三種天然植物水溶物對H2O2損傷草魚原代肝細胞的保護作用

■石瑤瑤 馬 杰 王卓君， 葉元土* 蔣 蓉 孔慶偉

（1.蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇省水產動物營養(yǎng)重點實驗室，江蘇 蘇州 215123；2.無錫三智生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧 沈陽 110033）

氧化損傷是導致魚體損傷的主要損傷方式，其實質為體內氧化與抗氧化的動態(tài)失衡。主要表現(xiàn)在自由基含量增加、脂質過氧化物增加，蛋白質、DNA、脂質等大分子物質被損傷，體內抗氧化酶活性下降[1]。體內自由基產生的主要位點在線粒體，線粒體是ATP產生的能量代謝中心，通過氧化作用和氧化磷酸化作用的偶聯(lián)，氫和電子在呼吸鏈傳遞過程中將化學能轉移到ADP上產生ATP，在氫和電子給氧的過程中會產生過氧化氫和過氧自由基。正常情況下，線粒體產生的過氧化物、自由基等可以經體內的抗氧化系統(tǒng)清除，維持過氧化物、自由基產生與清除的動態(tài)平衡[2]。而一旦失衡，過氧化物、自由基含量增加，對細胞、器官組織造成氧化損傷。這時，可以通過飼料途徑，在飼料中增加維生素C（VC）、維生素E（VE）和一些具有抗氧化作用、具有自由基清除作用的物質，如天然植物來增強魚體、細胞的抗氧化能力和自由基清除能力，同時對氧化損傷的細胞進行修復。這也是水產動物營養(yǎng)和飼料在滿足養(yǎng)殖水產動物營養(yǎng)需要為基本目標的前提下，增強飼料抗氧化功能的發(fā)展方向之一。

VC是維生素中較為理想的抗氧化劑，但在水產飼料中過量使用也會產生不良反應，需要限量添加，農業(yè)農村部第2625 號公告《關于飼料添加劑安全使用規(guī)范》中，VC在草魚和鯉魚配合飼料中的推薦添加量為300～500 mg/kg[3-4]。需要探索其他功能完整、在多條途徑中發(fā)揮作用的抗氧化性物質促進動物健康生長。天然植物可作為實現(xiàn)該目標的最優(yōu)選擇，依據(jù)《飼料原料目錄》[5]，一些藥、食同源的天然植物允許在飼料中使用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)天然植物應用在黃顙魚和異育銀鯽的養(yǎng)殖中具有良好的抗氧化能力，可降低肝臟通透性，維護腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減輕體內氧化應激[6-7]。

在前期研究的基礎上，文章以天然植物復合物1（RAT 組）、天然植物復合物2（JLT 組）和訶子（TCR組）水溶物凍干粉以及VC作為試驗材料，探討天然植物抗氧化能力的評價方法，以草魚原代肝臟細胞作為試驗對象，探討不同天然植物水溶物對肝細胞氧化損傷的保護作用效果及機制，從細胞層面探究天然植物修復損傷肝臟的作用機理，為研制具有抗氧化性或氧化損傷修復作用的天然植物飼料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗草魚

用于原代肝細胞采集的草魚為平均體重（50.0±2.6）g的一冬齡幼魚，飼養(yǎng)于蘇州大學室內養(yǎng)殖系統(tǒng)，每天投喂草魚商品飼料（粗蛋白28%、粗脂肪7%的膨化飼料）1次，養(yǎng)殖系統(tǒng)水體溫度（24.0±5.0）℃。

1.2 天然植物及其水溶物

天然植物復合物1（RAT）和天然植物復合物2（JLT）由無錫三智生物科技有限公司提供，原料組成為葛根、絞股藍、甘草、訶子、金銀花、黃芪等，是將不同的單一天然植物飲片分別進行超微粉碎后的混合品；訶子（TCR）為中藥店購買的飲片粉碎后過60目篩樣品。RAT 和JLT 中多酚、多糖、黃酮和皂苷活性成分含量測定結果如表1。

表1 RAT和JLT部分活性成分含量（%）

分別稱取TCR、RAT和JLT粉末，各按料液比1∶10加雙蒸水攪拌均勻，4 ℃浸泡24 h，濾膜過濾2 遍，將濾液置冷凍干燥機凍干后制成水溶物凍干粉，-80 ℃冷凍保存待用。

1.3 肝細胞的分離與培養(yǎng)

草魚原代肝細胞的分離參照秦潔等[8]的試驗方法并稍作調整。將草魚消毒后取出肝臟，PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）清洗3 遍，剪碎后按體積1∶3 的比例加入0.25%胰蛋白酶、27 ℃搖床消化15 min，1 000 r/min離心1 min，棄上清液。按1∶3 的比例加入PBS 和紅細胞裂解液，1 000 r/min離心4 min棄上清液。PBS清洗細胞、800 r/min離心1 min棄上清后，加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基制成細胞懸液。細胞計數(shù)儀（Cyto SMART Technologies B.V.）計數(shù)后于5% CO2、27 ℃的培養(yǎng)箱（ESCO，新加坡）中培養(yǎng)，24 h換培養(yǎng)液。

1.4 天然植物水溶物對自由基清除率的測定

1.4.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）清除率

參照陳旭丹等[9]測定DPPH·的方法并稍作改進。DPPH溶于無水乙醇中，配成終濃度為8.62×10-5mol/L DPPH。稱取0.128 g 待測樣品（凍干粉），加入20 mL 75%乙醇，超聲提取5 min，8 000 r/min 離心8 min，收集上清，得到初始濃度為6.4 g/L 的待測液母液，用無水乙醇稀釋成不同濃度。操作步驟及DPPH·清除率計算公式按照陳旭丹等[9]試驗的方法，可見分光光度計測量吸光值。

1.4.2 羥基自由基（·OH）清除率

參照劉茹等[10]測定方法，采用水楊酸法測定樣品對·OH清除率。用純化水將樣品稀釋成不同濃度，操作步驟及·OH清除率計算公式按照劉茹等[10]試驗的方法。

1.5 細胞活力測定

1.5.1 天然植物水溶物試驗濃度的確定

接種2.5×105個/mL細胞到96孔板中，24 h后待其覆蓋培養(yǎng)孔底面積80%左右時，更換培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液中RAT、JLT、TCR和VC的濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mg/mL，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL噻唑藍（MTT）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL純度為99.5%的二甲基亞砜，遮光振搖10 min，充分溶解甲瓚（Formazan）。用酶標儀（Gene Company Limited）檢測570 nm波長下的各孔吸光度值，根據(jù)公式計算細胞活力，篩選對細胞無毒性的天然植物水溶物濃度，用于后續(xù)修復損傷細胞試驗。

細胞活力（%）=處理組OD570nm/對照組OD570nm×100

1.5.2 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細胞活力的測定

取培養(yǎng)24 h后處于對數(shù)生長期的細胞（細胞貼壁生長且貼壁細胞約占80%的培養(yǎng)孔面積），按照前期試驗結果[11]，用濃度為200 μmol/L 的H2O2處理細胞1 h后建立H2O2損傷模型。對照組和H2O2組換正常培養(yǎng)基，其余組更換濃度為0.10 mg/mL 的RAT、JLT、TCR 和VC 4 種物質的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h，MTT 檢測細胞活力，操作與計算方法同1.5.1。

1.6 細胞抗氧化酶活性的檢測

接種4×106個/mL細胞到12孔板里，分組按照1.5.2處理細胞，加入0.25%胰蛋白酶200 μL 消化細胞2-3 min，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，棄上清，收集細胞后，加入1 mL PBS，利用細胞超聲破碎儀低溫裂解細胞（功率30%，裂解3 min），按照南京建成生物研究所有限公司的試劑盒方法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.7 細胞內活性氧（ROS）水平的檢測

按照1.6 中的方法收集各組細胞，按南京建成生物研究所有限公司ROS試劑盒方法加樣，用流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）進行檢測。

1.8 細胞凋亡的檢測

按照1.6 中的方法收集各組細胞，處理細胞按試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術有限公司）方法，Annexin VFITC和PI雙染，流式細胞儀檢測。CXP Analysis軟件分析計算結果。

1.9 線粒體膜電位（MMP）的檢測

按照1.6 收集各組細胞后，按照南京建成生物研究有限公司MMP試劑盒方法操作，流式細胞儀檢測。

1.10 透射電鏡觀察肝細胞超微結構

細胞分組及處理同1.5.2，每個樣本處理3 個復孔，用2.5%的常溫戊二醛避光固定細胞5 min，細胞刮輕輕刮下細胞，用吸管把細胞吸進離心管，1 000×g離心2 min，換上新的固定液室溫避光30 min，經過PBS沖洗后1%鋨酸固定2 h，PBS沖洗，先用50%乙醇脫水逐漸過渡到用100%乙醇脫水，使用環(huán)氧樹脂和硬化劑對樣品浸透包埋，3 mm直徑銅網收集、切片，檸檬酸鉛和醋酸鈾進行染色，于透射電鏡下觀察細胞超微結構，選取2 000倍鏡和10 000倍鏡下各10個視野，觀察線粒體、細胞核、內質網、溶酶體形態(tài)數(shù)量及分布情況。

1.11 Western Blot試驗

①將各處理組的細胞棄掉上清，離心后收集細胞，按1∶10 的比例加入樣本和裂解液，充分裂解細胞，離心收集上清。用BCA檢測試劑盒測定細胞蛋白質含量。

②制備SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白Marker 和細胞樣品加到膠孔內，電壓設置在80～100 V。待溴酚藍未接觸膠的底端即結束電泳。

③轉膜（PVDF 膜）后加入Western 封閉液，加入一抗4 ℃過夜，TBST 緩沖液洗膜30 min（3 次），室溫加入二抗2 h，同前步驟洗膜3 次，清洗完畢后放入Chemiscope 6000 Pro化學發(fā)光成像系統(tǒng)，掃描拍照。

1.12 轉錄組分析

將各組細胞分別進行收集后，委托北京百邁客生物科技有限公司進行RNA-seq測序和基因注釋。

1.13 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異顯著性用Duncan’s 法多重比較進行統(tǒng)計分析（Duncan’s multiple range test），試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示，P＜0.05 表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 天然植物水溶物體外抗氧化效果（見表2）

以VC 為陽性對照，測定天然植物水溶物清除自由基的效果，結果都以IC50值來表示。IC50定義為：自由基數(shù)目減少50%時所需要的樣品濃度，即為自由基清除率下降50%時樣品的濃度，IC50值越小表明清除能力越強。由表2 所示，VC 是清除DPPH·和·OH能力最強的，RAT和JLT清除·OH能力二者之間無顯著性差異，IC50值約為1.50 mg/mL，其清除能力是訶子的7.8 倍；訶子清除DPPH·IC50值為0.01 mg/mL、RAT IC50值為0.26 mg/mL，JLT IC50值為1.31 mg/mL。

表2 不同天然植物對自由基的清除率（IC50，n=3，mg/mL）

2.2 天然植物水溶物在細胞培養(yǎng)液中的適宜濃度（見圖1）

圖1 同濃度天然植物水溶物和VC對細胞活力的影響（n=3）

由圖1 結果所示，0.01～1.00 mg/mL 濃度的JLT 組水溶物培養(yǎng)肝細胞24 h 的細胞活力無顯著性差異（P＞0.05），JLT 濃度增加到5.00 mg/mL 時細胞活力顯著降低（P＜0.05）；0.01～0.50 mg/mL 濃度的RAT 組培養(yǎng)肝細胞24 h 細胞活力隨濃度的升高呈顯著性上升趨勢（P＜0.05）；同等濃度范圍的TCR培養(yǎng)肝細胞24 h，細胞活力無顯著性差異（P＞0.05）；RAT和TCR濃度達到1.00～5.00 mg/mL時肝細胞活力顯著降低（P＜0.05）；VC 作為陽性對照在0.01～0.10 mg/mL 濃度范圍內與Con 組（正常細胞）相比無顯著性差異，0.50 mg/mL和1.00 mg/mL 兩個濃度下細胞活力顯著升高，但在5.00 mg/mL時又出現(xiàn)了下降。因此，可以選用濃度為0.01～0.50 mg/mL的3種天然植物水溶物和VC陽性對照進行后續(xù)試驗。

2.3 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細胞活力的影響（見圖2）

圖2 天然植物水溶物和VC對損傷細胞活力的影響（n=3）

從篩選出來的安全范圍濃度中，選擇相同濃度（0.10 mg/mL）的4 種物質，分別加入到H2O2損傷的細胞中，作用24 h 后檢測細胞活力，結果如圖2 所示，H2O2組與對照組（Con組）相比有顯著降低的趨勢（P＜0.05）；除JLT 組外，RAT、TCR 和VC 組與H2O2組相比都能顯著性提高細胞活力（P＜0.05）；VC組效果最好，達到與Con組無顯著差異水平；RAT和TCR組間無顯著性差異（P＞0.05），且均高于H2O2組的結果。結果表明，JLT、RAT、TCR和VC均具有恢復H2O2損傷草魚肝細胞生長活力的功能，且以RAT、TCR和VC活性更強。

2.4 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細胞抗氧化酶活性的影響（見圖3）

如圖3所示，與Con組相比，H2O2組的MDA含量極顯著上升（P＜0.01），與H2O2組相比，加入不同天然植物水溶物和VC 后，MDA 含量呈顯著下降趨勢。H2O2組GSH含量與Con組相比極顯著降低；與H2O2組相比，天然植物水溶物和VC組都極顯著提高了GSH含量（P＜0.01）。與Con 組相比，H2O2組CAT 活性極顯著降低；與H2O2組相比，天然植物水溶物和VC 組CAT 活性有升高趨勢，除JLT 組，其余3 組都具有極顯著性差異（P＜0.01）。與Con 組相比，H2O2組的SOD 活性顯著提高，加入天然植物水溶物組和VC后SOD活性與H2O組相比極顯著下降（P＜0.01）。結果表明，添加天然植物水溶物能夠降低H2O2損傷細胞MDA含量，提高CAT活性，增加GSH含量。

圖3 天然植物水溶物和VC對損傷細胞酶活性的影響（n=3）

2.5 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細胞內活性氧（ROS）含量的影響（見圖4）

由圖4 所示，H2O2組胞內ROS 水平極顯著高于Con組（P＜0.01）；與H2O2組相比，加入天然植物水溶物和VC 培養(yǎng)細胞24 h后，細胞內的ROS 水平均極顯著降低（P＜0.01），其中VC 組降低最顯著。RAT 和JLT兩組之間無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明，JLT、RAT、TCR 和VC 均具有降低H2O2損傷草魚肝細胞內多余活性氧的功能。

圖4 天然植物水溶物和VC對細胞內ROS水平的影響（n=3）

2.6 天然植物對H2O2損傷肝細胞凋亡率的影響（見圖5）

圖5 天然植物水溶物和VC對肝細胞凋亡率的影響

如圖5所示，H2O2組的細胞早期凋亡率為（35.72±0.93）%，與Con組相比增加14.07%（P＜0.01）。RAT組和JLT組細胞凋亡率分別為（24.87±0.53）%和（23.71±1.32）%，兩者與H2O2組相比凋亡率顯著降低（P＜0.05）。VC 組細胞凋亡率達到了最少，為（17.61±1.06）%，TCR組細胞凋亡率為（26.21±4.41）%，與H2O2組有顯著性差異（P＜0.05），但是活細胞明顯減少。試驗結果表明，JLT、RAT、TCR和VC均能降低H2O2損傷草魚肝細胞的凋亡率，效果較強的是VC、RAT和JLT。

2.7 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細胞線粒體膜電位的影響（見圖6）

由圖6所示，與Con組相比，H2O2組的線粒體膜電位極顯著下降（P＜0.01）。與H2O2組相比，加入天然植物水溶物和VC 后，僅JLT 組和TCR 組有顯著性上升的趨勢。尤其是TCR組的MMP最高，RAT組和VC組MMP 與H2O2組無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明，RAT、JLT 和TCR 能夠升高H2O2損傷草魚肝細胞細胞膜電位，緩解線粒體途徑誘導的細胞凋亡。

圖6 天然植物水溶物和VC對MMP的影響（n=3）

2.8 天然植物對H2O2損傷肝細胞透射電鏡的觀察結果（見圖7）

圖7 肝細胞超微結構變化

由圖7 所示，Con 組肝細胞細胞核呈現(xiàn)圓形或者橢圓形，染色質集中于細胞核中央，細胞質均勻分布，線粒體豐富，結構完整，嵴清晰（見圖7A 和圖7A1）；H2O2組的細胞有嚴重空泡化現(xiàn)象，細胞質分布不均勻，大片面積缺失，細胞核染色質邊集化特征顯著，線粒體腫脹，嵴消失，細胞器減少，內含脂滴，有少量自噬小體和自噬溶酶體（見圖7B 和圖7B1）；RAT 組（見圖7C 和圖7C1）、JLT 組（見圖7D 和圖7D1）、TCR 組（見圖7E和圖7E1）和VC組（見圖7F和圖7F1）與H2O2組相比，嵴消失情況有所緩解，但依舊有線粒體腫脹現(xiàn)象，線粒體數(shù)量略有升高，自噬小體和自噬溶酶體聚集趨于增多。上述結果表明，H2O2損傷肝細胞后能夠造成肝細胞微觀結構顯著性的改變，天然植物水溶物和VC 能夠緩和細胞受損情況，主要是通過線粒體形態(tài)、自噬溶酶體數(shù)量的變化起到作用。

2.9 凋亡蛋白的檢測結果（見圖8）

圖8 天然植物水溶物對細胞凋亡蛋白相對表達量的影響

Western Blot 試驗檢測結果發(fā)現(xiàn)，與Con 組相比，H2O2組的凋亡蛋白Caspase-3 的表達極顯著性升高（P＜0.01）；與H2O2組相比，RAT 組和TCR 組的Caspase-3的表達極顯著性降低（P＜0.01），凋亡蛋白活性被抑制，說明RAT 和TCR 能夠通過抑制Caspase-3 的表達活性對草魚原代肝細胞起到保護作用。H2O2組Bax 蛋白的表達較Con 組有極顯著性升高趨勢（P＜0.01），RAT 組、JLT 組和TCR 組與H2O2組相比有顯著或極顯著降低的趨勢（P＜0.05或P＜0.01），RAT、JLT和TCR能抑制Bax蛋白的表達活性，緩解細胞凋亡。

2.10 基因差異表達和通路分析

采用EdgeR 軟件對Con 組、H2O2組、TCR 組、RAT組、JLT 組和VC 組細胞進行差異表達基因統(tǒng)計分析，默認參數(shù)：p-adjust＜0.05、| |log2FC ≥1，結果見表3。H2O2組與Con 組相比，有1 073 個基因差異表達，其中有363 個基因差異表達上調、710個基因差異表達下調；H2O2組與TCR組相比，有3 637個基因差異表達，其中1 565 個基因差異表達上調，2 072個基因差異表達下調；H2O2組與JLT組相比，有482個基因差異表達，其中有156個基因差異表達上調，326個基因差異表達下調；H2O2組與RAT 相比，有200 個基因差異表達，其中有89 個基因差異表達上調，111 個基因差異表達下調；H2O2組與VC 相比，有359 個基因差異表達，其中有103個基因差異表達上調，有256個基因差異表達下調。

表3 差異表達基因

對部分GEGs 進行整理，結果見表4，H2O2組“內質網中的蛋白質加工通路”中Calpain-2catalytic subunit基因表達上調，造成細胞內Ca2+紊亂；“胰島素信號通路”中Insulin receptor substrate2 基因表達下調，receptor-type tyrosine-protein phosphatase F-like基因差異表達倍數(shù)上調9.48倍，影響胰島素的信號轉導；“類固醇生物合成通路”中Delta(24)-sterol reductase基因表達下調，影響固醇合成途徑，氧化還原酶失衡造成氧化損傷。TCR 組中Glutathione peroxidase4 基因表達上調，“鐵下垂通路”中Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase基因表達上調，transferrin receptor protein1-like基因表達下調，表明TCR可能通過抑制鐵死亡保護細胞。JLT組“自噬通路”中high mobility group protein基因差異表達上調，death-associated protein kinases基因差異表達倍數(shù)下調7.43 倍，beclin-1protein基因差異表達倍數(shù)上調10.25倍，可通過促進細胞自噬保護細胞。RAT 組“自噬通路”中beclin-1protein基因差異表達倍數(shù)上調10.80倍，“內分泌和其他因素調節(jié)鈣重吸收通路”中calbindin-like基因表達上調，參與鈣離子的結合、調節(jié)鈣平衡。VC 組“甲狀腺激素合成通路”中Thyroxine基因表達上調，促進甲狀腺激素合成緩解細胞凋亡。

表4 差異表達基因

3 討論

3.1 天然植物的抗氧化作用

本試驗結果表明，三種天然植物水溶物都具有較好的清除DPPH·和·OH 的能力，VC 是清除DPPH·和·OH 能力最強的，RAT和JLT清除·OH能力較強且兩者無顯著性差異，清除率是TCR 的7.8 倍；清除DPPH·能力由強到弱分別是TCR、RAT 和JLT，說明3種物質都具有較強的抗氧化效果。

具有藥食同源的天然植物具有很高的營養(yǎng)價值和藥用功效，尤其是含有多酚類物質而具有較強的抗氧化能力和清除自由基的能力，這是希望通過飼料途徑篩選單一或復合的天然植物進入飼料配方的基本依據(jù)。需要關注的問題：一是不同天然植物產品含有的抗氧化、清除自由基的有效成分種類有差異，因而會在相同條件下顯示出不同的抗氧化、清除自由基的效率；二是不同于體外試驗，對于活體動物或活體細胞，不同的天然植物產品、不同的有效成分在抗氧化、清除自由基效率等方面存在一個適宜劑量效應的問題，過多的添加量可能導致活體動物或活體細胞出現(xiàn)損傷的情況。例如，有研究表明，當植物多糖超過一定范圍后，會對細胞的生長造成負面影響[12]。首先確定天然植物水溶物試驗濃度用于后續(xù)修復損傷細胞是必要的工作。與H2O2組相比，4種物質都有提高細胞活力的趨勢，且RAT、TCR和VC組具有顯著性差異。除VC組外，細胞相對活力提升效果由高到低分別是：TCR＞RAT＞JLT，這也顯示了對H2O2損傷肝細胞修復能力的大小順序。

MDA是生物膜中不飽和脂肪酸被氧化后的代謝產物，對細胞有毒性，能反映細胞損傷和動物脂質過氧化程度[13]。SOD、CAT作為體內重要的抗氧化酶，其活性能夠檢測水生動物的抗氧化能力[14]。GSH 是動物體內一種天然的抗氧化劑，具有多個特殊功能的化學基團，能清除體內O2-·，保護細胞膜的完整性，具有抗脂質氧化作用，能提高動物抗氧化應激能力[15]。本試驗觀察到H2O2組CAT的抗氧化酶活性顯著性降低，MDA水平顯著上升，說明細胞膜受損且脂質發(fā)生過氧化，抗氧化酶系統(tǒng)受損。在損傷細胞培養(yǎng)液中加入RAT、JLT、TCR的水溶物以及VC后，培養(yǎng)細胞24 h后，檢測到胞內的CAT活性及GSH水平上升，MDA含量顯著下降。說明天然植物水溶物可以增加損傷細胞的抗氧化酶活性，減少MDA積累，逆轉草魚肝胰臟細胞氧化應激標志物（O2-·、MDA）的變化。但是SOD活性卻在H2O2損傷后呈現(xiàn)上升的趨勢，這可能因為SOD是機體內清除O2-·唯一的清除劑。由于受到適當?shù)难趸瘧ず蟪鲇谧陨淼谋Ｗo作用呈現(xiàn)升高趨勢，F(xiàn)utakawa等[16]研究與本研究結果一致。

線粒體在調節(jié)細胞能量代謝中起關鍵作用，線粒體動力學被認為對維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要生理作用。線粒體動力學降低，說明線粒體功能已損害，細胞可能已經處于衰老或者死亡狀態(tài)。氧化應激時自由基的增強進一步惡化線粒體損傷，并打開線粒體通透性轉變孔（mtPTPs），這個過程誘導細胞凋亡[17]。本試驗檢測結果顯示：與Con 組相比，H2O2組胞內ROS 水平顯著升高，MMP顯著降低，RAT、JLT和TCR組的MMP與H2O2組相比有上升趨勢，降低胞內ROS水平，保護線粒體膜的完整性。H2O2組的細胞凋亡百分比達到（35.72±0.93）%，與Con組相比有顯著升高趨勢，而加入天然植物水溶物和VC后降低了細胞凋亡率。自噬屬于細胞調控應激和防御應激的適應性反應，能降解受損細胞器，參與損傷修復，維持細胞穩(wěn)態(tài)[18-19]。有相關研究表明藥根堿能夠清除細胞ROS，可能與其對線粒體自噬有促進作用有關[20]。本試驗透射電鏡結果顯示，細胞受損傷后線粒體腫脹，嵴消失，加入RAT、JLT、TCR和VC后能夠緩解線粒體嵴消失情況，并且自噬小體和溶酶體數(shù)量增加，說明天然植物水溶物能促進H2O2損傷細胞自噬，并緩解線粒體結構的損傷促進細胞清除受損結構，抑制細胞氧化損傷。

細胞凋亡的兩條主要途徑都與Caspase-3有關[21]。半胱天冬酶在凋亡的啟動中發(fā)揮重要作用，Caspase-3 蛋白位于細胞質中，是細胞凋亡的主要執(zhí)行者[22]。有報道稱H2O2能夠增加促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達，介導線粒體途徑凋亡[23]。本試驗中顯示H2O2組的Caspase-3蛋白和Bax蛋白表達顯著升高，說明H2O2能夠通過線粒體途徑引起細胞凋亡，3種天然植物水溶物處理細胞后Caspase-3 蛋白（除JLT組外）和Bax蛋白表達呈現(xiàn)降低趨勢，推測3種物質可能通過抑制促凋亡蛋白的表達，從而抑制H2O2誘導線粒體途徑的肝細胞凋亡。

3.2 天然植物對損傷肝細胞的保護機制

H2O2組與Con組的基因差異表達主要涉及“內質網中的蛋白質加工”“胰島素信號通路”“MAPK 信號通路”“類固醇生物合成”等通路。

“鐵死亡”是一種鐵離子依賴性的程序性細胞死亡方式，能引起線粒體改變的氧化損傷[24]。與H2O2組相比，TCR組的基因差異表達主要涉及的與細胞凋亡相關通路有“鐵下垂”，TCR可能通過上調GPX4，降低鐵死亡的發(fā)生來緩解細胞凋亡；細胞自噬能調節(jié)物質合成、平衡代謝、清除受損細胞器、促進發(fā)育和分化，是細胞在惡性環(huán)境下確保生存的應激反應[25]。JLT組主要涉及“自噬”相關通路，影響其上游的HMGB1、DAPK基因引起B(yǎng)eclin-1上調來降解和回收利用細胞內受損蛋白質和細胞器，緩解受損細胞發(fā)生嚴重凋亡；鈣結合蛋白在體內參與鈣離子的結合、調節(jié)鈣平衡、防止細胞損傷中起到了積極作用[26]。RAT組主要涉及“內分泌和其他因素調節(jié)鈣重吸收”以及“自噬”相關通路，通過上調CALB1、CaBp28k、ATG6 和ATG9 的表達，調節(jié)細胞自噬以及細胞內Ca2+平衡，恢復內質網穩(wěn)態(tài)，修復細胞損傷凋亡；甲狀腺合成的甲狀腺素在維持動物體的正常發(fā)育和促進新陳代謝中起重要作用[27]，VC組主要涉及“甲狀腺激素合成”相關通路，通過TG表達上調促進甲狀腺素合成以緩解細胞凋亡，有研究表明甲狀腺素可以改善重型顱腦損傷后的神經細胞凋亡[28]。

4 結論

H2O2可能通過線粒體途徑導致草魚肝細胞氧化性損傷。天然植物復合物1、天然植物復合物2、訶子水溶物對草魚原代肝細胞的氧化應激損傷具有緩解、修復作用，表現(xiàn)在具有清除體內自由基和過氧化物的功能作用，具有提高細胞相對活力、提高細胞抗氧化能力的作用，具有促進H2O2損傷細胞自噬、并緩解細胞核和線粒體結構的損傷，通過調節(jié)內質網穩(wěn)態(tài)、下調Caspase-3和Bax蛋白的表達等途徑，從而減輕Caspase-3介導的線粒體途徑的凋亡和氧化損傷的作用，對肝胰臟的損傷修復和氧化損傷的保護具有一定的作用效果。