沙棘葉黃酮的提取純化及組成分析

郭建峰，郄浩然，王芳*，王海賓，劉子超，胡培毅，郭仕偉

（1.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）（2.山西省沙棘藥茶聯(lián)合創(chuàng)新研發(fā)基地，山西太原 030051）

中國沙棘（Hippophae rhamnoidessubsp.sinensisRousi），是胡頹子科沙棘屬的沙棘亞種，屬于落葉灌木或小喬木，我國沙棘資源豐富、分布廣泛，主要分布于山西、陜西、甘肅、青海等地[1]。沙棘作為一種藥食同源植物，富含豐富的糖類、蛋白質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)成分，及茶多酚、黃酮、Vc、原花青素、5-羥色胺等生物活性物質(zhì)[2,3]。而沙棘葉中黃酮含量高于沙棘的其他部位，具有極高的利用價(jià)值[4]。研究表明，沙棘葉中蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、兒茶素等黃酮類物質(zhì)具有抗血栓[5]、降血脂與血糖[6-8]、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力[9]、消炎抑菌[10]等功效[11]。沙棘葉作為沙棘產(chǎn)品開發(fā)的一部分，合理利用沙棘資源，提高其附加價(jià)值，具有廣闊的發(fā)展前景。

目前，黃酮的提取技術(shù)有：有機(jī)溶劑提取[12]、微波輔助[13]、超聲波輔助[14]、超臨界萃取法、酶法[15]等。微波輔助技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比，具備工藝簡(jiǎn)單、提取速度快、溶劑用量少、得率較高等優(yōu)勢(shì)，越來越多地用于植物提取[16,17]。黃酮的純化方法包括堿溶酸沉法[18]、大孔樹脂、離子交換樹脂等。近年來，關(guān)于沙棘葉黃酮提取工藝已有不少相關(guān)報(bào)道[19]，但少有對(duì)黃酮提取物純度及成分的檢測(cè)。根據(jù)各類植物本身黃酮含量的不同及提取方法的差異，總黃酮得率在0.9%～45%，總黃酮含量在4%～24%范圍內(nèi)[20-27]。本研究采用微波輔助乙醇提取及堿溶酸沉法，同時(shí)比較離子交換樹脂和大孔樹脂AB-8兩種純化方法對(duì)沙棘葉黃酮含量的影響，并通過超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-MS）對(duì)沙棘葉提取物進(jìn)行成分分析，建立了一種方便、可靠地提取和純化沙棘葉黃酮的方法，進(jìn)一步提高黃酮純度，通過考察方法的經(jīng)濟(jì)性，為工業(yè)化生產(chǎn)高純度沙棘葉黃酮提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

中國沙棘葉，采自山西省宋家溝的小果沙棘林，選擇新鮮、無病蟲害的新鮮沙棘葉，自然晾干后粉碎制成沙棘葉粉。

硝酸鋁，亞硝酸鈉，無水乙醇，氫氧化鈉，鹽酸，以上試劑采購于西隆科學(xué)股份有限公司（AR，99%）；標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁、沒食子酸（HPLC≥99%），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器設(shè)備

ReadMax1900型光吸收全波長酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；TG-18W臺(tái)式離心機(jī)，山東博科科學(xué)有限公司。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜（Vanquish，UPLC，Thermo，USA）和高分辨質(zhì)譜（Q Exactive，Thermo，USA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微波提取及堿溶酸沉單因素試驗(yàn)

稱取80目沙棘葉粉，分別按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的料液比加入70% EtOH用500 W微波5 min輔助提取3次，過濾，合并濾液后減壓濃縮，得到濃縮液。

濃縮液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.00～11.00并于75 ℃～95 ℃水浴20 min，反應(yīng)結(jié)束后立即冷卻，并用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.00～6.00，4 ℃靜置24 h后，4000 r/min離心15 min，沉淀冷凍干燥后得到沙棘葉黃酮提取物。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提純工藝

結(jié)合單因素試驗(yàn)，選擇A（料液比）、B（堿溶溫度）、C（堿溶pH）、D（酸沉pH）進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化，以總黃酮得率、提取物中黃酮含量為響應(yīng)值，根據(jù) Box-Behnken原理，運(yùn)用Design-Expert.V 12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of combined test of Box-Behnken

1.2.3 大孔樹脂與離子交換樹脂精制方法比較

在純化中，比較大孔樹脂AB-8和離子交換樹脂兩種方法。參考文獻(xiàn)對(duì)大孔樹脂AB-8（2.5 cm×60 cm）方法稍作修改[28,29]，提取液以1 BV/h上樣，吸附完全后，用3倍體積蒸餾水洗去多糖和蛋白質(zhì)，再以1.5 BV/h利用70%乙醇洗脫，洗脫液凍干得沙棘葉黃酮提取物。參考文獻(xiàn)離子交換樹脂（3.0 cm×30 cm）方法進(jìn)行改進(jìn)[30]，堿溶酸沉后沙棘葉黃酮提取物先調(diào)節(jié)pH為6～7，再以1 mL/min進(jìn)行上樣，吸附完全得到除鹽液，除鹽液凍干得沙棘葉黃酮提取物。

1.2.4 成分測(cè)定

1.2.4.1 總黃酮的測(cè)定

參考《T/ISAS 001-2019 沙棘黃酮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行改進(jìn)[31]。配置0.3 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，在96孔板中分別稀釋成梯度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入40 μL的10% NaNO2和20% Al(NO3)3·9H2O的預(yù)混液，震蕩均勻放置6 min，再加入100 μL 4 mol/L的NaOH，搖勻，室溫放置15 min，于510 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0293x+0.0319，R2=0.9909。取1 mL稀釋液，按上述步驟操作，得出總黃酮得率（ρ）、提取物中黃酮含量（ω）。

式中：

ρ——總黃酮得率，%；

C0——沙棘葉提取液中總黃酮的濃度，mg/mL；

V0——提取液的體積，mL；

C1——本工藝的提取液中黃酮的濃度，mg/mL；

d——稀釋倍數(shù)（通常為1 mL稀釋成100 mL，則其稀釋倍數(shù)為100）。

ω——提取物中黃酮含量，%；

C2——干物質(zhì)中黃酮的濃度，mg/mL；

V2——溶解干物質(zhì)所用溶劑的體積，mL；

m——沙棘葉黃酮產(chǎn)品的質(zhì)量，g。

1.2.4.2 多酚含量的測(cè)定

參考《GB/T 8313-2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》進(jìn)行改進(jìn)[32]。配置0.25 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在96孔板中分別稀釋成不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入40 μL 30%的福林酚，在3～8 min內(nèi)加入50 μL的15% Na2CO3，震蕩搖勻，超聲處理8 min，于765 nm測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.3642x+0.0326，R2=0.9913。取1 mL稀釋液，按上述步驟操作。按照公式計(jì)算提取物中多酚含量c：

土壤中以下幾種養(yǎng)分均處于虧缺狀態(tài),其缺乏程度為NH4+-N>S>Zn>P>K>Mn>Fe>B,其中的NH4+-N、S、Zn均有30%以上低于臨界值,在推薦施肥應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充,以防植物缺素癥的發(fā)生,而其余的缺乏元素可通過生產(chǎn)中逐步增加肥料進(jìn)行矯正。臺(tái)子村N素為作物生長的主要限制因子,P、K和有機(jī)質(zhì)均處于中等水平，土壤有效鈣含量均處于高水平梯度,土壤有效鎂含量大多處于中等以上水平,存在少量的土壤低鎂區(qū);缺硫土壤所占比例占絕大多數(shù)。

式中：

c——多酚含量，%；

C——干物質(zhì)中多酚的濃度，mg/mL；

V——溶解干物質(zhì)所用溶劑的體積，mL；

m——沙棘葉黃酮產(chǎn)品的質(zhì)量，g；

d——稀釋倍數(shù)（通常為1 mL稀釋成100 mL，則其稀釋倍數(shù)為100）。

1.2.4.3 UPLC-Q-MS分析黃酮成分

參考文獻(xiàn)[33,34]，對(duì)UPLC-Q-MS分析沙棘葉黃酮成分的程序略作修改，具體參數(shù)如下：

UPLC參數(shù)條件：色譜柱Waters HSS T3（50×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為超純水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；洗脫梯度：0～2.0 min 90% A，2.0～9.0 min 90%～40% A，9.0～12.0 min 40%～90% A。

MS參數(shù)條件：電噴霧離子源（ESI），單離子檢測(cè)（SIM）模式，負(fù)離子掃描。鞘氣40 arb；輔助氣10 arb；離子噴霧電壓-2800 V；溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 2019處理數(shù)據(jù)并作圖，并分析顯著性差異，p<0.05為差異顯著；p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對(duì)沙棘葉黃酮的影響

從圖1可知，料液比、堿溶溫度、堿溶pH、酸沉pH對(duì)沙棘葉總黃酮得率、提取物中黃酮含量的變化。

2.1.1 料液比

由圖1a可看出，沙棘葉黃酮含量與總黃酮得率隨著料液比的增大逐漸增大，當(dāng)料液比為1:30時(shí)，兩者達(dá)到最高值，隨之不再增加。這可能是由于乙醇溶劑的增大，造成沙棘葉中其他的活性成分或雜質(zhì)溶出；而料液比過少，則沙棘葉粉未完全潤濕，造成黃酮不能完全溶出，這些都將導(dǎo)致黃酮含量的降低[35]。

2.1.2 堿溶溫度

由圖1b可看出，當(dāng)溫度小于90 ℃時(shí)，隨著溫度的提高，沙棘葉黃酮含量與總黃酮得率呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)，兩者均達(dá)到最高值。這可能是由于溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，破壞了細(xì)胞壁，增強(qiáng)了乙醇溶出黃酮的能力；而溫度過高，則破壞黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致沙棘葉中生物活性物質(zhì)的變化[36,37]。

2.1.3 堿溶pH

pH值是堿溶過程中一個(gè)重要因素。由圖1c可知，在堿溶過程中，pH 10.0時(shí)效果最好，在此之前，黃酮含量和總黃酮得率也隨之增大，這是可能因?yàn)槟鞠菟?、山奈酚、二氫楊梅素等含有酚羥基、顯弱酸性的黃酮類物質(zhì)，與NaOH生成易溶于水的鹽，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的黃酮溶解于乙醇中。但pH 10.0之后，黃酮含量和得率隨著pH增大而降低，這可能是由于pH過高，導(dǎo)致黃酮C6-C3-C6的母核被破壞，黃酮難溶解于乙醇。

2.1.4 酸沉pH

由圖1d可知，當(dāng)酸沉pH<3.0時(shí)，黃酮含量和總黃酮得率會(huì)隨著酸沉pH增大而增大，這是因?yàn)辄S酮母核中吡喃環(huán)上的氧原子呈堿性，溶液酸性過強(qiáng)則易生成佯鹽，導(dǎo)致黃酮不能全部析出[27]。當(dāng)pH>3.0時(shí)，總黃酮得率隨著酸沉pH增大而降低；這是因?yàn)椴糠殖嗜跛嵝缘狞S酮類物質(zhì)，難以在強(qiáng)酸性溶液中形成沉淀。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提純工藝 2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化工藝方案及結(jié)果如表2所示。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

2.2.2 回歸方程建立與方差分析

采用Design-Expert12軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以沙棘葉總黃酮得率（Y1）、黃酮含量（Y2）為響應(yīng)值，得到各因子的二次回歸擬合方程為：

由表3可知，總黃酮得率（Y1）p<0.01表示該模型顯著，在這種情況下，C、AB、BC、BD、B2是重要的模型項(xiàng)；其R2=0.7825說明有78.25%的變差能夠由該模型解釋；這些數(shù)據(jù)均表示該模型能解釋響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好。由表3可知，各因素對(duì)總黃酮得率的影響：堿溶pH>堿溶溫度>堿溶pH>料液比。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

黃酮含量（Y2）p<0.01表示該模型顯著，在這種情況下，A、D、AC、AD、CD、A2、B2是重要的模型項(xiàng)；其R2=0.8256說明有82.56%的變差能夠由該模型解釋；這些數(shù)據(jù)均表示該模型能解釋響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好。由表3可知，得到各因素對(duì)提取物中黃酮含量的影響：料液比>酸沉pH>堿溶溫度>堿溶pH。

2.2.3 各因素對(duì)總黃酮得率響應(yīng)面交互分析

采用Design-Expert 12軟件對(duì)料液比、堿溶溫度、堿溶pH、酸沉pH之間交互作用的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

從圖2a可看出，料液比與堿溶溫度的3D圖走勢(shì)較陡峭、等高線密集且呈現(xiàn)橢圓形，說明兩者的交互作用較強(qiáng)。同理，圖2d和2e中，堿溶pH、酸沉pH與堿溶溫度之間的交互作用較強(qiáng)。而圖2b和2c中堿溶pH、酸沉pH與料液比的走勢(shì)平緩，等高線稀疏，說明兩兩自變量之間交互作用不明顯。同理，圖2f中堿溶pH與酸沉pH之間的交互作用不明顯。

2.2.4 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

經(jīng)過Design-Expert 12對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，沙棘葉黃酮提純的最佳工藝為:料液比1:29.73（g/mL）、堿溶溫度92.38 ℃、堿溶pH 9.53、酸沉pH 2.74。在此條件下模型預(yù)測(cè)沙棘葉總黃酮得率為69.04%、黃酮含量為25.64%。

考慮實(shí)際情況，對(duì)沙棘葉黃酮最佳的工藝進(jìn)行修正：料液比1:30（g/mL）、堿溶溫度92 ℃、堿溶pH 9.50、酸沉pH 2.70。按照此條件進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際總黃酮得率為70.98%，RSD為1.19%，與模型預(yù)測(cè)值接近，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，說明響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘葉黃酮工藝條件可行且可靠。

2.3 大孔樹脂與離子交換樹脂精制方法比較

由圖3可知，離子交換樹脂純化后沙棘葉黃酮與大孔樹脂AB-8相比，各方面數(shù)據(jù)均顯著提高，其中總黃酮得率、黃酮含量、多酚含量較大孔樹脂AB-8分別增加了1.43倍、1.74倍、1.60倍。這可能是在堿溶酸沉中，與糖苷鍵結(jié)合緊密的部分黃酮被釋放出來，使溶液中游離的黃酮含量增多，通過離子交換樹脂后，將其他雜質(zhì)包括Na+、Cl-等離子洗脫除去，得到純度更高的沙棘葉黃酮。因此，本研究選擇離子交換樹脂對(duì)沙棘葉黃酮提取物進(jìn)行純化。

從經(jīng)濟(jì)角度考慮，在純化過程中，大孔樹脂AB-8需要大量的蒸餾水進(jìn)行洗脫和除雜，造成更多的廢水，使得工藝復(fù)雜，增加廢水處理成本。而離子交換樹脂則是將溶液中Na+、Cl-通過離子交換與樹脂結(jié)合，使樣品中的鹽度降低，達(dá)到除鹽和節(jié)約成本的目的。

2.4 UPLC-Q-MS成分分析

采用UPLC-Q-MS對(duì)沙棘葉黃酮提取物進(jìn)行定量分析，16種類黃酮混標(biāo)與樣品的總離子流圖（TIC）如圖4所示。對(duì)比混標(biāo)，本研究共提取出15種類黃酮物質(zhì)，除柚皮苷查爾酮未檢出外，其他物質(zhì)均檢出包括蘆丁、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷、槲皮素、兒茶素、二氫楊梅素等。由表4可知，蘆丁占40.89%、槲皮苷（槲皮素-3-鼠李糖苷）占39.97%、槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷占7.67%、槲皮素占1.03%，兩類成分共占總黃酮的89.67%。

表4 沙棘葉提取物中類黃酮化合物信息Table 4 Information of flavonoid compounds in sea buckthorn leaf extract

研究表明，沙棘葉黃酮是槲皮素、異鼠李素、山奈酚及楊梅素等黃酮苷元與鼠李糖、葡萄糖及半乳糖等糖基結(jié)合形成[38]，即槲皮素-3,7-二-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷等[39-44]。而本研究檢出蘆丁、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷、槲皮素等物質(zhì)，可能由于本工藝使其中糖苷鍵或糖糖鍵斷裂，形成了更簡(jiǎn)單的黃酮類物質(zhì)。

與市面上銀杏葉中黃酮提取物對(duì)比，本研究的沙棘葉黃酮中未含有銀杏葉黃酮的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1→2)-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芫花素等復(fù)雜黃酮苷元，較銀杏葉黃酮更適合進(jìn)行黃酮物質(zhì)的研究與開發(fā)[38,45-48]。

因此，本研究認(rèn)為堿溶酸沉法和離子交換樹脂兩者結(jié)合的方法可以較好地提取出蘆丁和槲皮素類物質(zhì)，為沙棘葉黃酮的開發(fā)利用提供參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究采用微波輔助提取沙棘葉黃酮，結(jié)合堿溶酸沉和離子交換兩個(gè)純化步驟，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)考察了料液比、堿溶溫度、堿溶pH、酸沉pH等因素對(duì)沙棘葉中總黃酮得率、黃酮含量的影響。確定了最佳工藝為：料液比1:30（g/mL）、堿溶溫度92 ℃、pH 9.50、酸沉pH 2.70，在此條件下，沙棘葉總黃酮得率為70.98%，黃酮含量為42.11%。綜合比對(duì)，本研究中所采用的方法不僅很大程度上提高了黃酮的含量，還涉及以往相關(guān)研究中并未提及的多酚含量及黃酮物質(zhì)的種類。同時(shí)，該方法具有操作簡(jiǎn)單、提取速度快、耗能低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)沙棘葉黃酮具有一定的參考價(jià)值。