振腹環(huán)揉法對PCPA 失眠模型大鼠腦電活動及下丘腦5-HT、β-EP 含量的影響

郅曉宇，劉 鵬，叢德毓，張 野，劉楊圣潔，張紅石*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

失眠是一種常見疾病，大多數(shù)成年人對自己的睡眠時間或質(zhì)量不滿意，包括易醒、睡眠持續(xù)時間短、徹夜不眠[1]?，F(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)與心理學(xué)觀點認(rèn)為，失眠與大腦功能變化，遺傳因素及情感因素相關(guān)[2]。在失眠的演變進程中，患者的大腦皮層與軀體均會出現(xiàn)過度喚醒狀態(tài)[3]。有1 項Meta 分析通過對17 項研究共計3 693 萬人進行評估發(fā)現(xiàn)，失眠與死亡率之間沒有關(guān)系，而使用催眠藥物會增加死亡風(fēng)險[4]，推拿作為一種非藥物療法被越來越多的患者接受。觀察失眠大鼠的腦電活動以及下丘腦內(nèi)5-HT、β-EP 含量的變化，探討“振腹環(huán)揉法”改善睡眠的作用機制，為臨床提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康6 月齡SD 大鼠18 只（雌雄各半）[購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（吉）2020-0002]，體質(zhì)量200～230 g。

1.2 電極埋置 大鼠氣麻后對其頭部表面進行消毒，沿著頭部中線將頭部皮膚剪開，將顱骨充分暴露，剝離骨膜。將大鼠頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，在大腦右側(cè)皮層前額葉上方和枕葉上方放置不銹鋼電極，在小腦上方放置接地參考電極。將所有電極用牙科水泥固定于大鼠頭部，縫合皮膚切口，連續(xù)3 d 腹腔注射4 萬U 青霉素，每只大鼠放入鼠盒中單獨飼養(yǎng)1 周。

1.3 分組及造模方法 術(shù)后1 周將大鼠按體重隨機分為空白組、模型組、推拿組，每組各6 只?？瞻捉M：腹腔注射生理鹽水（400 mg/kg）。模型組、推拿組：采用PCPA 法造模。每日上午8 時～10 時對大鼠進行PCPA 混懸液（400 mg/kg）腹腔注射，每日1 次，連續(xù)注射2 d。在注射結(jié)束后第2 天對造模后大鼠進行翻正反射檢測，以30 mg/kg 戊巴比妥鈉進行腹腔注射后將大鼠腹部向上放置于墊板上，以翻正反射消失記錄為睡眠開始，記錄睡眠潛伏期以及睡眠時間，所測時間與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.05），證明模型復(fù)制成功。

1.4 干預(yù)方法 空白組：正常飲食與飲水，不予干預(yù)治療。模型組：每日將大鼠束縛鼠板仰臥位1 次，不予推拿治療，12 min 解開束縛，連續(xù)7 d。推拿組：采用“振腹環(huán)揉法”進行推拿治療，連續(xù)7 d。分“振腹法”和“環(huán)揉法”兩部分進行操作。振腹法：將穴位按摩儀置于中脘（穴位參照《實驗針灸學(xué)》），以按摩儀自身重量70 g 為壓力，儀器保持直立，作用于中脘1 min 后將儀器離開大鼠腹部，間隔30 s 后與環(huán)揉法進行交替操作。環(huán)揉法：將穴位按摩儀直立于腹部，以中脘為中心，1 cm 為半徑做順時針的環(huán)揉操作，頻率為每分鐘15 圈，間隔30 s 后與振腹法進行交替操作。振腹環(huán)揉法操作全程共計12 min。

1.5 腦電監(jiān)測 腦電采集，在治療結(jié)束后對各組大鼠進行腦電監(jiān)測，在適應(yīng)1 h 后進行2 h 腦電采集，截取兩段60 s 平穩(wěn)信號（間隔1 h），采集過程均在屏蔽室中進行。分別計算各組大鼠的δ 波百分比，θ 波百分比，α 波百分比，β 波百分比。

1.6 下丘腦5-HT 及β-EP 含量檢測 治療結(jié)束后，對各組大鼠進行氣麻，斷頭處死，迅速取出全腦，在冰盤上剝離下丘腦。按照Elisa 試劑盒說明書進行操作，使用酶標(biāo)儀進行OD 值測定，以ELISA Calc 軟件進行濃度計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗數(shù)據(jù)采用Graph Pad 8 進行統(tǒng)計，方差齊采用單因素方差分析（ANOVA），方差不齊采用Brown-Forsythe and Welch ANOVA 分析，組間比較采用Dunnett’s T3 multiple comparisons test。

2 結(jié)果

2.1 振腹環(huán)揉法對PCPA 失眠模型大鼠腦電活動的影響 治療結(jié)束后，模型組與空白組相比，腦電波中的δ 波百分比降低，θ 波百分比升高，α 波百分比升高，β 波百分比升高；推拿組與模型組相比，腦電波中的δ 波百分比升高，θ 波百分比降低，以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 δ 波功率譜百分比

圖2 θ 波功率譜百分比

圖3 α 波功率譜百分比

圖4 β 波功率譜百分比

2.2 振腹環(huán)揉法對PCPA 失眠模型大鼠下丘腦5-HT及β-EP 含量的影響 模型組與空白組相比，下丘腦5-HT 的含量下降；推拿組與模型組相比，下丘腦5-HT的含量升高，見圖5。模型組與空白組相比，下丘腦β-EP的含量下降；推拿組與模型組相比，下丘腦β-EP 的含量升高，見圖6。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 下丘腦內(nèi)5-HT 含量

圖6 下丘腦內(nèi)β-EP 含量

3 討論

研究表明，失眠是由于大腦皮層的興奮和抑制功能失調(diào)導(dǎo)致的疾病，以入睡難和睡眠維持障礙為特征[5]。大鼠的腦電波可分為以下四個頻段：δ 波：頻率0.5～3.5 Hz，通常只在睡眠狀態(tài)時出現(xiàn)；θ 波：頻率3.5～7.5 Hz，通常在困倦狀態(tài)時出現(xiàn)；α 波：頻率7.5～13.5 Hz，通常在安靜清醒且閉目的狀態(tài)下會出現(xiàn)；β 波：頻率13.5～30 Hz，通常在大腦皮層興奮的時候出現(xiàn)[6]。本實驗結(jié)果表明，造模后大鼠的δ 波顯著降低，θ、α、β 波顯著增加；推拿治療后大鼠的δ波顯著升高，θ、α、β 波顯著降低，提示振腹環(huán)揉法治療失眠大鼠腦電活動有影響。

5-HT 是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中，參與著情感、認(rèn)知、睡眠等重要生理活動[7]。研究證明，5-HT 能夠促進覺醒過程，對快速眼動睡眠產(chǎn)生抑制作用，是網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的重要組成部分[8-10]。5-HT 分泌不足時會導(dǎo)致大腦皮層興奮和抑制功能的紊亂，進而導(dǎo)致睡眠時相慢波睡眠和快波睡眠發(fā)生了紊亂[11]。β-EP 是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜、止痛作用，與睡眠密切相關(guān)。本實驗結(jié)果表明，造模后大鼠下丘腦內(nèi)5-HT 及β-EP 含量顯著降低；推拿治療后的大鼠下丘腦內(nèi)5-HT及β-EP 含量顯著升高，證明振腹環(huán)揉法可以對下丘腦內(nèi)5-HT 及β-EP 含量產(chǎn)生影響。

目前藥物是治療失眠的常用方法[12]。苯二氮卓類受體激動劑是首選藥物，但在停藥后易出現(xiàn)反射性失眠和戒斷反應(yīng)[13]。推拿作為一種中醫(yī)外治法可以調(diào)節(jié)臟腑功能，平衡陰陽氣血，達到補益心脾，交通心腎，滋陰潛陽，安神定志的作用[14]。振腹環(huán)揉法傳習(xí)了臟腑推拿“外通經(jīng)絡(luò)，內(nèi)調(diào)臟腑”的診療經(jīng)驗，臨床治療各型失眠取得了較好療效[15]。本實驗初步揭示了振腹環(huán)揉法對大鼠腦電活動及下丘腦內(nèi)5-HT 及β-EP 含量的影響，從神經(jīng)電生理角度及神經(jīng)遞質(zhì)角度為振腹環(huán)揉法治療失眠的作用機制提供了多維度的證據(jù)。