核酸擴(kuò)增技術(shù)在血清HIV、HBV、HCV檢測中的應(yīng)用

周斌，黃小珍，藍(lán)新，曾賓，魏穎

梅州市中心血站檢驗科，廣東 梅州 514021

輸血是臨床用于治療大出血、外科手術(shù)、嚴(yán)重貧血、鐮狀細(xì)胞病等疾病的主要方法，但在臨床輸血時，所發(fā)生的輸血性傳染病是影響患者輸血健康的主要問題，由其引起的死亡率高達(dá)10.0%～15.0%[1-2]。因此，預(yù)防及控制輸血性傳染病成為研究重點。人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)是臨床常見的輸血感染性病毒，其中輸血與血制品是病毒感染的主要途徑，通過檢測血液相關(guān)病毒抗原或抗體，可降低輸血性傳染病，確保患者救治安全性[3]。近年來，我國篩查獻(xiàn)血者的感染病毒時，能顯著下降血液感染，但由于病毒抗體檢測窗口長，使輸血傳染病風(fēng)險增加。目前在篩查獻(xiàn)血血液病毒感染時，主要是采用酶聯(lián)免疫法對血液傳染病病毒進(jìn)行篩查[4]。核酸擴(kuò)增技術(shù)是當(dāng)前血站輸血時主要檢測技術(shù)，能直接測定病毒核酸，縮短檢測耗費時間[5-6]。本研究旨在探討核酸擴(kuò)增技術(shù)在血清HIV、HBV、HCV檢測中的應(yīng)用效果，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2020年12月梅州市中心血站采集36 422名無償獻(xiàn)血者的血液樣本，在獻(xiàn)血前經(jīng)速率法、膠體金法快速檢測后證實結(jié)果為合格，與獻(xiàn)血所規(guī)定的健康標(biāo)準(zhǔn)相符合[7]；所有獻(xiàn)血對象自主表達(dá)無傳染性疾病病史，健康狀態(tài)好；所有獻(xiàn)血者均留取兩管血液樣本，核酸血液樣本保存置于帶分離膠真空抗凝管，另一支血液標(biāo)本用酶聯(lián)免疫法測定；血液采集前，獻(xiàn)血對象對本次研究知情，并簽署同意書。

1.2 儀器與試劑酶聯(lián)免疫試劑盒(北京萬泰，英科新創(chuàng)，法國伯樂，索林Mur)，酶聯(lián)免疫分析儀(愛康一體機(jī))，抗-HCV、抗-HIV、HBsAg酶聯(lián)試劑。核酸檢測：全自動核酸檢測儀(北京萬泰)及配套試劑；血液HIV、HBV、HCV核酸檢測試劑(北京萬泰)。

1.3 檢測方法所有獻(xiàn)血者均留取兩管血液樣本，血液樣本均為5 mL，樣本留置4 h內(nèi)3 000 r/min，離心20 min。酶聯(lián)免疫法：獻(xiàn)血者采集的血液樣本置入EDTA抗凝管內(nèi)，離心15 min，3 000×g，分離血漿，全自動酶標(biāo)儀檢測分析HIV、HBV、HCV陽性率。核酸檢測：采用照磁珠分離技術(shù)提取血液樣本，對傳染病毒進(jìn)行全自動核酸擴(kuò)增檢測，自動判讀結(jié)果。單次檢測結(jié)果陽性：核酸檢測陽性。將核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫法作為結(jié)果對比。若單樣本核酸反應(yīng)陽性，若與酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果不一致，送至臨床檢驗中心鑒定病毒。所有室內(nèi)質(zhì)控物由衛(wèi)生部臨檢中心評定，按要求進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)(1)比較核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫法的測定結(jié)果，分析HBV、HCV、HIV樣本篩查合格率；(2)分析核酸檢測結(jié)果以及陽性樣本鑒定檢測情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較采取χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶聯(lián)免疫與核酸擴(kuò)增檢測結(jié)果比較36 422份血液樣本經(jīng)酶聯(lián)免疫法和核酸擴(kuò)增檢測，其HBV、HCV、HIV陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 酶聯(lián)免疫與核酸擴(kuò)增檢測結(jié)果比較[例(%)]

2.2 核酸擴(kuò)增樣本拆分結(jié)果36 422份血液樣本經(jīng)二次重復(fù)血清免疫學(xué)檢查6樣本陰性血樣樣本匯集池數(shù)量6 071個，30個匯集池存在反應(yīng)，后將其拆分單個檢測樣本，16個匯集池樣本拆分17個陽性樣本，14個匯集池樣本拆分后未檢測出非反應(yīng)性，其拆分率為0.047%。17個陽性樣本經(jīng)再次鑒定，HBV、HCV、HIV反應(yīng)陽性樣本數(shù)分別為15個、1個、1個。

3 討論

我國對血站操作規(guī)范擬定若血液樣本測定HBV、HCV、HIV病毒感染，任有一項出現(xiàn)血清學(xué)指標(biāo)檢測指標(biāo)陽性或核酸檢測陽性，即對此類對象進(jìn)行輸血的永久性屏蔽[8]。同時一直以來，輸血殘余風(fēng)險是影響輸血安全性的主要問題，其存在的安全隱患是獻(xiàn)血者感染病毒后存在的“窗口期”[9]。為了提高輸血安全性，我國相關(guān)部門頒布了多種血站操作規(guī)范，增加血液樣本快速檢測法、核酸擴(kuò)增檢測等技術(shù)，以此降低與輸血有關(guān)的傳播病原體的發(fā)生風(fēng)險。但是因檢測方法以及檢測試劑的靈敏度限制，存在血液病毒檢測“窗口期”及輸血人群數(shù)量大幅度增加等，使輸血感染性疾病發(fā)生風(fēng)險明顯提高[10]。

HBV、HCV、HIV病毒是血站進(jìn)行輸血工作時發(fā)生的傳染性疾病的主要病毒源，當(dāng)前血站篩查血液病原體時主要是采用酶聯(lián)免疫法，可有效篩查與輸血有關(guān)的傳染病原體。但是采用該種檢測技術(shù)能夠預(yù)防傳染性疾病風(fēng)險，并無法阻斷輸血傳染疾病的發(fā)生過程。另外操作試劑、操作水平以及病毒“窗口期”等因素均會影響其檢測結(jié)果，導(dǎo)致檢測假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[11]。一般HBV、抗-HCV、抗-HIV經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢測的“窗口期”在45～56 d、72 d及22 d，會增加臨床輸血傳播風(fēng)險[12-13]。核酸擴(kuò)增技術(shù)是當(dāng)前血站輸血安全篩查的重要技術(shù)，具有較高的敏感性，其通過對血液樣本中極低微量的核酸進(jìn)行檢測，能直接檢測出血液樣本病毒病原體，顯著縮短血液病毒檢測的“窗口期”，其HBV、抗-HCV、抗-HIV“窗口期”中位縮短期分別為9 d、59 d及11 d，以此在最大程度上降低穿輸血傳播疾病風(fēng)險[14-15]。本研究中36 422份血液樣本經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢測HBV、HCV、HIV陽性率分別為0.33%、0.005%及0.005%；核酸擴(kuò)增檢測HBV、HCV、HIV陽性率分別為0.35%、0.014%、0.011%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果證實采用核酸擴(kuò)增技術(shù)能夠有效篩查出血液傳染性病原體，且符合率高。HANS等[16]調(diào)查印度北部獻(xiàn)血者病毒輸血傳播性感染，對其采用核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測，能改善中心血液安全性，阻止每年150例病毒輸血傳播性感染的發(fā)生。該技術(shù)用于輸血安全檢測過程，直接擴(kuò)增病毒核酸，或相應(yīng)放大病毒核酸的附帶信號，使其檢測結(jié)果轉(zhuǎn)為可視信號，以此評估血液標(biāo)本內(nèi)病原體病毒表達(dá)含量，為輸血者提供可靠的健康信息。

采用核酸擴(kuò)增技術(shù)鑒別血液標(biāo)本病毒感染體時，單陽性標(biāo)本鑒別診斷的陰性率超過70%，也是影響單份血液樣本核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測假陽性[17]。同時細(xì)菌、真菌污染血液樣本，或正常血漿蛋白會引起樣本非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性；此外，血液標(biāo)本病毒載量高低也影響核酸檢測陽性與陰性結(jié)果[18]。本研究結(jié)果證實核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測準(zhǔn)確性及可行性。有研究指出，核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測靈敏度高，能直接檢測出血清樣本病原體，并能篩查出酶聯(lián)免疫檢測陰性標(biāo)本內(nèi)的隱匿性感染以及酶聯(lián)免疫“窗口期”[19]，但存在核酸擴(kuò)增檢測漏檢原因是部分獻(xiàn)血人員的血液標(biāo)本病毒載量較低，且低于核酸擴(kuò)增檢測值下限，而病毒抗原體水平高，此時導(dǎo)致病原體檢測陰性率[20]。因此核酸擴(kuò)增技術(shù)并不能完全替代酶聯(lián)免疫法，酶聯(lián)免疫法對血清病毒載量低、病毒抗原水平高的研究對象有較高價值，此時聯(lián)合酶聯(lián)免疫法，可提高血清低病毒載量的血清感染率，降低與輸血有關(guān)的病毒感染風(fēng)險。

綜上所述，血清學(xué)病毒傳播是影響輸血安全性的主要隱患，采用核酸擴(kuò)增技術(shù)可有效篩查出血清病學(xué)標(biāo)志物HIV、HBV、HCV存在風(fēng)險，與酶聯(lián)免疫法比較有高度符合率。因此采用核酸擴(kuò)增技術(shù)用于輸血工作篩查，能降低輸血殘余風(fēng)險，排除檢測假陽性樣本，了解輸血對象的健康信息，為預(yù)防與控制輸血傳播感染風(fēng)險提供合理的參考信息。但對血清病毒載量低、病毒抗原水平高的血清樣本，核酸擴(kuò)增技術(shù)無法完全替代酶聯(lián)免疫法與血清學(xué)檢測技術(shù)，此時血站需要選用合理的篩查技術(shù)，提高輸血安全性。