仁油脂也在發(fā)生著大幅度的降解，56 d最大降幅為20%（抑制褐變組的對(duì)照組），這與Ma?Yanping等[43]在脫青皮濕鮮核桃氣調(diào)貯藏中取得的結(jié)果接近，他們測(cè)得‘西扶1號(hào)’核桃低溫（0 ℃）貯藏60 d，油脂含量下降25%。綜上，鮮食核桃貯藏期油脂作為呼吸基質(zhì)消耗較快。本研究中抑制褐變的兩種處理和脫色實(shí)驗(yàn)的復(fù)合處理均減少了油脂酸價(jià)的升高量。推測(cè)AsA除抑制氧化酶活力外，還作為活性氧清除劑和UVC殺菌作用相疊加，共同發(fā)揮了減少活性氧積累的作用，有利于油脂分解和游離脂肪酸降解均衡進(jìn)行，較對(duì)照組的酸敗產(chǎn)物積累少。但在貨架時(shí)間達(dá)35 d后，復(fù)合處理顯著促進(jìn)了POV的升高，POV表征脂肪酸被氧化后積累的氫過氧化物含量[44]，這種UVC處理促進(jìn)油脂過氧化物產(chǎn)生，卻抑制酸價(jià)的正、負(fù)效應(yīng)共存的現(xiàn)象鮮見報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。然而，GB 2716ü2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》中規(guī)定，含油食品中油脂的酸價(jià)和POV分別不得超過4?mg/g、0.25?g/100?g[45]，本研究中各組樣品的酸價(jià)和過氧化值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于超標(biāo)臨界值，均不構(gòu)成對(duì)品質(zhì)影響的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

本研究進(jìn)行了新鮮核桃仁抑制褐變方法和褐變核桃仁脫色方法兩大組實(shí)驗(yàn)，篩選出1.0% AsA＋0.05% CA浸泡5?min為最佳抑褐處理?xiàng)l件；1.0% AsA 20 ℃浸泡1 h為最佳脫色處理?xiàng)l件。兩種最佳處理?xiàng)l件單獨(dú)、或與1 kJ/m2UVC復(fù)合，可在5 ℃低溫下將核桃仁保持在淺黃色56 d以上，且脫色組（褐變核桃仁為原料）效果接近抑制褐變組（未褐變）核桃仁的色澤（L*值）。

抑制褐變、脫色單獨(dú)和復(fù)合處理部分抑制了貨架期核桃仁的PPO、POD活力，減緩核桃仁褐變，抑制酸價(jià)上升，增強(qiáng)總抗氧化能力，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。復(fù)合處理延遲了霉菌滋生，使鮮核桃仁在56 d時(shí)仍風(fēng)味正常，對(duì)照組已經(jīng)不可食用。本研究確定了長(zhǎng)達(dá)56 d的鮮核桃仁保質(zhì)方法，同時(shí)也為褐變失鮮核桃仁的復(fù)鮮生產(chǎn)提供了理論與技術(shù)支撐，可用于延長(zhǎng)鮮核桃仁貨架期。