畜禽消化道健康定量評估五環(huán)標(biāo)準(zhǔn)之——化學(xué)屏障

■楊小軍 張 俊 劉作華 王佳堃 孔祥峰 蘇 勇 曾祥芳 姚軍虎*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；3.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；4.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；6.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

消化道是動物采食、消化、吸收、利用、排泄等生理活動的主要場所，消化道通過“腸-腦軸、腸-肝軸、腸-腎軸和腸-肺軸”等通路影響畜禽各種生理生化活動。消化道與機(jī)體健康密切關(guān)聯(lián)，一定程度上消化道健康可體現(xiàn)機(jī)體健康。尤其是在禁用抗生素之后，研究消化道健康的標(biāo)志物，建立消化道健康的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，形成可調(diào)控腸道健康和功能的益生物等尤為重要?！靶笄菽c道健康與消化道微生物互作機(jī)制研究”項(xiàng)目組研究認(rèn)為消化道健康包括強(qiáng)有力的消化吸收、完整的物理屏障、特異性的化學(xué)屏障、穩(wěn)定的微生物區(qū)系和適度的黏膜免疫。以上指標(biāo)可以有效幫助宿主調(diào)控采食、營養(yǎng)利用、機(jī)體健康及繁殖生理等，可以作為評價(jià)畜禽消化道健康的標(biāo)準(zhǔn)。其中，消化道特異性的化學(xué)屏障主要包括其內(nèi)部酸堿環(huán)境、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）、消化酶、膽汁酸及其他上皮細(xì)胞分泌物或微生物代謝產(chǎn)物。

消化道內(nèi)特異性的化學(xué)屏障不僅具有維持菌群穩(wěn)態(tài)，阻止有害微生物與腸上皮接觸的作用，還可通過微生物代謝物與特定部位特異性結(jié)合來發(fā)揮信號調(diào)控作用，從而維持腸道與宿主的健康。大部分腸道化學(xué)屏障指標(biāo)在人類以及小鼠模型上研究得較為深入，對于畜禽而言，這些指標(biāo)是否可以作為評估畜禽消化道健康的生物標(biāo)記物還有待研究。目前關(guān)于消化道健康的衡量指標(biāo)尚未統(tǒng)一定論，大部分從胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和病變情況進(jìn)行判定，且缺乏具體可把控的定量評估標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果有一定的主觀影響。因此，研究旨在利用Meta分析方法，以奶牛瘤胃pH和揮發(fā)性脂肪酸對生產(chǎn)性能的影響及其與瘤胃健康關(guān)系為例，說明化學(xué)性屏障指標(biāo)在評價(jià)畜禽消化道健康研究中的作用與可行性。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索和篩選

文獻(xiàn)檢索：以“瘤胃pH”“瘤胃揮發(fā)性脂肪酸”“瘤胃發(fā)酵指標(biāo)”“瘤胃酸中毒”“亞急性瘤胃酸中毒”“奶?！薄皉umen pH”“rumen volatile fatty acids (VFAs)”“rumen fermentation parameters”“acute rumen acidosis”“subacute rumen acidosis”“dairy cow”和“cattle”等為單獨(dú)或組合關(guān)鍵詞，在Web of Science、PubMed、Science Direct、Elsevier、中國知網(wǎng)、萬方和維普等中英文數(shù)據(jù)庫中對2000-2020年的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，共得到568篇文獻(xiàn)，排除會議論文、會議摘要和未發(fā)表論文后得到293篇。

瘤胃pH和揮發(fā)性脂肪酸對生產(chǎn)性能的影響Meta分析文獻(xiàn)數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①體內(nèi)試驗(yàn)；②研究指標(biāo)同時(shí)包括瘤胃pH、瘤胃揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）、產(chǎn)奶量和乳成分產(chǎn)量。

瘤胃pH 和揮發(fā)性脂肪酸與瘤胃健康關(guān)系Meta分析文獻(xiàn)數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①體內(nèi)試驗(yàn)；②研究指標(biāo)同時(shí)包括瘤胃pH 和VFAs 及亞急性瘤胃酸中毒（SARA）狀況。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.2.1 奶牛瘤胃pH和揮發(fā)性脂肪酸對生產(chǎn)性能的影響Meta分析

數(shù)據(jù)經(jīng)整理后根據(jù)公式分別計(jì)算3.5%乳脂矯正乳（FCM）及飼喂效率（FE）。

FCM（kg/d）=泌乳量（kg/d）×0.432 4+乳脂率（%）×泌乳量（kg/d）×16.216

FE=FCM（kg/d）/干物質(zhì)采食量（DMI，kg/d）

根據(jù)自變量與因變量的散點(diǎn)關(guān)系，確定一次或二次回歸方法。數(shù)據(jù)采用STATA 15.1軟件進(jìn)行Meta分析，構(gòu)建一次和二次回歸模型。

式中：Yij——在第i個研究j水平因變量（生產(chǎn)性能）的觀測值；

Xij——在第i個研究j水平自變量（瘤胃VFAs或pH）的觀測值；

α——全部研究的回歸截距；

αi——第i個研究的隨機(jī)效應(yīng)；

b1和b2——分別為第i個研究一次和二次回歸系數(shù)；

eij——?dú)埐睢?/p>

回歸模型構(gòu)建以后，篩選R2＞0.300 進(jìn)行曲線擬合。利用STATA 15.1軟件計(jì)算回歸系數(shù)P值、模型均方根誤差（RMSE）以及決定系數(shù)（R2）。P＜0.05表示差異顯著，0.05≤P＜0.10表示具有趨勢。

1.2.2 奶牛瘤胃pH和揮發(fā)性脂肪酸與瘤胃健康關(guān)系Meta分析

使用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理歸納后，利用STATA 15.1軟件進(jìn)行Meta數(shù)據(jù)分析。文獻(xiàn)中均為連續(xù)性變量，使用標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）或均數(shù)差（MD）法進(jìn)行計(jì)算效應(yīng)尺度，置信區(qū)間（CI）采用95%CI表示。首先對納入的文獻(xiàn)采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析及異質(zhì)性檢驗(yàn)，以I2數(shù)值低于50%判定為無顯著異質(zhì)性，以P＜0.05判定總體效應(yīng)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)意義。當(dāng)異質(zhì)性不顯著時(shí)，采用固定效應(yīng)模型，當(dāng)異質(zhì)性顯著時(shí)采用隨機(jī)效應(yīng)模型。當(dāng)異質(zhì)性顯著時(shí)，通過改進(jìn)模型減小異質(zhì)性。文獻(xiàn)發(fā)表偏倚的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)使用Begg’s檢驗(yàn)和Egger’s檢驗(yàn)進(jìn)行，并以P＜0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛瘤胃pH 和VFAs 與生產(chǎn)性能的回歸分析（見表1和圖1）

瘤胃pH 和VFAs 與生產(chǎn)性能指標(biāo)（產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白含量、乳糖含量、3.5%乳脂矯正乳和飼喂效率）與VFAs[總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、乙酸比例、丙酸比例、丁酸比例、乙酸丙酸比]進(jìn)行一次和二次回歸模型構(gòu)建，并根據(jù)P值和R2篩選出每個指標(biāo)的最佳模型（見表1）。所有回歸方程各系數(shù)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），且為二次曲線關(guān)系，但是R2普遍較低；其中僅有瘤胃丁酸比例與乳糖含量二次曲線擬合模型的R2大于0.300（R2=0.665），并基于此進(jìn)行曲線擬合分析（見圖1）。

圖1 奶牛瘤胃丁酸比例與乳糖率二次曲線擬合模型

表1 奶牛瘤胃pH和VFAs與生產(chǎn)性能的回歸關(guān)系

2.2 SARA奶牛瘤胃pH Meta分析（見圖2）

異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SARA奶牛瘤胃pH研究間I2為60.3%且P＜0.01，表明研究間存在異質(zhì)性，因而采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量后進(jìn)行Meta分析。結(jié)果顯示，合并效應(yīng)量在無效線左側(cè)且不與其相交（見圖2），表明SARA顯著降低了瘤胃的pH（P＜0.05），平均可降低2.54 個單位。合并分析后SARA 奶牛瘤胃pH 平均為（5.93±0.139），健康對照組奶牛瘤胃pH平均為（6.27±0.144）。

圖2 SARA奶牛瘤胃pH Meta分析

2.3 SARA奶牛瘤胃TVFA濃度Meta分析（見圖3）

異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SARA奶牛瘤胃TVFA研究間I2為75.3%，且P＜0.01，表明研究間存在異質(zhì)性，因而采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量后進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果顯示，合并效應(yīng)量在無效線右側(cè)（見圖3），且不與無效線相交，表明SARA奶牛瘤胃TVFA濃度顯著增加（P＜0.05），平均可提高1.03個單位。合并分析后SARA奶牛瘤胃TVFA 平均為（121.93±15.11）mmol/L，健康對照組平均為（110.85±15.49）mmol/L。

圖3 SARA奶牛瘤胃TVFA濃度Meta分析

2.4 SARA奶牛瘤胃乙酸比例Meta分析（見圖4）

異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SARA 奶牛瘤胃乙酸比例研究間I2為57.6%，且P＜0.01，表明研究間存在異質(zhì)性，因而采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量后進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果顯示，合并效應(yīng)量在無效線左側(cè)（見圖4），且不與無效線相交，表明SARA奶牛瘤胃乙酸比例顯著降低（P＜0.05），平均可降低0.39 個單位。合并分析后SARA奶牛瘤胃乙酸比例范圍為（57.23±7.19）%，健康對照組為（60.72±7.10）%。

圖4 SARA奶牛瘤胃乙酸比例（%）Meta分析

2.5 SARA奶牛瘤胃丙酸比例Meta分析（見圖5）

異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SARA 奶牛瘤胃丙酸比例研究間I2為15.9%，且P=0.256，表明研究間不存在異質(zhì)性，因而采用固定效應(yīng)模型合并效應(yīng)量后進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果顯示，合并效應(yīng)量在無效線右側(cè)（見圖5），且不與無效線相交，表明SARA奶牛瘤胃丙酸比例顯著增加（P＜0.05），平均可增加0.5 個單位。合并分析后SARA奶牛瘤胃丙酸比例范圍為（25.62±6.35）%，健康對照組為（22.45±6.36）%。

圖5 SARA奶牛瘤胃丙酸比例（%）Meta分析

2.6 SARA奶牛瘤胃丁酸比例Meta分析（見圖6）

圖6 SARA奶牛瘤胃丁酸比例（%）Meta分析

異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SARA奶牛瘤胃丁酸比例研究間I2為0，且P=0.458，表明研究間不存在異質(zhì)性，因而采用固定效應(yīng)模型合并效應(yīng)量后進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果顯示，合并效應(yīng)量在無效線右側(cè)（見圖6），且不與無效線相交，表明SARA奶牛瘤胃丁酸比例顯著增加（P＜0.05），平均可增加0.49個單位。合并后SARA奶牛丁酸比例范圍為（12.97±3.17）%，健康對照組為（14.41±3.22）%。

2.7 發(fā)表偏倚分析（見圖7）

漏斗圖分析結(jié)果表明，SARA 奶牛瘤胃TVFA 濃度、pH、乙酸比例、丙酸比例和丁酸比例均集中在漏斗圖內(nèi)（見圖7），對稱性較好，僅有少量研究分布于漏斗圖外，說明研究的樣本量大、具有代表性，且試驗(yàn)精度高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

圖7 Meta分析SARA奶牛瘤胃VFAs指標(biāo)95%CI

3 討論

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，其發(fā)酵日糧產(chǎn)生的大量VFAs 是反芻動物機(jī)體主要的能量來源。Meta分析表明，奶牛瘤胃pH和VFAs與生產(chǎn)性能均具有顯著的回歸關(guān)系（P＜0.01），表明瘤胃發(fā)酵情況對奶牛生產(chǎn)性能有一定影響，這與前人研究結(jié)果一致。乙酸是合成脂肪酸的重要前體物質(zhì)。另外，乳脂中的脂肪酸約有一半來源于日糧降解或體脂動員產(chǎn)生的長鏈脂肪酸，另一半來自于乳腺組織內(nèi)的脂肪酸從頭合成；其中瘤胃產(chǎn)生的乙酸及肝臟合成的β-羥丁酸可以作為乳脂肪酸合成前體物。故而瘤胃對日糧的發(fā)酵、脂肪組織動員、肝臟乳脂前體物合成及乳腺脂肪酸合成能力等共同決定乳脂的含量。瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸是糖異生的重要底物，糖異生可滿足機(jī)體90%以上的葡萄糖需要。同時(shí)，葡萄糖又是合成乳糖從而影響奶產(chǎn)量的重要因素。在泌乳反芻動物中，乳腺可消耗高達(dá)85%的循環(huán)葡萄糖。丁酸作為瘤胃上皮細(xì)胞重要能量來源，可促進(jìn)瘤胃上皮生長發(fā)育，對維持瘤胃健康的消化吸收功能具有重要作用。因此，正常的瘤胃內(nèi)環(huán)境對奶牛發(fā)揮潛在生產(chǎn)性能具有重要作用。但文中大部分回歸模型擬合曲線的決定系數(shù)都小于0.300，也說明瘤胃發(fā)酵指標(biāo)并不是影響奶牛生產(chǎn)性能和飼喂效率的唯一因素，同時(shí)其他生理指標(biāo)也會影響生產(chǎn)性能。文章雖然發(fā)現(xiàn)瘤胃丁酸比例與乳糖率有二次回歸關(guān)系，但是大量研究發(fā)現(xiàn)牛奶中乳糖含量比較穩(wěn)定，且乳糖主要來源于血液中葡萄糖。文章文獻(xiàn)檢索所獲得的乳糖含量大部分在為4.4%～5.1%，差值很小。瘤胃丁酸比例的變化可能通過改變其他揮發(fā)性脂肪酸的比例來間接影響乳糖含量。

Meta 分析結(jié)果表明SARA 奶牛瘤胃pH 顯著降低，這與前人研究結(jié)果一致。高精料日糧一方面加速瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生大量的VFAs，這些VFAs通過瘤胃壁的吸收對維持穩(wěn)定的pH具有重要作用。瘤胃上皮細(xì)胞可經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過離子交換的方式吸收解離態(tài)的酸根離子，同時(shí)釋放碳酸氫根離子；部分未解離的高親脂性脂肪酸（尤其是丁酸）也可通過擴(kuò)散作用吸收。因此，VFAs的吸收對維持pH的作用不僅使瘤胃中酸性物質(zhì)的減少，同時(shí)還伴隨著堿性物質(zhì)的釋放。但VFAs的吸收并不會隨著其在瘤胃中含量的增加而一直增加。有研究證明SARA 可減少瘤胃的VFAs 吸收，同時(shí)增加唾液分泌，可能是由于高精料日糧可導(dǎo)致瘤胃上皮角化不全和角化過度，從而嚴(yán)重影響VFAs的吸收。另一方面高精料日糧會導(dǎo)致瘤胃微生物區(qū)系紊亂，特別是乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌之間的菌群失衡，導(dǎo)致乳酸積累。此外，與VFAs 相比，乳酸從瘤胃中吸收非常緩慢且酸度更高，從而進(jìn)一步降低瘤胃pH。作為主要的乳酸產(chǎn)生菌之一的牛鏈球菌（Streptococcus bovis）在誘發(fā)SARA 中具有關(guān)鍵作用。牛鏈球菌代謝行為對pH十分敏感；在pH低于6.0時(shí)，其乳酸脫氫酶活性受到激活，丙酮酸甲酸裂解酶活性受到抑制，乳酸代謝通路被激活，并以乳酸作為主要代謝終產(chǎn)物；在pH 高于6.0 且牛鏈球菌緩慢生長時(shí)，其主要代謝終產(chǎn)物為甲酸、乙酸和乙醇等。同時(shí)，當(dāng)瘤胃pH長時(shí)間低于6.0時(shí)，反芻獸新月單胞菌和埃氏巨型球菌等生長受到抑制，導(dǎo)致乳酸不斷積累，引起pH進(jìn)一步下降，在瘤胃內(nèi)形成惡性循環(huán)，加劇了SARA的進(jìn)程。瘤胃乳酸含量在預(yù)測或判斷酸中毒方面具有重要參考意義。但是文章只檢索到同時(shí)包含瘤胃pH、VFAs、乳酸和瘤胃健康狀況指標(biāo)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)較少，建議后續(xù)研究中將以上指標(biāo)同時(shí)納入檢測分析。

Meta分析結(jié)果中SARA奶牛瘤胃TVFA濃度與丙酸和丁酸比例顯著增加，乙酸比例顯著下降，表明SARA 奶牛瘤胃轉(zhuǎn)向丙酸和丁酸型發(fā)酵，這與前人研究高精料日糧誘導(dǎo)的瘤胃發(fā)酵模式改變是SARA發(fā)生的主要原因之一相一致。Mao等（2016）發(fā)現(xiàn)高精料日糧飼喂后，瘤胃TVFA 濃度增加，但乙丙比顯著下降，瘤胃發(fā)酵模式向丙酸型轉(zhuǎn)變。在長期以谷物為主的高精料日糧飼喂模式下，瘤胃牛鏈球菌將淀粉和可溶性糖快速發(fā)酵為乳酸的比例增加，將會導(dǎo)致乳酸積累，pH顯著降低，進(jìn)而誘發(fā)SARA。大部分研究認(rèn)為瘤胃發(fā)酵模式的改變與瘤胃微生物區(qū)系的改變有相關(guān)性。姚軍虎團(tuán)隊(duì)一系列研究證實(shí)改變瘤胃細(xì)菌或原蟲可調(diào)控瘤胃發(fā)酵類型。日糧組成或可通過改變瘤胃氧化還原電勢影響瘤胃微生物組成從而轉(zhuǎn)變瘤胃發(fā)酵類型。有研究表明，日糧特征（淀粉或纖維素）與瘤胃中氧化還原電位直接相關(guān)，且氧化還原電勢與乙酸比例和乙丙比負(fù)相關(guān)，與丙酸比例正相關(guān)。但是在某些高精料誘導(dǎo)SARA發(fā)生的研究中，乙酸和丙酸比例變化不顯著，可能與瘤胃微生物區(qū)系的快速恢復(fù)能力有關(guān)。

4 結(jié)論

文章通過Meta 分析發(fā)現(xiàn)，雖然奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)與生產(chǎn)性能有一定相關(guān)關(guān)系，但其并不是影響生產(chǎn)性能的唯一因素。SARA 奶牛瘤胃pH 和乙酸比例顯著降低，TVFA濃度與丙酸和丁酸比例顯著增加，表明瘤胃發(fā)酵指標(biāo)可以作為評估SARA 模型奶牛的有效化學(xué)屏障指標(biāo)。但這些指標(biāo)在系統(tǒng)評估消化道健康上存在一定的局限性，需要納入更多化學(xué)性屏障指標(biāo)（如乳酸、脂多糖、黏多糖、抗菌肽和其他微生物代謝產(chǎn)物等）和更多腸道部位（如盲腸和結(jié)腸）以及其他更全面的評價(jià)指標(biāo)。同時(shí)，本研究也存在一定局限性。首先，由于篇幅限制，文章尚不能納入所有相關(guān)文獻(xiàn)；其次，文章尚未解析特異性化學(xué)屏障與消化道健康相關(guān)的深層次機(jī)制，后續(xù)研究需要納入更多文獻(xiàn)，并從更全面的角度細(xì)致解析二者關(guān)系。