宏基因二代測(cè)序技術(shù)在無(wú)反應(yīng)肺炎診治中的應(yīng)用價(jià)值

張安兵，袁小玲，夏秀瓊，呂燕華，張丹丹，梁劍平

中山市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 中山 528400

無(wú)反應(yīng)肺炎是指社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)患者在接受抗感染治療的情況下，沒(méi)有獲得顯著改善的一種臨床情況(臨床癥狀?lèi)夯虬Y狀無(wú)變化)，臨床上約有15%的CAP對(duì)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效[1-2]，ARANCIBIA等[3]發(fā)現(xiàn)近70%治療失敗原因是由于感染因素所致，因此快速確定病原體并進(jìn)行針對(duì)性抗感染治療顯得尤為重要。傳統(tǒng)痰培養(yǎng)陽(yáng)性率低、周期長(zhǎng)，已難以滿足指導(dǎo)臨床抗感染治療的需求。宏基因二代測(cè)序技術(shù)(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)是借助二代測(cè)序平臺(tái)快速測(cè)序而得知樣品中微生物的種類(lèi)的技術(shù)[4]，該技術(shù)被逐漸應(yīng)用于探究疑難感染病原體，但將該技術(shù)應(yīng)用于無(wú)反應(yīng)肺炎鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究試圖探討mNGS在無(wú)反應(yīng)肺炎診治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取中山市人民醫(yī)院2019年1月至2021年5月收治且符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的60例無(wú)反應(yīng)肺炎患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2007年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(IDSA/ATS)“成人社區(qū)獲得性肺炎診治指南”對(duì)無(wú)反應(yīng)肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②抗菌藥物治療至少10 d后，仍有肺部浸潤(rùn)陰影以及肺部急性感染的臨床表現(xiàn)；或者在入院72 h內(nèi)進(jìn)展為急性呼吸衰竭需要機(jī)械通氣支持或膿毒性休克需要血管活性藥物治療；③無(wú)纖支鏡檢查禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲或＞80歲；②肺血栓栓塞癥；③結(jié)締組織疾病累及肺部；④患獲得性免疫缺陷綜合征者；⑤粒細(xì)胞缺乏者；⑥妊娠或哺乳期婦女；⑦嚴(yán)重肝功能、腎功能損害者；⑧既往有慢性肺源性心臟病者；⑨氣管切開(kāi)后戴管者；⑩患者達(dá)到臨床穩(wěn)定狀態(tài)：體溫≤37.8℃、心率≤100次/min、呼吸頻率≤24次/min、收縮壓≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、血氧飽和度(SaO2)≥90%或血氧分壓(PaO2)≥60 mmHg、能經(jīng)口進(jìn)食、意識(shí)狀態(tài)正常。采用隨機(jī)數(shù)表法將患者分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各30例。兩組患者的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、氧分壓(PO2)、白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞比例(N%)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)及一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)中山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組患者的一般資料及治療前檢驗(yàn)指標(biāo)比較

1.2 研究方法對(duì)照組所有患者均在入院時(shí)、抗生素使用前，漱口后留深部痰，標(biāo)本送我院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心行細(xì)菌及真菌培養(yǎng)(痰標(biāo)本均經(jīng)痰涂片證實(shí)為合格痰)；初始經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，后根據(jù)痰涂片、痰培養(yǎng)、化驗(yàn)結(jié)果調(diào)整治療方案；調(diào)整抗感染方案后仍無(wú)效，且難以判斷肺部病灶是否為非感染者，可行纖支鏡肺活檢術(shù)或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)協(xié)助診斷。實(shí)驗(yàn)組患者均由5年以上操作經(jīng)驗(yàn)的纖支鏡醫(yī)師完成纖支鏡肺泡灌洗術(shù)；患者在咪達(dá)唑侖靜脈鎮(zhèn)靜下，經(jīng)鼻進(jìn)鏡，2%利多卡因氣道黏膜表面麻醉，選取病變嚴(yán)重的段支氣管，將支氣管鏡頂端嵌頓在支氣管樹(shù)分支，注入生理鹽水60～120 mL灌洗，然后以100 mmHg負(fù)壓抽吸，回收率為40%～60%，回收的灌洗液裝入滅菌容器中(樣本量不少于10 mL)，灌洗液送深圳華大基因行mNGS檢測(cè)(DNA檢測(cè))；根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整抗感染方案，mNGS無(wú)陽(yáng)性結(jié)果者可進(jìn)一步行纖支鏡肺活檢術(shù)或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)協(xié)助診斷。

1.3 病原體檢測(cè)的宏基因二代測(cè)序法該檢測(cè)在深圳華大基因進(jìn)行。取3～5 mL肺泡灌洗液置于離心試管中，將試管置于4℃、4 000 r/min高速離心10 min，按照TIANamp Micro DNA Kit[DP316，天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。將提取到的樣本DNA超聲破碎至150 bp左右的片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫(kù)插入片段大小為200～300 bp，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc)質(zhì)控DNA文庫(kù)濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫(kù)經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載到測(cè)序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量短片段(長(zhǎng)度＜35 bp)獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。通過(guò)BWA(BWA：http：//bio-bwa.sourceforge.net/)測(cè)序分析軟件將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對(duì)到人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度序列后與細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)4個(gè)微生物大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其他檢測(cè)來(lái)判斷可能的病原體。

1.4 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法(1)比較兩組患者病原體檢出率。(2)治療結(jié)束后比較兩組患者抗生素的使用時(shí)間、平均住院日、平均住院費(fèi)用、28 d死亡率。(3)臨床療效。治療20 d后參照金平珍等[5]文獻(xiàn)公布的標(biāo)準(zhǔn)，分顯效、有效、無(wú)效3級(jí)，顯效和有效合計(jì)為總有效率。顯效，體溫、呼吸道癥狀及體征、實(shí)驗(yàn)室檢查(包含血象、CRP、PCT)均恢復(fù)正常，影像學(xué)恢復(fù)正?；虼蟛糠治?病變吸收≥50%)。有效，體溫、呼吸道癥狀及體征、實(shí)驗(yàn)室檢查均恢復(fù)正?；蛎黠@好轉(zhuǎn)，影像學(xué)有吸收。無(wú)效，體溫、呼吸道癥狀及體征、實(shí)驗(yàn)室檢查至少有一項(xiàng)改善不明顯甚至惡化，或一度改善后又惡化，影像學(xué)無(wú)吸收或進(jìn)展；有效率=(顯效+有效)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier方法得出累積有效率和死亡率。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS在無(wú)反應(yīng)肺炎病原體診斷中的應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)組患者最終確定為感染者27例，非感染者3例；對(duì)照組感染者26例，非感染者4例(表2)；兩組患者感染例數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.161，P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組中檢出病原體27例，其中細(xì)菌12例(44.44%)，真菌8例(29.63%)；病毒3例(11.11%)，其他少見(jiàn)病原體4例(14.82%)。實(shí)驗(yàn)組病原體檢測(cè)陽(yáng)性率(27例，90.00%)明顯高于對(duì)照組(13例，43.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.70，P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組患者的疾病譜(例)

表3 兩組患者的病原體檢測(cè)結(jié)果(例)

2.2 兩組患者抗菌藥物使用時(shí)間、平均住院日、平均住院費(fèi)用比較實(shí)驗(yàn)組患者抗菌藥物使用時(shí)間、平均住院日和平均住院費(fèi)用明顯少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組患者抗菌藥物的使用時(shí)間、平均住院日和平均住院費(fèi)用比較(±s)

表4 兩組患者抗菌藥物的使用時(shí)間、平均住院日和平均住院費(fèi)用比較(±s)

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值例數(shù)30 30抗菌藥物使用時(shí)間(d)19.13±2.31 22.47±3.83 4.090＜0.05平均住院日(d)23.85±2.34 27.91±4.86 4.122＜0.05平均住院費(fèi)用(萬(wàn)元)2.61±0.45 2.92±0.56 2.363＜0.05

2.3 兩組患者的臨床療效及28 d死亡率比較治療20 d后實(shí)驗(yàn)組患者的治療有效率為86.67%，明顯高于對(duì)照組的63.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.355，P=0.036)，見(jiàn)表5。28 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組無(wú)患者死亡，對(duì)照組1例患者死亡，兩組患者28 d死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.01，P＞0.05)。

表5 兩組患者臨床治療效果比較(例)

3 討論

無(wú)反應(yīng)肺炎病死率為一般肺炎的3～5倍[1]。早期發(fā)現(xiàn)和評(píng)估無(wú)反應(yīng)性肺炎、明確病原體、及時(shí)針對(duì)性抗感染治療是降低病死率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。本研究中無(wú)反應(yīng)肺炎患者約88%為感染，這與ARANCIBIA等[3]報(bào)道相似，而在臨床上僅有不到一半的CAP患者能確定病原體[6]，臨床亟需新的檢測(cè)技術(shù)來(lái)快速、準(zhǔn)確找到致病病原體。

mNGS可直接從臨床標(biāo)本中提取全部微生物DNA，具有病原體檢出陽(yáng)性率高、快速、靈敏度高等特點(diǎn)[7]。本研究中實(shí)驗(yàn)組患者的灌洗液mNGS病原體檢出率高達(dá)90.00%，明顯高于對(duì)照組的43.33%。文獻(xiàn)報(bào)道灌洗液mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率為36%～100%[8-9]。這與纖支鏡操作者能否取到有效標(biāo)本有較大關(guān)系，本研究均由5年以上纖支鏡操作經(jīng)驗(yàn)者參與留取灌洗液，提高了標(biāo)本質(zhì)量。

本研究中實(shí)驗(yàn)組無(wú)反應(yīng)肺炎病原體占比由高到低依次為細(xì)菌、真菌、病毒、少見(jiàn)病原體，細(xì)菌中以革蘭陰性菌為主，革蘭陰性菌中銅綠假單胞菌占比最高，革蘭陽(yáng)性菌以金黃色葡萄球菌為主，這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道結(jié)果相似[10-11]。因此，對(duì)無(wú)反應(yīng)肺炎經(jīng)驗(yàn)性調(diào)整抗感染方案時(shí)可考慮抗銅綠假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物、氟喹諾酮類(lèi)藥物，必要時(shí)加用萬(wàn)古霉素或替考拉寧、利奈唑胺重點(diǎn)覆蓋陽(yáng)性菌。實(shí)驗(yàn)組真菌占比29.63%，對(duì)于長(zhǎng)期使用激素或免疫抑制劑、合并其他基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致免疫力低下者應(yīng)常規(guī)完善G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)，盡早考慮抗真菌治療，因真菌中以耶氏肺孢子菌、曲霉菌為主，經(jīng)驗(yàn)用藥時(shí)可考慮伏立康唑聯(lián)用復(fù)方磺胺甲噁唑。實(shí)驗(yàn)組3例患者診斷為病毒感染，既往對(duì)病毒肺炎多通過(guò)抗體檢測(cè)或PCR診斷，但陽(yáng)性率較低，mNGS對(duì)病毒的診斷敏感性好，但檢測(cè)出病毒序列并不等于病毒性肺炎，仍需結(jié)合患者病史及其他輔助檢查進(jìn)行綜合判斷。實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)出極難培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、鸚鵡熱衣原體等少見(jiàn)病原體，以往對(duì)該類(lèi)病原體的檢測(cè)往往需在結(jié)核病專科醫(yī)院或少數(shù)三甲醫(yī)院進(jìn)行，難以在廣大基層醫(yī)院開(kāi)展，對(duì)這類(lèi)患者的診斷及治療往往滯后，mNGS的應(yīng)用逐漸突破對(duì)罕見(jiàn)病原體的診斷限制，使得該類(lèi)疾病在基層醫(yī)院的診治成為可能。實(shí)驗(yàn)組mNGS檢測(cè)出1例結(jié)核分枝桿菌感染，該患者同時(shí)肺泡灌洗液Xpert陽(yáng)性，但痰涂片未找到抗酸桿菌。據(jù)孫雯雯等[12]報(bào)道，mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度為59%，顯著高于涂片的15%和培養(yǎng)的26%(P＜0.05)，但與Xpert(52%)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組1例患者通過(guò)mNGS確診為非結(jié)核分枝桿菌感染，因環(huán)境中、機(jī)體存在非結(jié)核分枝桿菌定植，檢測(cè)出該菌需結(jié)合患者其他檢查結(jié)果綜合判斷為致病菌或定植菌。繆青等[13]報(bào)道，mNGS對(duì)非結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價(jià)值與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)(24.7%vs 21.9%)。實(shí)驗(yàn)組有2例患者診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎，該菌為專性細(xì)胞內(nèi)陰性菌，主要感染禽類(lèi)，人主要通過(guò)吸入含該菌的排泄物氣溶膠感染[14]，該菌極難培養(yǎng)，既往有少數(shù)通過(guò)血清學(xué)或PCR診斷的病例報(bào)道，但這兩種方法的敏感性、特異性均較低，mNGS的應(yīng)用使得越來(lái)越多的患者被診斷[15-16]；對(duì)于有禽類(lèi)接觸史，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、肌肉酸痛、乏力的肺炎患者，應(yīng)考慮鸚鵡熱肺炎可能，經(jīng)驗(yàn)性抗感染可考慮應(yīng)用喹諾酮類(lèi)或β內(nèi)酰胺類(lèi)聯(lián)用多西環(huán)素[17]。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)mNGS及早明確病原體，及時(shí)調(diào)整治療方案，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，避免了長(zhǎng)期過(guò)廣、過(guò)多的使用抗菌藥物，明顯提高了患者臨床療效、縮短了住院時(shí)間、降低了住院費(fèi)用。本研究中兩組患者的28 d死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與XIE等[18]報(bào)道的mNGS明顯降低了無(wú)反應(yīng)肺炎患者90 d死亡率不符；考慮可能與本研究所選病例均為普通病房患者，缺乏重癥監(jiān)護(hù)室患者入組，同時(shí)考慮與樣本量偏少有關(guān)。

綜上所述，mNGS應(yīng)用于無(wú)反應(yīng)肺炎患者能明顯提高病原體檢測(cè)陽(yáng)性率和治療效果，縮短抗生素使用時(shí)間、住院時(shí)間，減少住院費(fèi)用。但因本研究樣本例數(shù)偏少，期待更大樣本量的多中心研究進(jìn)一步指導(dǎo)無(wú)反應(yīng)肺炎患者的經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療。