乳酸和過氧乙酸對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用及其機制

吳麗娜，劉昀閣，張一敏,2，毛衍偉，梁榮蓉，楊嘯吟，羅 欣,2,3，董鵬程,*，朱立賢,*

（1.山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.國家牛肉加工技術研發(fā)專業(yè)中心，山東 泰安 271018；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

大腸桿菌O157:H7作為一種食源性致病菌可引起人類感染性腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合征等疾病，嚴重時可導致死亡[1]。大腸桿菌O157:H7對食品的污染是導致與上述疾病爆發(fā)的主要原因，肉、乳制品以及其他食品等都可以作為大腸桿菌O157:H7的載體[2-3]。大腸桿菌O157:H7之所以在食品工業(yè)中難以清除，主要歸因于其具有生物膜形成能力，可在加工器械表面附著[4]。生物膜是指微生物為了適應環(huán)境，通過分泌大量的多糖、蛋白質和核酸等胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS），將菌體自身包裹在立體結構中而形成的菌體聚集膜樣物。生物膜是菌體在自然界中一種常見的生存狀態(tài)，直接影響著食品安全和人體健康等各個方面[5]。據報道，細菌生物膜可以在各種材料的表面形成，例如陶瓷、玻璃、木材、不銹鋼和塑料[2,6]。如果沒有經過適當的清潔處理，微生物可以在食物接觸表面上定植并持續(xù)存活。生物膜被認為是食品加工中交叉污染的主要風險因素之一，且相比于浮游菌，生物膜的形成使大腸桿菌O157:H7對外界不良環(huán)境具有更強的耐受性[4]。這一特性使對大腸桿菌O157:H7生物膜的有效控制成為了食品加工安全防控的一大難題。

有機酸作為一種天然的有機化合物對食源性病原體具有顯著的抑制作用。其中，乳酸（lactic acid, LA）被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food Drug Administration，FDA）指定為一種被公認安全（generally recognized as safe，GRAS）的消毒劑，已在肉牛屠宰加工中應用[7]。而過氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）作為一種環(huán)境友好型的消毒劑，可以被分解為過氧化氫和乙酸，也常被用于微生物的控制[8]?，F有研究表明，有機酸主要通過破壞細菌的蛋白質、酶和其他代謝產物，以及破壞細胞通透性來發(fā)揮抑菌作用[9-10]。然而，目前關于LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用研究較少，且LA和PAA對于大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機理尚不完全明確。本課題組前期研究發(fā)現肉牛屠宰工廠來源的大腸桿菌O157:H7具有生物膜形成能力[11]，本研究在此基礎上選取一株成膜能力較強的大腸桿菌O157:H7野生菌株為研究對象，探究LA和PAA對其生物膜的抑制作用。并從代謝活性、EPS含量、微觀結構和基因相對表達等方面探究LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機理，從而為食品實際生產加工過程中大腸桿菌O157:H7的有效控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

實驗所使用的菌株為分離自我國肉牛屠宰企業(yè)中的大腸桿菌O157:H7野生菌株，攜帶毒力基因stx2、eaeA、hlyA[12]，現保藏于山東農業(yè)大學食品科學與工程學院畜產品加工實驗室。

苯酚、氯化鈉、無水葡萄糖、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司；PAA 北京西亞公司；細胞培養(yǎng)板美國康寧公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、0.01 mol/L） 北京索萊寶科技有限公司；LA上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LIVE/DEAD染料美國賽默飛世爾科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、SYBR?Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus） 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

1300 SERIES A2生物安全柜 美國賽默飛世爾科技有限公司；DHP系列智能型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；PTC-200實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（配CFX 96檢測系統(tǒng)）美國Bio-Rad公司；SpectraMax M5微孔板檢測系統(tǒng)美國Molecular Devices公司；GeneQuant 100微量核酸蛋白測定儀 英國Biochrom公司；5804R離心機德國Eppendorf公司；SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本HITACHI公司；LSM880激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

菌種凍存（－80 ℃）于25%（體積分數）甘油中，實驗前取20 μL接種于20 mL新鮮的TSB培養(yǎng)液中進行活化，37 ℃培養(yǎng)18 h進行活化，經2 次活化后的菌液備用。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7生物膜中活菌數的測定

在96 孔板中分別加入180 μL TSB培養(yǎng)基并接種20 μL活化后的菌液，菌體終濃度為1h106CFU/mL，于37 ℃培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后，棄去孔內培養(yǎng)液，用0.85%（質量分數，下同）NaCl溶液沖洗3 次，以除去孔內未黏附的浮游菌。用無菌刮刀將附著在96 孔板的生物膜刮下，重懸于200 μL 0.85% NaCl溶液中，用移液槍反復吸打混勻，取100 μL重懸后的菌液梯度稀釋，采用胰蛋白胨大豆瓊脂平板法測定生物膜中活菌數[13]，以評估大腸桿菌O157:H7生物膜形成能力。

1.3.3 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7最小抑菌劑量的測定

配制含體積分數8% LA或0.32% PAA的TSB培養(yǎng)基，后在96 孔板中進行連續(xù)2 倍稀釋，使LA的終體積分數分別為4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%、0.031 25%，PAA的終體積分數分別為0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002 5%、0.001 25%。在96 孔板中分別加入180 μL含不同劑量的LA或PAA的TSB培養(yǎng)基，接種20 μL活化后的菌液，菌體終濃度為1h106CFU/mL。其中，不同劑量的LA或PAA培養(yǎng)基制備方法如下：同時以只含有200 μL TSB培養(yǎng)基作為空白對照。96 孔板在37 ℃下孵育24 h后，用酶標儀測定OD600nm。與空白對照組OD600nm無顯著差異的最小劑量確定為LA或PAA對大腸桿菌O157:H7的最小抑菌劑量（minimum inhibitory concentrations，MIC）[2]。

1.3.4 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜抑制作用的分析

在96 孔板中分別加入20 μL活化后的菌液，然后加入180 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基，菌體終濃度為1h106CFU/mL，LA或PAA終劑量分別為0（對照組）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于37 ℃下培養(yǎng)4 d，棄去孔內培養(yǎng)液，用0.85% NaCl溶液沖洗3 次，以除去孔內未黏附的浮游菌。用無菌刮刀將附著在96 孔板的生物膜刮下，重新懸浮于200 μL 0.85% NaCl溶液中，然后參考1.3.2節(jié)方法進行梯度稀釋，采用胰蛋白胨大豆瓊脂平板法進行菌落計數測定生物膜中活菌數，評估LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用[13]。

1.3.5 大腸桿菌O157:H7生物膜中細胞代謝活性的測定

96 孔板中每孔加入180 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基，接種20 μL活化的菌液（菌體終濃度為1h106CFU/mL），培養(yǎng)基中LA或PAA的終劑量分別為0（對照組）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于37 ℃下培養(yǎng)4 d，取出96 孔板，將孔中的浮游菌吸出，用無菌PBS沖洗3 次，每孔加入100 μL PBS和10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光培養(yǎng)4 h，在450 nm波長處測其吸光度A，按下式計算抑制率[14]。

1.3.6 大腸桿菌O157:H7生物膜胞外聚合物質量濃度的測定

24 孔板中每孔加入1 800 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基并接種200 μL活化后的菌液（菌體終濃度為1h106CFU/mL），培養(yǎng)基中LA或PAA終劑量為MIC，以等體積不含LA和PAA的TSB培養(yǎng)基為對照組，37 ℃下培養(yǎng)至4 d，取出24 孔板，將孔中的浮游菌吸出，用無菌PBS沖洗3 次，重新懸浮于1 mL無菌PBS中，用移液槍反復吸打混勻后取1 mL生物膜樣品加入0.4 mL 1 mol/L NaOH，150 r/min、4 ℃振蕩3 h，加入0.6 mL 0.85% NaCl溶液，6 000hg、4 ℃離心20 min，上清液經0.45 μm濾膜過濾待測。用苯酚-硫酸法測定胞外多糖質量濃度[14-15]，參考BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白質量濃度[15]。

1.3.7 大腸桿菌O157:H7生物膜相關基因表達的測定

24 孔板中每孔加入1 800 μL含不同劑量LA或PAA的TSB培養(yǎng)基并接種200 μL活化后的菌液（菌體終濃度為1h106CFU/mL），培養(yǎng)基中LA或PAA終劑量為MIC，以等體積不含LA和PAA的TSB培養(yǎng)基為對照組，37 ℃下在細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至4 d，使用RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行生物膜和浮游菌的RNA的提取。然后分別用離心管收集每個細胞培養(yǎng)皿中的浮游細菌。細胞培養(yǎng)皿用無菌PBS洗滌3 次。使用RNAiso Plus試劑盒從生物膜和浮游細菌中分離總RNA，然后將每個RNA樣品用重組DNase I處理。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒對DNase處理的RNA進行逆轉錄。稀釋cDNA后，將2 μL cDNA用作實時熒光定量PCR的模板，參照實時熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix ExTaq?（Tli RNaseH Plus）說明書進行測定，實時熒光定量PCR的基因和引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成。

表1 實時熒光定量PCR基因及引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.3.8 大腸桿菌O157:H7生物膜微觀結構觀察

SEM觀察：將菌液接種于48 孔板中，在TSB培養(yǎng)基和BE中分別加入不同含量的LA和PAA，使得LA和PAA終劑量為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，37 ℃下將無菌聚苯乙烯圓片放進孔中培養(yǎng)至4 d，PBS洗滌后將圓片用2.5%（體積分數）戊二醛溶液固定，在4 ℃固定12 h后晾干，使用1%（體積分數）的鋨酸溶液固定90 min，然后依次用體積分數為30%、50%、80%、90%、100%的乙醇梯度脫水，每次10 min，最后使用100%叔丁醇洗滌。將處理后的圓片噴金用于SEM觀察，放大倍數為5 000[6]。

CLSM觀察：將活化的菌懸液接種于細胞培養(yǎng)板中，在TSB培養(yǎng)基中分別加入不同含量的LA和PAA，使得LA和PAA終劑量分別為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，37 ℃培養(yǎng)4 d后，將浮游菌去除后用PBS沖洗掉多余的浮游菌，風干后使用LIVE/DEAD染料對生物膜進行染色，試劑盒中含有的探針SYTO-9與碘化丙啶能分別使活、死細胞在CLSM下呈現綠色、紅色熒光，使用染色液時按照1 mL PBS溶液中分別加入試劑盒中兩種染液各3 μL的比例配制，染液現配現用并避光保存。在風干的細胞培養(yǎng)板中每孔加入的500 μL熒光染料，避光染色30 min，吸除染液后使用PBS溶液洗去多余探針，風干在細胞培養(yǎng)板表面滴加無菌水，加蓋玻片，于－20 ℃避光保存。生物膜樣品使用CLSM（配63×油浸物鏡與488 nm氬激光器成像），在480～500 nm發(fā)射波長范圍收集SYTO-9熒光和490～635 nm發(fā)射波長范圍收集碘化丙啶熒光。3D投影使用ZEN Blue Lite 2_3軟件的z-stacks簡易3D功能重建[16]。

1.4 數據處理與分析

實驗數據設置3 個平行，實驗結果以平均值±標準差表示。采用SAS 9.0軟件的混合模型對LA和PAA生物膜抑制作用以及生物膜代謝活性進行統(tǒng)計分析，采用SPSS軟件對生物膜活菌數、生物膜多糖蛋白含量以及基因相對表達量進行單因素分析，通過t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Bio-Rad CFX Manager軟件對熒光定量基因表達部分數據進行相對定量處理及分析，采用2?ΔΔCt法評估目標基因的相對表達量變化。采用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時間大腸桿菌O157:H7生物膜中的活菌數

使用平板計數法對大腸桿菌O157:H7在聚苯乙烯表面的生物膜形成能力進行了分析，由圖1可知，隨著時間的延長，生物膜呈現出一種逐漸增高而后穩(wěn)定的趨勢，大腸桿菌O157:H7在培養(yǎng)4 d后生物膜中活菌數變化不顯著（P＞0.05），說明此時大腸桿菌O157:H7達到成熟狀態(tài)。因此后續(xù)實驗LA和PAA處理大腸桿菌O157:H7生物膜的時間為4 d。

圖1 大腸桿菌O157:H7生物膜中活菌數Fig. 1 Viable cell count in E. coli O157:H7 biofilm as a function of culture time

2.2 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用

比較不同劑量LA和PAA處理組與空白對照組的OD600nm可知，LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生長的MIC分別為0.25%和0.002 5%。根據MIC設置亞MIC，分析LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制作用。由表2可知，隨著劑量的增加，LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制效果顯著增強。在2 MIC時，LA和PAA處理下均未檢出生物膜中大腸桿菌O157:H7。在MIC時，相對于對照組，LA和PAA均顯著抑制了大腸桿菌O157:H7生物膜形成（P＜0.05）。

表2 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜形成的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of LA and PAA on E. coli O157:H7 biofilm formation

2.3 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的影響

本研究使用CCK-8試劑盒對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性進行測定，CCK-8溶液在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被細胞中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的黃色甲瓚產物，其顏色的深度與細胞的活力成正比。由圖2可知，隨著LA和PAA劑量的增加，大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的抑制率也隨之增強。2 MIC的LA及PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的抑制率超過90%，且LA及PAA對代謝活性的抑制率之間無顯著差異（P＞0.05）。LA和PAA劑量為MIC時，大腸桿菌O157:H7生物膜的代謝活性分別降低了84.25%和43.49%，其中LA抑制作用顯著優(yōu)于PAA（P＜0.05）。

圖2 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性的抑制率Fig. 2 Percentage inhibition of LA and PAA on the metabolic activity of E. coli O157:H7 biofilm

2.4 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜胞外聚合物的影響

圖3 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜EPS質量濃度的影響Fig. 3 Effects of LA and PAA on the contents of extracellular polymeric substances in E. coli O157:H7 biofilm

培養(yǎng)至第4天，大腸桿菌O157:H7生物膜EPS中胞外多糖和蛋白質量濃度的測定結果如圖3所示。對照組大腸桿菌O157:H7生物膜中多糖質量濃度為9.86 μg/mL，蛋白質量濃度為87.78 μg/mL，各組生物膜中胞外蛋白質量濃度明顯高于胞外多糖的質量濃度。MIC的LA和PAA處理使大腸桿菌O157:H7的胞外多糖和胞外蛋白形成均顯著降低（P＜0.05）。在生物膜形成過程中，細菌會產生EPS，以減小抗生素、消毒劑等不利環(huán)境的影響，且胞外多糖和胞外蛋白是EPS的主要組成成分[5]。本研究結果表明，與對照組相比，MIC LA使大腸桿菌O157:H7生物膜的胞外蛋白質量濃度減少了88.34%，抑制效果顯著優(yōu)于PAA（P＜0.05）。

2.5 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜微觀結構的影響

對照組和不同劑量LA和PAA處理下大腸桿菌O157:H7生物膜的SEM和CLSM圖像結果如圖4所示。由SEM結果可知，未添加有機酸的對照組中細菌數量較多、菌體排列緊密且菌體結構完整。而用MIC、1/2 MIC、1/4 MIC的LA和PAA處理后，大腸桿菌O157:H7生物膜中細菌排列分散、數量明顯減少。且LA和PAA的劑量越高對生物膜中細菌數量的抑制作用越明顯，即MIC的LA和PAA抑制效果最好，并且可以觀察到在該劑量下兩種有機酸對大腸桿菌O157:H7的細菌形態(tài)存在破壞作用。該結果與生物膜中活菌數的測定結果相一致，在MIC下，LA和PAA均能有效的抑制大腸桿菌O157:H7生物膜的形成。相似的，有學者研究了大腸桿菌O157:H7在LA處理下的生物膜形成，孵育5 d后，對照組形成了成熟的生物膜結構且細菌細胞大量積累，而處理組中生物膜數量少，且較為分散[6]。

由CLSM圖像可以看出，在對照組中細菌數量較多并形成了聚集的立體結構，且主要呈現綠色熒光，即生物膜中活菌居多。與SEM結果類似，加入抑制劑處理后，大腸桿菌O157:H7生物膜中的細菌生長較為分散，且呈現不同程度的紅色熒光，死菌數量變多。觀察經1/4 MIC、1/2 MIC、MIC的LA和PAA處理后的CLSM圖像，發(fā)現隨著LA和PAA劑量的增加，大腸桿菌O157:H7生物膜中的活菌數逐漸減少，其中MIC的LA和PAA抑制效果最佳。有學者用CLSM觀察大腸桿菌O157:H7生物膜的3D結構，同樣發(fā)現在對照組中大腸桿菌O157:H7呈現一個聚集的空間結構。而用蘋果酸處理后，大多數細菌以單個細胞的形式存在[17]。綜合SEM和CLSM對大腸桿菌O157:H7生物膜微觀結構的觀察結果，可知MIC的LA和PAA可有效抑制大腸桿菌O157:H7生物膜形成。

圖4 大腸桿菌O157:H7生物膜對照組及抑制組的SEM和CLSM圖Fig. 4 Scanning electron microscope and confocal laser scanning microscope images of E. coli O157:H7 biofilm in the control and inhibition groups

2.6 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜相關基因表達的影響

LA和PAA在MIC下對大腸桿菌O157:H7生物膜基因相對表達量的影響結果如圖5所示。LA和PAA均可顯著抑制大腸桿菌O157:H7生物膜中的群體感應基因luxS和sdiA、黏附基因csgA和flhC、胞外多糖合成基因csrA、adrB和adrA、應激因子rpoS以及PhoP/PhoQ和EnvZ/OmpR雙組分調控系統(tǒng)中phoQ、phoP、envZ、ompR的表達（P＜0.05）。但LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜基因相對表達量的影響也存在差異。LA顯著抑制了全局調控基因csgD的表達，而PAA對csgD的表達沒有顯著作用。PAA顯著抑制了應激因子iraM的表達，而LA則未見抑制作用。

圖5 LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜基因表達的影響Fig. 5 Effects of LA and PAA on gene expression in E. coli O157:H7 biofilm

3 討 論

有機酸通常被認為是一種安全、穩(wěn)定的化合物。未解離的有機酸具有親脂性，可以通過自由擴散穿過細菌細胞膜到達細胞內部，有機酸在細胞內解離，降低胞內pH值，改變細胞的內環(huán)境，從而影響細菌的正常生命活動，從而起到抑菌作用[18-19]?？紤]到大多數有機酸的弱酸性質，pH值環(huán)境是有機酸抑菌效果的主要影響因素，因為pH值會影響弱酸的電離平衡，從而決定未離解酸的濃度[20]。PAA由過氧化氫與乙酸反應形成，是一種過氧化物類消毒劑，具有使用范圍廣、效率高、毒性小等特點，在食品工業(yè)中應用廣泛[21-22]。PAA具有強氧化性，可以氧化細菌生命活動所需的關鍵酶、氨基酸和核酸等，并使DNA雙鏈被打開并發(fā)生裂解，從而達到抑菌的效果。LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的有顯著的抑制作用，但不同濃度LA和PAA對其抑制效果不一致。有研究評估了乙酸、檸檬酸和LA處理對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制效果，其中2%（體積分數）LA的生物膜抑制率為39.13%，與檸檬酸相比，LA和乙酸對大腸桿菌生物膜形成的抑制作用更強[23]。在生物膜形成過程中，微生物會產生EPS，EPS限制了消毒劑向生物膜中的擴散，消毒劑和生物膜成分之間可能存在相互作用[24]。因此，生物膜中微生物緩慢生長的狀態(tài)增加了其對消毒劑的抗性。本研究發(fā)現LA和PAA可以通過抑制大腸桿菌O157:H7 EPS的形成抑制生物膜產生，且LA對胞外蛋白的抑制效果優(yōu)于PAA。相似的，Amrutha等[23]評估了乙酸、檸檬酸和LA處理對大腸桿菌O157:H7生物膜形成能力的影響，結果表明LA處理使大腸桿菌O157:H7生物膜中EPS含量減少了13.42%，而檸檬酸和乙酸處理分別僅減少了6.25%和10.89%，LA抑制EPS產生的效果要優(yōu)于檸檬酸和乙酸。與本研究中SEM和CLSM結果一致，MIC的LA及PAA處理后，大腸桿菌O157:H7生物膜中細菌數量明顯減少，且大多呈現黃色甚至是紅色熒光，生物膜結構遭到破壞。綜上所述，LA和PAA抑制了大腸桿菌O157:H7生物膜中的多糖和蛋白的產生，使得EPS對細菌的保護作用減弱，LA及PAA更容易進入到生物膜內部，從而導致生物膜中菌體數量減少。

生物膜的形成受到很多因素的影響，形成過程是菌體多種特性共同作用的結果，其形成的相互作用機制一直都是研究的重點，尤其是基因水平的影響。本實驗從可能影響大腸桿菌O157:H7生物膜的特性入手，通過對群體感應基因（luxS、sdiA）、黏附基因（csgA、flhC）、全局調控基因（csgD）、應激響應因子（rpoS、iraM）、多糖合成相關基因（csrA、adrB、adrA）、PhoP/PhoQ和EnvZ/OmpR雙組分調控系統(tǒng)相關基因（phoQ、phoP、envZ、ompR）的分析，研究LA和PAA對這些調控基因在大腸桿菌O157:H7生物膜形成中的抑制規(guī)律，為進一步闡明其抑制機制提供參考。本研究發(fā)現，LA和PAA處理后黏附相關基因受到顯著抑制，進而抑制生物膜形成。在Hidalgo等[25]的研究中，蔓越莓提取物的加入能夠有效減小Escherichia coliCFT073的泳動能力，并且根據熒光定量PCR結果顯示鞭毛蛋白合成基因表達量下降，判定蔓越莓提取物可以通過抑制鞭毛的合成從而達到降低細菌泳動能力的作用進而抑制生物膜形成。Cong Yanguang等[26]的研究中也曾提到鞭毛合成相關基因的缺失能夠降低Citrobacter freundii細菌群體泳動能力，阻礙細菌在物體表面的移動。因此，抑菌劑對細菌附著過程成中黏附相關基因的抑制是其抑制生物膜形成的關鍵。此外，本研究發(fā)現，LA和PAA均顯著的抑制了群體感應基因（luxS、sdiA）的表達。有報道表明群體感應效應與細菌生物膜的形成、毒力侵襲特性和應激響應等生理特性密切相關[27]。因此，LA和PAA在MIC下抑制大腸桿菌O157:H7的群體感應相關基因的表達同樣是其有效抑制生物膜形成的關鍵原因。除上述機制外，LA和PAA均顯著抑制了多糖合成相關基因csrA、adrB和adrA的表達，這一結果解釋了圖3中MIC下LA和PAA對大腸桿菌O157:H7胞外多糖的顯著抑制作用。胞外多糖和蛋白是生物膜EPS的重要組成部分[24]，因此LA和PAA可通過抑制大腸桿菌O157:H7胞外多糖和蛋白的產生來抑制其生物膜形成。此外，有研究發(fā)現在禽致病性大腸桿菌中，phoP在禽致病性大腸桿菌生物膜形成中起著重要的調節(jié)作用，phoP的缺失減少了生物膜的形成[28]。本研究結果表明，LA和PAA均顯著抑制了PhoP/PhoQ雙組分調控的表達，但LA及PAA對phoP、phoQ基因表達無顯著差異。RpoS應激蛋白通過轉錄因子CsgD控制生物膜的形成和對環(huán)境脅迫的響應，研究表明缺乏rpoS的大腸桿菌細胞無法形成正常的生物膜[29]。本研究發(fā)現，LA及PAA均可以抑制rpoS的相對表達量。不同抑菌劑對細菌的抑制機制存在差異[30-31]，在本研究中，部分基因（csgD、iraM）在LA或PAA的作用下表達量沒有顯著降低，這表明LA和PAA處理對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機制存在一定差異，有待進一步研究。

4 結 論

LA及PAA在MIC下均可以通過抑制大腸桿菌O157:H7生物膜代謝活性和胞外蛋白和多糖的合成有效抑制大腸桿菌O157:H7生物膜的形成。且通過分析成膜關鍵基因表達量進一步發(fā)現，LA和PAA在MIC下均有效抑制了大腸桿菌O157:H7的黏附相關基因、群體感應相關基因、多糖合成相關基因以及雙組分調控系統(tǒng)。但同時發(fā)現LA和PAA對大腸桿菌O157:H7生物膜的抑制機制尚存在一定差異。因此，應進一步探究LA和PAA對基因作用的靶點，從而尋找特異性干預或檢測靶點以減少大腸桿菌O157:H7生物膜產生的風險。在大腸桿菌O157:H7生物膜生長過程中，菌株所處的環(huán)境以及生長狀態(tài)也會影響大腸桿菌O157:H7生物膜的形成機制。生物膜的形成和黏附在不同環(huán)境中可能是通過不同的機制完成的。這些菌株可能利用不同的策略，并根據可利用的培養(yǎng)條件不同使抑制劑針對生物膜形成的不同路徑起作用，而這些內容還有待于進一步研究。