基于斑馬魚生物模型評價青錢柳的降糖作用

劉均，李強，譚蓉

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江省茶資源跨界應用技術重點實驗室，浙江杭州 310016）

斑馬魚（Zebrafish）是一種脊椎模式生物，與人類基因具有高度相似性，同時具有個體小、發(fā)育周期短、實驗周期短、費用低、單次產卵數較高、實驗用藥量小等顯著優(yōu)勢，已成為生命科學研究的新寵，并廣泛用于構建人類的各種疾病和腫瘤模型，建立藥物篩選和治療的研究平臺。利用斑馬魚構建的人類疾病模型，屬于從事在體研究，可以作為連接非脊椎動物（細胞等）和哺乳動物（大小鼠等）實驗之間的巨大生物學斷層，完善現(xiàn)有藥物研發(fā)體系。截止目前，以斑馬魚為對象，可以成功構建糖尿病[1,2]、高血脂[3,4]、高尿酸癥[5,6]、失眠[7,8]等生物模型，并可以有效開展靶向藥物篩選以及藥物安全與毒理評價研究。在糖尿病斑馬魚模型建立方面，目前主要以斑馬魚成魚為主，如采用腹腔注射四氧嘧啶（Alloxan，ALX）或鏈脲佐菌素[9,10]，或采用ALX與高糖溶液聯(lián)合誘導[11]，再或者采用過度飼喂法[12]建立糖尿病模型。Shin等[11]以斑馬魚成魚為對象，研究不同濃度ALX（1、2、3、4 mg/mL）溶液孵育不同時間（10、20、30 min），以及研究不同濃度葡萄糖（GLU，1%、2%、3%）溶液孵育不同時間（30 min，1、2、3 h）對血糖的影響，最終認為先以3 mg/mL ALX溶液誘導30 min，再用1% GLU溶液孵育30 min，最后在水溶液中孵育1 h可以誘導建立斑馬魚高血糖模型。Zang等[12]以4～6月齡斑馬魚成魚為對象，采用過度飼喂法，探討建立2型糖尿病斑馬魚生物模型。研究發(fā)現(xiàn)，相比每天喂食1次，采用過度飼喂法每天喂食6次的魚空腹血糖水平顯著增加，并且經腹腔和口服糖耐量試驗結果表明過度飼喂法下斑馬魚出現(xiàn)糖耐量受損，而且經抗糖尿病治療藥物二甲雙弧和格列美脲治療具有降糖效用，表明以此方式可以建立2型糖尿病斑馬魚模型。但是，目前以斑馬魚幼魚為對象，開展糖尿病斑馬魚生物模型構建方面的研究報道還較為鮮見。

青錢柳（Cyclocarya paliurus，CP）屬于胡桃科、青錢柳屬植物，同時也屬于古老珍稀樹種，僅存于中國，科學研究表明CP具有顯著降血糖的功能特性[13-15]。因此，本文以5 dpf（days post fertilization）斑馬魚為對象，采用單糖GLU單獨或與ALX誘導藥物聯(lián)合建立基于正常生理和病理生理的糖代謝異常斑馬魚生物模型，并以此模型為基礎開展CP降糖作用評價，為健康功能飲品開發(fā)提供基礎理論和基礎數據支撐，同時也為高通量斑馬魚降糖藥物篩選及復方產品開發(fā)提供多方案參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器及試劑

Multiskan SkyHigh酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GLU檢測試劑盒（GLU氧化酶法），南京建成生物工程研究所；全自動智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱，天津市宏諾儀器有限公司；3K1S離心機，德國sigma離心機公司；AL-204精密電子天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；MY-20手持式高速勻漿機，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

GLU（國藥集團化學試劑有限公司）：10 mg/mL溶液制備，稱取1.00 g GLU于燒杯中，加入蒸餾水攪拌溶解并定容至100 mL容量瓶中，冷藏備用。

ALX（CAS號：2244-11-3，純度≥98.0%）：144 μg/mL ALX母液制備，稱量0.0144 g ALX于燒杯中，加入蒸餾水攪拌溶解并定容于100 mL容量瓶中，冷藏備用。準確量取0、1.25、2.50、5.00、10.00、12.50、25.00、50.00 mL上述144 μg/mL ALX母液，加蒸餾水定容至50 mL，分別制成0、3.60、7.20、14.40、28.80、36.00、72.00 μg/mL的ALX溶液，用于斑馬魚對ALX藥物耐受性的影響研究。

青錢柳（CP，文成縣泉山中藥材種植有限公司）：50 mg/mL CP（以生藥量計）貯備液制備，稱取5 g CP于燒杯中，在80 ℃恒溫水浴鍋中浸提3次，每次浸提30 min，合并濾液并定容至100 mL制得50 mg/mL CP（以生藥量計）儲備液，保存于4 ℃冷藏備用。準確量取0、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00和10.00 mL上述CP儲備液，加蒸餾水定容至50 mL，分別制成0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL的CP溶液，用于開展斑馬魚對不同濃度CP溶液耐受性的影響研究。

阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）：50 mg/mL ACA（以生藥量計）貯備液制備，稱取5 g ACA于燒杯中，加入蒸餾水攪拌溶解過濾后定容至100 mL制得50 mg/mL ACA（以生藥量計）儲備液，保存于4 ℃冷藏備用。準確量取0.20、0.40、0.80 mL上述ACA儲備液，加蒸餾水定容至50 mL，分別制成200、400、800 μg/mL的ACA溶液，用于開展降糖功效評價研究。三卡因甲磺酸（CAS號：886-86-2），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.02），南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物

斑馬魚（3月齡，AB型），上海費曦生物科技有限公司。斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進行。每個產卵盒中按1:1放入公魚和母魚，放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，光照設置為14 h光照和10 h黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便，清洗后換孵育水（60 μg/mL海鹽水），置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每24 h換水一次，去掉卵膜和死卵。實驗完成后，用0.017%三卡因甲磺酸暴露將斑馬魚麻醉處死。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚對GLU和ALX的耐受性分析研究

本研究擬以GLU單獨或者與ALX聯(lián)用建立糖代謝異常斑馬魚（幼魚）模型，因幼魚對GLU與ALX的耐藥性的影響尚無參考依據，故開展斑馬魚幼魚對GLU與ALX耐受性的影響研究，為下一步建模方案提供基礎信息。（1）斑馬魚幼魚對GLU耐受性影響：將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為6組，每組3個重復，每個重復30條，分別給予0、10、20、40、80、100 mg/mL GLU溶液；（2）斑馬魚幼魚對ALX耐受性影響：將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為為7組，每組3個重復，每個重復45條，分別給予0、3.60、7.20、14.40、28.80、36.00、72.00 μg/mL溶液。培養(yǎng)24 h記錄死亡數量計算死亡率，探討斑馬魚對GLU和ALX耐受性的影響并指導開展糖尿病斑馬魚建模方案研究。

1.2.2 GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型可行性及有效性分析

1.2.2.1 糖尿病斑馬魚建模可行性研究

基于上述斑馬魚對GLU和ALX耐受性的影響結果，優(yōu)選10 mg/mL GLU與3.60或7.20 μg/mL藥物組合開展糖尿病斑馬魚（幼魚）建模方案研究。將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為4組，分別記為BC1、BC2、MC1、MC2，每組3個重復，每個重復20條，分別給予0 mg/mL GLU+0.00 μg/mL、10 mg/mL GLU+0.00 μg/mL、10 mg/mL GLU+3.60 μg/mL、10 mg/mL GLU+7.20 μg/mL溶液，每孔加藥物8 mL，培養(yǎng)24 h，取9條用于測定GLU含量，探究GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的可行性。

1.2.2.2 糖尿病斑馬魚建模有效性分析

ACA是常見的糖尿病治療藥物，因此選用ACA干預以評價糖尿病建模方案的有效性。將5 dpf野生型AB系斑馬魚給予10 mg/mL GLU+3.60 μg/mL溶液孵育24 h以建立糖尿病模型，然后隨機分為5組，分別記為MC1、T1、T2、T3，每組3個重復，每個重復20條，分別給予10 mg/mL GLU、10 mg/mL GLU+200 μg/mL ACA、10 mg/mL GLU+400 μg/mL ACA、10 mg/mL GLU+800 μg/mL ACA溶液，每孔加藥物8 mL。同步設置0 mg/mL GLU孵育48 h（孵育24 h時換水一次）作為BC1空白對照組。培養(yǎng)結束后，每個重復取10條用于測定GLU含量，探究GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的有效性。

1.2.3 斑馬魚對CP的耐受性分析研究

將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為12組，每組3個重復，每個重復30條，分別給予0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL CP溶液（以生藥量計），每孔加藥物10 mL，每24 h換水一次，記錄死亡數量，計算每組死亡率，優(yōu)選劑量作為降糖作用評價用劑量濃度。

1.2.4 CP對基于正常生理和病理生理的斑馬魚模型的降糖作用研究

1.2.4.1 CP對高糖誘導正常斑馬魚模型降糖作用的影響

根據斑馬魚對CP的耐受性分析結果，按照CP的10%～25% LC50推薦可用于降糖作用評估的劑量濃度并對劑量濃度略作調整，下限調整為200 μg/mL，并按照倍數關系設置400和800 μg/mL作為梯度設計開展CP降糖作用研究。將5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為5組，分別記為BC1、BC2、T1、T2、T3，每組3個重復，每個重復20條，分別給予0 mg/mL GLU+0 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+0 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+200 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+400 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+800 μg/mL CP溶液，每孔加藥物8 mL，培養(yǎng)24 h，取10條用于測定GLU含量，探究CP對高糖誘導斑馬魚模型降糖作用的影響。

1.2.4.2 CP處理對胰島損傷糖尿病糖斑馬魚模型降糖作用的影響

將5 dpf野生型AB系斑馬魚，給予10 mg/mL GLU+3.60 μg/mL聯(lián)合孵育24 h以誘導建立糖尿病模型，然后隨機分成分為5組，分別記為MC1、T1、T2、T3、T4，每組3個重復，每個重復20條，分別給予10 mg/mL GLU、10 mg/mL GLU+200 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+400 μg/mL CP、10 mg/mL GLU+800μg/mL CP、10 mg/mL GLU+400 μg/mL ACA孵育24 h，每孔加藥8 mL。同步設置0 mg/mL GLU、10 mg/mL GLU孵育48 h（孵育24 h時換水一次）作為空白對照組，分別記為BC1和BC2。培養(yǎng)結束后，每個重復取10條魚用于測定GLU含量，探究CP處理對糖尿病斑馬魚模型降糖作用的影響。

1.3 檢測方法

GLU含量檢測按如下步驟進行：取0.1 mL PBS緩沖液于裝魚的1.5 mL離心管中，采用高速手持式勻漿機勻漿直至魚體組織裂解充分，然后于4 ℃下以2500 r/min離心10 min，結束后取上清樣2.5 μL采用GLU檢測試劑盒（GLU氧化酶法）測定GLU濃度，其測定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定的步驟進行。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗數據經Excel 2016處理后，用Graphpad Prism 6.0繪圖，并用SPSS Statistics 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數據均以平均值±標準差呈現(xiàn)，差異顯著性采用Duncan分析并將進行多重比較，p<0.05表示組間差異顯著。在藥物耐受性分析方面，利用SPSS 17.0軟件中PROBIT程序計算其半數致死濃度（Median lethal concentration，LC50）。

2 結果與討論

2.1 斑馬魚對GLU和ALX的耐受性分析

不同濃度GLU和ALX對斑馬魚死亡率的影響見圖1。從圖1中可以看出，斑馬魚幼魚對高濃度GLU和ALX具有不耐受性，當GLU濃度大于等于40 mg/mL或ALX濃度大于等于36.00 μg/mL時死亡率達到100%。10 mg/mL GLU處理組死亡率為2.22%，3.60和7.20 μg/mL ALX處理組死亡率分別為2.22%和4.44%。研究表明，為成功構建基于正常生理和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型，GLU宜選用劑量濃度為10 mg/mL，ALX的宜選用劑量濃度3.60和7.20 μg/mL。

2.2 GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型性及有效性分析研究

綜合斑馬魚對GLU耐受性和ALX耐受性特點，選取10 mg/mL GLU溶液為糖源，并與3.60和7.20 μg/mL ALX聯(lián)合探討建立糖尿病模型的可行性，結果見圖2a。研究發(fā)現(xiàn)，相比BC1組，BC2組斑馬魚組織GLU值顯著增加，達到50.19%（p>0.05），表明以10 mg/mL GLU處理可以構建基于生理的糖代謝異常斑馬魚模型。此外，與BC1組相比，MC1和MC2組斑馬魚組織GLU值顯著增加，分別增加了51.52%和68.32%，且差異均顯著（p<0.05）。結果表明，以10 mg/mL GLU與3.60和7.20 μg/mL ALX作為藥物聯(lián)合可以用于構建基于病理的糖尿病斑馬魚模型的預選方式方法。

基于上述研究，選用10 mg/mL GLU與3.60 μg/mL溶液聯(lián)合建立糖尿病模型并進行模型有效性分析，結果見圖2b。從圖2b中可以看出，與BC1組相比，MC1組斑馬魚GLU值顯著增加，達到46.24%（p<0.05），再次驗證了前期研究結果。與此同時，從糖尿病治療藥物-ACA治療療效方面看，相比MC1組，T1、T2和T3組斑馬魚GLU值顯著降低，分別降低了27.28%、33.69%和38.75%，差異均顯著（p<0.05）。結果顯示在該模型下，ACA降糖效果顯著，表明以此方式誘導建立的糖尿病模型是有效性的。

目前，以斑馬魚幼魚為對象構建糖尿病模型還比較鮮見。可查閱對比的是勞喬聰等[13]的研究，他們以4 dpf斑馬魚為對象，采用40 mg/mL蔗糖作為糖源與144 μg/mL聯(lián)用，并通過二甲雙胍等4種常見糖尿病治療藥物進行模型有效性論證，表示以此方法可以成功并有效建立的糖尿病模型。另外，勞喬聰[16]以4 dpf斑馬魚對象，先后在1.008 mg/mL ALX與36 mg/mL GLU溶液聯(lián)合下沖擊1 h，144 μg/mL ALX與36 mg/mL GLU溶液聯(lián)合下孵育48 h可以有效建立斑馬魚糖尿病模型。但與本研究相比，建模方案有明顯差異，尤其是劑量濃度選用方面差異較大。研究發(fā)現(xiàn)隨著孵育液中GLU劑量濃度的增加致死率明顯上升，可能與試驗使用的斑馬魚的品系、養(yǎng)殖體系參數、藥物品種品質等不同有關，其具體的原因還需后續(xù)進一步的探索研究。另外，同采用類似經典的大小鼠糖尿病造模方式相比[11,12]，本研究以斑馬魚幼魚為對象構建的糖尿病斑馬魚模型更具有明顯的可操作性和便捷性優(yōu)勢，并且成本更為節(jié)約。

2.3 斑馬魚對CP的耐受性分析

不同CP濃度對斑馬魚幼魚死亡率的影響見圖3。從圖3中可以看出，斑馬魚幼魚對高濃度CP溶液具有不耐受性，CP濃度大于等于4000 μg/mL時死亡率為100%。另外，從孵育時間上看，隨著孵育時間的延長死亡率不斷增加。以24 h基準，采用SPSS中PROBIT程序回歸分析得出斑馬魚幼魚的CP耐受性（表1）Probit模型：Probit(p)=-1.26667+0.00049x，按該模型計算得出CP的LC50為2582.82 μg/mL，95%可信范圍為2166.95～3149.83 μg/mL。因而，若按照CP的10%～25% LC50推薦可用于降糖作用評估的劑量濃度為258.28～645.71 μg/mL。

表1 斑馬魚幼魚青錢柳耐受性影響的參數估計表Table 1 Parameter estimates of CP tolerance in zebrafish larvae

2.4 CP對基于正常生理和病理生理的斑馬魚模型的降糖作用研究

根據斑馬魚對CP耐受性的影響，按照CP的10%～25% LC50推薦略作調整，選用200、400和800 μg/mL劑量梯度組合開展CP降糖作用研究，其對基于正常生理和病理生理斑馬魚幼魚GLU值的影響見圖4。從圖4a中可以看出，相比BC1組，BC2組斑馬魚組織GLU值明顯增加，達到21.70%（p>0.05），與前期結果一致。另外，與BC2組相比，T1組對斑馬魚GLU含量影響較小，略微增加了7.77%（p>0.05），T1和T2組斑馬魚GLU值顯著降低，且降低幅度分別達到了37.59%（p<0.05）和38.57%（p<0.05），表明在正常生理模型下較高濃度的CP具有明顯的降糖效應。

從圖4b中可以看出，相比BC1組，10 mg/mL GLU誘導48 h的BC2組斑馬魚GLU值顯著增加（p<0.05），MC1組斑馬魚GLU值顯著增加（p<0.05）。相比MC1組，T1、T2和T3組斑馬魚GLU值顯著降低，分別降低了27.43%、32.75%和29.20%，差異均顯著（p<0.05），表明在該病理模型下CP均表現(xiàn)出了明顯的降糖效應（p<0.05）。

研究發(fā)現(xiàn)，400和800 μg/mL CP可以顯著降低10 mg/mL GLU誘導的斑馬魚GLU值，以及200、400和800 μg/mL可以顯著降低胰島損傷型糖尿病斑馬魚GLU值，CP的降糖作用可能與減少GLU腸道內吸收，保護胰腺促進胰島素分泌[14]，改善胰島素敏感性[15]，增加體內GLU的消耗利用[17-19]，保護并改善肝臟異常代謝[20,21]，還可能與促進血脂穩(wěn)定，增強抗氧化，保護胰腺等相關[22-24]。姚駿凱等[15]研究發(fā)現(xiàn)CP可以顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖和胰島素抵抗指數，顯著增加肝臟磷酸化胰島素受體底物1/胰島素受體底物1蛋白比值以及胰島素受體底物1蛋白mRNA的表達。姚駿凱等[14]研究發(fā)現(xiàn)CP可以降低糖尿病大鼠胰腺可溶性細胞凋亡因子、可溶性細胞凋亡因子配體、活化半胱氨酸蛋白酶8含量以及總c-Jun氨基端激酶1和磷酸化c-Jun氨基端激酶1的表達量，表明CP降糖效應可能與抑制胰腺β細胞凋亡有關。肝臟在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。栗靜等[20,21]研究發(fā)現(xiàn)CP可以通過改善肝臟異常代謝來預防糖尿病[14,15]。另外，勞喬聰[13]等利用斑馬魚模型開展CP降糖作用研究時表明1000和2000 μg/mL CP可以顯著降低血糖值，且降糖效果呈濃度依賴性。因此，下一步將基于正常生理和病理生理生理的糖代謝異常模型，開展CP毒理學安全性評價和劑量學估算研究，尤其是借助斑馬魚幼體透明和可以進行活體染色的顯著優(yōu)勢開展器官毒理損傷作用研究，靶器官損傷的保護和治療作用研究，以及開展復方配伍降糖增效作用研究，為健康功能食品或飲品開發(fā)提供基礎理論和基礎數據支撐。

3 結論

5 dpf斑馬魚對高濃度的GLU、ALX和CP具有不耐受性。相比0 mg/mL GLU組，以10 mg/mL GLU與3.60或7.20 μg/mL ALX聯(lián)合誘導造模24 h，可顯著增加斑馬魚GLU值，分別增加了51.52%（p<0.05）和68.32%（p<0.05）。與模型對照組相比，經200、400和800 μg/mL ACA治療評價斑馬魚GLU值分別降低了27.28%、33.69%和38.75%，差異均顯著（p<0.05），表明以10 mg/mL GLU與3.60 μg/mL ALX聯(lián)合孵育24 h可以有效建立糖尿病斑馬魚模型。另外，研究發(fā)現(xiàn)，400和800 μg/mL CP可以顯著降低10 mg/mL GLU溶液誘導的斑馬魚GLU值，分別降低了37.59%（p<0.05）和38.57%（p<0.05）；200、400和800 μg/mL CP可以顯著降低糖尿病斑馬魚GLU值，分別降低了27.43%、32.75%和29.20%，差異均顯著（p<0.05）。結果表明，基于正常生理和病理生理的斑馬魚生物模型評價，CP具有明顯的降糖效應，其在輔助降糖功能飲品開發(fā)上具有廣闊的應用前景。