超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法 測(cè)定細(xì)辛中的4種馬兜鈴酸

歐愛芬，黃嘉樂，董楊靜，趙肅清

（1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 511400）（2.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東廣州 510405）（3.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東廣州 511440）

馬兜鈴酸是一類硝基菲羧酸，主要存在于馬兜鈴科的馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中[1-4]。在我國(guó)馬兜鈴科植物經(jīng)過(guò)炮制解毒入藥已有幾千年歷史，在南朝時(shí)期唐甑所著的《藥性論》中，就有馬兜鈴的入藥記載，如馬兜鈴性平，能主肺氣上急，坐息不得，主咳逆連連不可止[5,6]。1964年，吳松寒[7]對(duì)2例急性腎衰竭的患者進(jìn)行診斷發(fā)現(xiàn)，均是因?yàn)榇髣┝糠藐P(guān)木通所導(dǎo)致。1992年，比利時(shí)病理醫(yī)師對(duì)兩位腎功能不全者的患者研究發(fā)現(xiàn)，他們均在同一家減肥診所接受減肥治療，隨后研究人員對(duì)他們服用的減肥膠囊進(jìn)行成分檢查測(cè)，被證實(shí)減肥膠囊種含有馬兜鈴科植物廣防己。同時(shí)也從受害者的腎組織種分離出馬兜鈴-DNA加合物，該事件被國(guó)際醫(yī)學(xué)界關(guān)注，繼而對(duì)馬兜鈴酸展開全面研究，并被稱為“馬兜鈴酸腎病”[8-10]。2012年國(guó)際癌癥研究組織將馬兜鈴酸及含有馬兜鈴酸的植物被列為一類致癌物[11,12]。近年，對(duì)多瑙河地區(qū)性家族性腎病研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸隨著植物腐爛進(jìn)入土壤后能夠抵制植株中酶體系及土壤微生物對(duì)其的分解作用，被土壤種植的植物吸收而產(chǎn)生富集[13,14]，因此馬兜鈴酸不單是一種藥源性疾病，同時(shí)還是環(huán)境污染所致的食源性疾病。2020年版《中國(guó)藥典》收錄的細(xì)辛，不單作為中藥材用于中醫(yī)，并且在民間作為一種煲湯食材用于溫肺止咳化痰、益氣祛風(fēng)、散寒止痛的食療方法。

目前馬兜鈴酸的檢測(cè)方法主要是色譜，包括薄層色譜、高相液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等，其中薄層色譜主要用于定性[15,16]；高相液相色譜可以用于定性和定量[17-20]，但是由于中藥材成分的復(fù)雜性，在分離過(guò)程中很難排除其他成分的干擾，存在一定的局限性；液質(zhì)可以準(zhǔn)確地用于定性和定量，但是目前關(guān)于液質(zhì)檢測(cè)馬兜鈴酸的含量，主要集中在含量較高毒性最強(qiáng)的馬兜鈴酸A上[21-26]。隨著對(duì)馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸主要結(jié)構(gòu)除了馬兜鈴酸A以外，還有馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D，其結(jié)構(gòu)差異主要是甲氧基或者羥基的位置不同[27]。馬兜鈴酸的毒性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，硝基是馬兜鈴酸類衍生物中最主要的毒性基團(tuán)，此外羥基的存在可以使馬兜鈴酸的毒性進(jìn)一步加強(qiáng)，其中馬兜鈴酸A的毒性最強(qiáng)，馬兜鈴酸B也具有一定毒性，而其他成分的腎毒性和致癌性差異尚不明確[28]。因此建立同時(shí)測(cè)定馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D的液質(zhì)方法，并對(duì)目前市售細(xì)辛及含有細(xì)辛的8種中成藥中四種馬兜鈴酸含量進(jìn)行分析，對(duì)細(xì)辛的食用及藥用安全，以及及含細(xì)辛中成藥的質(zhì)量控制具有重要意義。

超高相液相色譜（UPLC）相對(duì)于高效液相色譜，其可以在工作壓力超過(guò)6000 psi或工作溫度超過(guò)環(huán)境溫度的下應(yīng)用，可以使用填充顆粒更小的色譜柱，不僅可以實(shí)現(xiàn)更高的分辨率，同時(shí)還能縮短整體的分析時(shí)間。質(zhì)譜分析具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好，定性和定量能同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀利用母離子和子離子的共同特征，定量選擇性高。因此，本文建立了同時(shí)快速測(cè)定中藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D四種物質(zhì)的超高相液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法（UPLC-QQQ-MS/MS），并對(duì)9個(gè)樣品中四種物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、甲酸，均為色譜純，德國(guó)Merck公司；馬兜鈴酸A（CAS：313-67-7），羅恩試劑；馬兜鈴酸B（CAS：475-80-9）、馬兜鈴酸C（CAS：4849-90-5）、馬兜鈴酸D（CAS：17413-38-6）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)廣州測(cè)試中心；9種試驗(yàn)用藥，市售。

島津LC-30A超高效液相色譜儀，日本島津；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司；AB Sciex 5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，（配備電噴霧離子源（ESI），software version: Analyst.7.1），美國(guó)AB SCIEX公司；十萬(wàn)分之一電子天平，美國(guó)梅特勒公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；渦漩振蕩儀，德國(guó)IKA公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）；流動(dòng)相：甲醇，含0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫。梯度洗脫參數(shù)見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+源）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式：正離子模式掃描[29]；氣簾氣（CUR）：30 μL/min；離子化電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；噴霧器（GS1）：50 psi；輔助加熱器（GS2）：50 psi；噴撞氣（CAD）：9 psi；碰撞電池入口電壓（EP）：10 V；碰撞電池出口電壓（CXP）：13 V；倍增光電壓（CEM）：2100 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 馬兜鈴酸A、B、C、D質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 The MS condition for determination of four aristolochic acids

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D各0.0050 g（精確至0.00001 g），置于100.00 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為50.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確量取0.20 mL馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D濃度為1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 ℃保存。

（3）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取4種馬兜鈴酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液4.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μL，分別用70%甲醇水定容至1.00 mL，配制得到4.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/L系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。臨用前配制。

1.2.4 樣品溶液的制備

（1）液體試樣：選取10支混合均勻，精密量取1.00 mL液，置于50.00 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲30 min，放冷，用70%甲醇定容至刻度，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

（2）固體試樣：取10片或者適量研磨成粉狀后，精密稱取1.00 g試樣，置于50 mL容量瓶中，加入40 mL 70%甲醇，超聲30 min，放冷，用70%甲醇定容至刻度，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇

馬兜鈴酸A、B、C、D是一類硝基菲羧酸，結(jié)構(gòu)類似，為了獲得四種目標(biāo)物最好的分離分析效果，考察了甲醇-0.1甲酸水溶液、乙腈-0.1甲酸水溶液以及二氯甲烷-0.1甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，甲醇和乙腈由于極性大，具有較好分離效果；而二氯甲烷極性較小，無(wú)法有效洗脫吸附在色譜柱上的待測(cè)物。但是，考慮到環(huán)境污染，人員健康問(wèn)題，最后選用了甲醇作為流動(dòng)相，對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 色譜柱的選擇

選用了Welch AQ-C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）、Phenomenex Luna NH2（4.6 mm×100 mm，3 μm）、Phenomenex KinetexC18（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）等常用的4種液相色譜柱。通過(guò)對(duì)四種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析發(fā)現(xiàn)，NH2柱（圖1a）對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)的保留較強(qiáng)，無(wú)法達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果；AQ-C18（圖1b）柱及C18（圖1c）對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)的分離能力較差；T3（圖1d）對(duì)4馬兜鈴酸類物質(zhì)的分離效果較理想，故選用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）作為四種物質(zhì)的分離色譜柱。

2.3 線性關(guān)系

將1.2.3中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液在1.2.1與1.2.2項(xiàng)條件下測(cè)定（圖2、圖3），出峰的先后順序依次是馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸A，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，馬兜鈴酸A、B、C、D的線性方程分別為：y=0.2133x+0.2227（R2=0.999）；y=0.0916x+ 0.0615（R2=0.9981）；y=0.0575x+0.0245（R2=0.999）；y=0.0081x-0.0079（R2=0.9967）。四種物質(zhì)在4.00～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.995以上。并以信噪比（S/N=3）來(lái)確定馬兜鈴酸A、B、C、D最低檢出限，分別為3.00、5.00、25.00、20.00 μg/kg。

2.4 精密度

將濃度為40 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3。測(cè)得馬兜鈴酸A、B、C、D的峰面積RSD分別為1.41%、1.54%、1.73%、1.26%，表明該儀器精密度良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 The results of precision (n=6)

2.5 穩(wěn)定性

取細(xì)辛粉末適量，按1.2.4固體試樣制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定[30]，記錄色譜峰面積，并計(jì)算各組分的含量。結(jié)果如表4，馬兜鈴酸B和馬兜鈴酸C均未檢出，馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D的RSD值分別為1.22%、0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 The results of stability (n=6)

2.6 重復(fù)性

取同一批次細(xì)辛藥材磨成粉末，精密稱取6份，按按1.2.4固體試樣制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，并計(jì)算各組分的含量。結(jié)果如表5，馬兜鈴酸B和馬兜鈴酸C均未檢出，馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D的RSD值分別為1.42%、0.31%，表明該方法重復(fù)性好。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 The results of repeatability (n=6)

2.7 加樣回收

取同一批次細(xì)辛藥材磨成粉末，精密稱取9份樣品，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成高、中、低的加標(biāo)溶液，按1.2.4制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，其中馬兜鈴酸D在1.2.4的基礎(chǔ)上再稀釋10倍進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明，四種物質(zhì)的3個(gè)不同濃度加標(biāo)回收率均在91.97%～106.40%之間，RSD均小于4.24%，可滿足檢測(cè)要求。

表6 加標(biāo)回收率（n=9）Table 6 The results of recovery (n=9)

2.8 樣品測(cè)定

精密稱取適量樣品，按1.2.4制備供試品溶液，用外表法計(jì)算四種物質(zhì)的含量，結(jié)果見表7。從結(jié)果可以看出含有細(xì)辛及細(xì)辛類中成藥中除了含有馬兜鈴酸A還有一定量的馬兜鈴酸D，且都不含有馬兜鈴酸B及馬兜鈴酸C，細(xì)辛中成藥中馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D兩種成分的含量均低于細(xì)辛原材料。

表7 9種中藥材的檢測(cè)結(jié)果Table 7 Test results of 9 kinds of Chinese medicinal materials samples (ˉx±s, μg/kg, n=3)

3 結(jié)論

3.1 本文建立里了超高相液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，用于同時(shí)測(cè)定樣品中四種馬兜鈴酸（馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D）含量，在4～100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（r≥0.995），檢出限分別為3.00 μg/kg、5.00 μg/kg、25.00 μg/kg、20.00 μg/kg，加樣回收率在91.97%～106.40%之間，RSD≤4.24%（n=9）。該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度和精密度高，線性范圍廣，適用于樣品中四種馬兜鈴酸的同時(shí)檢測(cè)。并用該方法對(duì)目前市售的細(xì)辛及8個(gè)含細(xì)辛中成藥進(jìn)行了這四個(gè)成分的含量測(cè)定，細(xì)辛及8個(gè)含細(xì)辛的中成藥均含有不同程度的馬兜鈴酸A或馬兜鈴酸D，均未檢出馬兜鈴酸B和馬兜鈴酸C。同時(shí)細(xì)辛中成藥中馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D的含量均低于細(xì)辛藥材，且細(xì)辛及細(xì)辛中成藥中馬兜鈴酸A的含量均低于《中國(guó)藥典》規(guī)定的每克含量不得超過(guò)0.001%，符合安全使用標(biāo)準(zhǔn)。2007年，李偉等[31]對(duì)細(xì)辛及養(yǎng)血清腦顆粒中馬兜鈴酸A進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)細(xì)辛中含有微量的馬兜鈴酸A，而以細(xì)辛為原料的養(yǎng)血清腦顆粒中卻沒有檢測(cè)到馬兜鈴酸A，因?yàn)橹谐伤幵谂湮楹吞崛≈苿┻^(guò)程中具有減毒增效的作用。2017年，李功輝等[32]采用UPLC-QQQ-MS對(duì)不同藥材中的馬兜鈴酸A進(jìn)行測(cè)定，其中細(xì)辛類藥材中馬兜鈴酸A的含量均小于10 μg/g。

3.2 目前從馬兜鈴科植物中提取的含馬兜鈴酸類結(jié)果的化合物有160多個(gè)，最基本的結(jié)構(gòu)有馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D四種，在細(xì)辛及含細(xì)辛的中成藥中除了檢出馬兜鈴酸A外，還含有一定量的馬兜鈴酸D。2018年，丁慧等[33]采用UPLC-MS/MS對(duì)天仙藤、青木香、馬兜鈴、尋骨風(fēng)、朱砂蓮五種藥材中的四種馬兜鈴酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示四種物質(zhì)在五種藥材中的含量有較大的差別。這提示我們?cè)谘芯考?xì)辛類中藥材在食用及藥用的安全性時(shí)，不能只關(guān)注馬兜鈴酸A，還應(yīng)該關(guān)注馬兜鈴酸D。