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    宏基因二代測序技術(shù)在無反應(yīng)肺炎診治中的應(yīng)用價值

    2022-05-30 01:28:18張安兵袁小玲夏秀瓊呂燕華張丹丹梁劍平
    海南醫(yī)學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:檢測

    張安兵,袁小玲,夏秀瓊,呂燕華,張丹丹,梁劍平

    中山市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,廣東 中山 528400

    無反應(yīng)肺炎是指社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)患者在接受抗感染治療的情況下,沒有獲得顯著改善的一種臨床情況(臨床癥狀惡化或癥狀無變化),臨床上約有15%的CAP對經(jīng)驗性抗感染治療無效[1-2],ARANCIBIA等[3]發(fā)現(xiàn)近70%治療失敗原因是由于感染因素所致,因此快速確定病原體并進行針對性抗感染治療顯得尤為重要。傳統(tǒng)痰培養(yǎng)陽性率低、周期長,已難以滿足指導(dǎo)臨床抗感染治療的需求。宏基因二代測序技術(shù)(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)是借助二代測序平臺快速測序而得知樣品中微生物的種類的技術(shù)[4],該技術(shù)被逐漸應(yīng)用于探究疑難感染病原體,但將該技術(shù)應(yīng)用于無反應(yīng)肺炎鮮見報道。因此,本研究試圖探討mNGS在無反應(yīng)肺炎診治中的應(yīng)用價值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料選取中山市人民醫(yī)院2019年1月至2021年5月收治且符合以下納入和排除標準的60例無反應(yīng)肺炎患者為研究對象。納入標準:①符合2007年美國感染病學(xué)會/美國胸科學(xué)會(IDSA/ATS)“成人社區(qū)獲得性肺炎診治指南”對無反應(yīng)肺炎的診斷標準[1];②抗菌藥物治療至少10 d后,仍有肺部浸潤陰影以及肺部急性感染的臨床表現(xiàn);或者在入院72 h內(nèi)進展為急性呼吸衰竭需要機械通氣支持或膿毒性休克需要血管活性藥物治療;③無纖支鏡檢查禁忌證。排除標準:①年齡<18歲或>80歲;②肺血栓栓塞癥;③結(jié)締組織疾病累及肺部;④患獲得性免疫缺陷綜合征者;⑤粒細胞缺乏者;⑥妊娠或哺乳期婦女;⑦嚴重肝功能、腎功能損害者;⑧既往有慢性肺源性心臟病者;⑨氣管切開后戴管者;⑩患者達到臨床穩(wěn)定狀態(tài):體溫≤37.8℃、心率≤100次/min、呼吸頻率≤24次/min、收縮壓≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、血氧飽和度(SaO2)≥90%或血氧分壓(PaO2)≥60 mmHg、能經(jīng)口進食、意識狀態(tài)正常。采用隨機數(shù)表法將患者分為實驗組和對照組各30例。兩組患者的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、氧分壓(PO2)、白細胞(WBC)、中性粒細胞比例(N%)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)及一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)中山市人民醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。

    表1 兩組患者的一般資料及治療前檢驗指標比較

    1.2 研究方法對照組所有患者均在入院時、抗生素使用前,漱口后留深部痰,標本送我院檢驗醫(yī)學(xué)中心行細菌及真菌培養(yǎng)(痰標本均經(jīng)痰涂片證實為合格痰);初始經(jīng)驗性抗感染治療,后根據(jù)痰涂片、痰培養(yǎng)、化驗結(jié)果調(diào)整治療方案;調(diào)整抗感染方案后仍無效,且難以判斷肺部病灶是否為非感染者,可行纖支鏡肺活檢術(shù)或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)協(xié)助診斷。實驗組患者均由5年以上操作經(jīng)驗的纖支鏡醫(yī)師完成纖支鏡肺泡灌洗術(shù);患者在咪達唑侖靜脈鎮(zhèn)靜下,經(jīng)鼻進鏡,2%利多卡因氣道黏膜表面麻醉,選取病變嚴重的段支氣管,將支氣管鏡頂端嵌頓在支氣管樹分支,注入生理鹽水60~120 mL灌洗,然后以100 mmHg負壓抽吸,回收率為40%~60%,回收的灌洗液裝入滅菌容器中(樣本量不少于10 mL),灌洗液送深圳華大基因行mNGS檢測(DNA檢測);根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整抗感染方案,mNGS無陽性結(jié)果者可進一步行纖支鏡肺活檢術(shù)或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)協(xié)助診斷。

    1.3 病原體檢測的宏基因二代測序法該檢測在深圳華大基因進行。取3~5 mL肺泡灌洗液置于離心試管中,將試管置于4℃、4 000 r/min高速離心10 min,按照TIANamp Micro DNA Kit[DP316,天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒說明書提取DNA。將提取到的樣本DNA超聲破碎至150 bp左右的片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫插入片段大小為200~300 bp,使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc)質(zhì)控DNA文庫濃度,經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載到測序芯片,使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000進行測序。測序數(shù)據(jù)下機后去除低質(zhì)量短片段(長度<35 bp)獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。通過BWA(BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)測序分析軟件將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對到人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度序列后與細菌、真菌、病毒、寄生蟲4個微生物大數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù),根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。

    1.4 觀察指標與評價方法(1)比較兩組患者病原體檢出率。(2)治療結(jié)束后比較兩組患者抗生素的使用時間、平均住院日、平均住院費用、28 d死亡率。(3)臨床療效。治療20 d后參照金平珍等[5]文獻公布的標準,分顯效、有效、無效3級,顯效和有效合計為總有效率。顯效,體溫、呼吸道癥狀及體征、實驗室檢查(包含血象、CRP、PCT)均恢復(fù)正常,影像學(xué)恢復(fù)正?;虼蟛糠治?病變吸收≥50%)。有效,體溫、呼吸道癥狀及體征、實驗室檢查均恢復(fù)正?;蛎黠@好轉(zhuǎn),影像學(xué)有吸收。無效,體溫、呼吸道癥狀及體征、實驗室檢查至少有一項改善不明顯甚至惡化,或一度改善后又惡化,影像學(xué)無吸收或進展;有效率=(顯效+有效)/總例數(shù)×100%。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;用Kaplan-Meier方法得出累積有效率和死亡率。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 mNGS在無反應(yīng)肺炎病原體診斷中的應(yīng)用效果實驗組患者最終確定為感染者27例,非感染者3例;對照組感染者26例,非感染者4例(表2);兩組患者感染例數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.161,P>0.05)。實驗組中檢出病原體27例,其中細菌12例(44.44%),真菌8例(29.63%);病毒3例(11.11%),其他少見病原體4例(14.82%)。實驗組病原體檢測陽性率(27例,90.00%)明顯高于對照組(13例,43.33%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.70,P<0.05),見表3。

    表2 兩組患者的疾病譜(例)

    表3 兩組患者的病原體檢測結(jié)果(例)

    2.2 兩組患者抗菌藥物使用時間、平均住院日、平均住院費用比較實驗組患者抗菌藥物使用時間、平均住院日和平均住院費用明顯少于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。

    表4 兩組患者抗菌藥物的使用時間、平均住院日和平均住院費用比較(±s)

    表4 兩組患者抗菌藥物的使用時間、平均住院日和平均住院費用比較(±s)

    組別實驗組對照組t值P值例數(shù)30 30抗菌藥物使用時間(d)19.13±2.31 22.47±3.83 4.090<0.05平均住院日(d)23.85±2.34 27.91±4.86 4.122<0.05平均住院費用(萬元)2.61±0.45 2.92±0.56 2.363<0.05

    2.3 兩組患者的臨床療效及28 d死亡率比較治療20 d后實驗組患者的治療有效率為86.67%,明顯高于對照組的63.33%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.355,P=0.036),見表5。28 d內(nèi)實驗組無患者死亡,對照組1例患者死亡,兩組患者28 d死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.01,P>0.05)。

    表5 兩組患者臨床治療效果比較(例)

    3 討論

    無反應(yīng)肺炎病死率為一般肺炎的3~5倍[1]。早期發(fā)現(xiàn)和評估無反應(yīng)性肺炎、明確病原體、及時針對性抗感染治療是降低病死率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。本研究中無反應(yīng)肺炎患者約88%為感染,這與ARANCIBIA等[3]報道相似,而在臨床上僅有不到一半的CAP患者能確定病原體[6],臨床亟需新的檢測技術(shù)來快速、準確找到致病病原體。

    mNGS可直接從臨床標本中提取全部微生物DNA,具有病原體檢出陽性率高、快速、靈敏度高等特點[7]。本研究中實驗組患者的灌洗液mNGS病原體檢出率高達90.00%,明顯高于對照組的43.33%。文獻報道灌洗液mNGS檢測陽性率為36%~100%[8-9]。這與纖支鏡操作者能否取到有效標本有較大關(guān)系,本研究均由5年以上纖支鏡操作經(jīng)驗者參與留取灌洗液,提高了標本質(zhì)量。

    本研究中實驗組無反應(yīng)肺炎病原體占比由高到低依次為細菌、真菌、病毒、少見病原體,細菌中以革蘭陰性菌為主,革蘭陰性菌中銅綠假單胞菌占比最高,革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌為主,這與國內(nèi)外報道結(jié)果相似[10-11]。因此,對無反應(yīng)肺炎經(jīng)驗性調(diào)整抗感染方案時可考慮抗銅綠假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類藥物、氟喹諾酮類藥物,必要時加用萬古霉素或替考拉寧、利奈唑胺重點覆蓋陽性菌。實驗組真菌占比29.63%,對于長期使用激素或免疫抑制劑、合并其他基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致免疫力低下者應(yīng)常規(guī)完善G實驗、GM實驗,盡早考慮抗真菌治療,因真菌中以耶氏肺孢子菌、曲霉菌為主,經(jīng)驗用藥時可考慮伏立康唑聯(lián)用復(fù)方磺胺甲噁唑。實驗組3例患者診斷為病毒感染,既往對病毒肺炎多通過抗體檢測或PCR診斷,但陽性率較低,mNGS對病毒的診斷敏感性好,但檢測出病毒序列并不等于病毒性肺炎,仍需結(jié)合患者病史及其他輔助檢查進行綜合判斷。實驗組檢測出極難培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、鸚鵡熱衣原體等少見病原體,以往對該類病原體的檢測往往需在結(jié)核病??漆t(yī)院或少數(shù)三甲醫(yī)院進行,難以在廣大基層醫(yī)院開展,對這類患者的診斷及治療往往滯后,mNGS的應(yīng)用逐漸突破對罕見病原體的診斷限制,使得該類疾病在基層醫(yī)院的診治成為可能。實驗組mNGS檢測出1例結(jié)核分枝桿菌感染,該患者同時肺泡灌洗液Xpert陽性,但痰涂片未找到抗酸桿菌。據(jù)孫雯雯等[12]報道,mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度為59%,顯著高于涂片的15%和培養(yǎng)的26%(P<0.05),但與Xpert(52%)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組1例患者通過mNGS確診為非結(jié)核分枝桿菌感染,因環(huán)境中、機體存在非結(jié)核分枝桿菌定植,檢測出該菌需結(jié)合患者其他檢查結(jié)果綜合判斷為致病菌或定植菌??娗嗟萚13]報道,mNGS對非結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價值與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比無顯著優(yōu)勢(24.7%vs 21.9%)。實驗組有2例患者診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎,該菌為專性細胞內(nèi)陰性菌,主要感染禽類,人主要通過吸入含該菌的排泄物氣溶膠感染[14],該菌極難培養(yǎng),既往有少數(shù)通過血清學(xué)或PCR診斷的病例報道,但這兩種方法的敏感性、特異性均較低,mNGS的應(yīng)用使得越來越多的患者被診斷[15-16];對于有禽類接觸史,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、肌肉酸痛、乏力的肺炎患者,應(yīng)考慮鸚鵡熱肺炎可能,經(jīng)驗性抗感染可考慮應(yīng)用喹諾酮類或β內(nèi)酰胺類聯(lián)用多西環(huán)素[17]。

    本研究結(jié)果顯示,通過mNGS及早明確病原體,及時調(diào)整治療方案,實現(xiàn)精準治療,避免了長期過廣、過多的使用抗菌藥物,明顯提高了患者臨床療效、縮短了住院時間、降低了住院費用。本研究中兩組患者的28 d死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與XIE等[18]報道的mNGS明顯降低了無反應(yīng)肺炎患者90 d死亡率不符;考慮可能與本研究所選病例均為普通病房患者,缺乏重癥監(jiān)護室患者入組,同時考慮與樣本量偏少有關(guān)。

    綜上所述,mNGS應(yīng)用于無反應(yīng)肺炎患者能明顯提高病原體檢測陽性率和治療效果,縮短抗生素使用時間、住院時間,減少住院費用。但因本研究樣本例數(shù)偏少,期待更大樣本量的多中心研究進一步指導(dǎo)無反應(yīng)肺炎患者的經(jīng)驗性抗感染治療。

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