金線蓮苷的硅膠柱層析分離

苑歆，石帆，侯軼，賴敏婷，胡松青*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640） （2.華南理工大學輕工科學與工程學院，廣東廣州 510640）（3.廣東雁歸來養(yǎng)生產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東梅州 514700）

金線蓮[Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.] 又名金線蘭，是一種珍貴的多年生蘭科開唇蘭屬植物，主要分布于中國、日本、泰國以及其他東南亞國家和地區(qū)，在我國福建、臺灣和廣東等地人們的日常生活中具有傳統(tǒng)食用習慣，屬于地方特色食品。金線蓮作為一種重要的經(jīng)濟作物，不僅具有極高的觀賞價值，還具有廣泛的藥用價值。金線蓮在我國被視為傳統(tǒng)珍稀的中藥材，有清熱涼血、平肝、祛濕、解毒等功效[1,2]，民間譽之為“金草”、“神藥”、“藥王”。研究表明，金線蓮具有降血壓[3]、降血糖[4]、抗腫瘤[5]、保肝[6]等多種生理活性，且毒副作用低，使用安全，是治療糖尿病、高血脂、肝炎等疾病重要的潛在藥物[7]。它的活性成分豐富，包括內(nèi)酯苷類、黃酮類、多糖類、三萜類等[8]。

金線蓮苷（kinsenoside），化學名3R-β-D-吡喃葡萄糖氧基-γ-丁內(nèi)酯，是金線蓮獨有的特質(zhì)性成分[9]，含量為6.37%～22.66%[10]。據(jù)文獻報道，金線蓮苷具有降血糖[11]、降脂[12]、保肝護肝[13-16]、抑制炎癥[17,18]等多種藥理活性。目前，從金線蓮中分離純化金線蓮苷普遍處于實驗室初步研究階段，常見流程包括溶劑萃取、大孔樹脂吸附分離、制備色譜純化等。Liu等[19]采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對金線蓮苷乙醇提取物（1314 g）進行萃取，得到的正丁醇萃取物經(jīng)HPD 100型大孔樹脂和硅膠柱層析分離后，最終得到800 mg金線蓮苷。整個分離純化流程長且步驟繁瑣，金線蓮苷得率低，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

本課題組前期以深度共熔溶劑為提取溶劑結(jié)合柱提取法得到高含量的金線蓮苷粗提液，但粗提液中仍含有多酚、糖類等雜質(zhì)。因此，有必要對粗提液采取進一步的分離純化以獲得高純度的金線蓮苷。本文探討并比較了大孔樹脂法、硅膠柱層析法對金線蓮苷分離純化的效果，建立了一種簡單高效的金線蓮苷分離純化流程，為金線蓮苷的分離制備工藝奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線蓮干品由廣東梅州雁歸來養(yǎng)生產(chǎn)業(yè)有限公司惠贈；薄層層析硅膠板，青島海洋化工有限公司；柱層析硅膠，上海源葉生物公司；大孔樹脂NKA-9、AB-8、D101、DM130，上海源葉生物科技有限公司；乙酸乙酯，上海泰坦科技公司；乙醇，天津百世化工有限公司；氯仿、甲醇、冰醋酸，天津大茂化學試劑廠；高錳酸鉀、碳酸鉀、氫氧化鈉，廣州化學試劑廠；二硝基苯甲酸，上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鉀，國藥集團化學試劑公司；茚三酮，上海伯奧生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

BSZ-160F電腦自動部份收集器，上海精科實業(yè)有限公司；恒流泵，保定雷弗流體科技有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；Agilent 1260Infinity II高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；Agilent 1260 Infinity II 蒸發(fā)光散射檢測器，美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金線蓮苷的提取

干燥的金線蓮材料經(jīng)粉碎機粉碎，過篩，收集物料粒徑在250～830 μm之間的金線蓮粉末，準確稱取5 g的金線蓮粉末，加入20 mL的由氯化膽堿和蘋果酸按照1:1摩爾比組成的深度共熔溶劑（含水量40%），室溫下靜置3 h，以徑高比1:10裝入玻璃層析柱，使用提取溶劑以40 mL/h的流速進行洗脫，收集前60 mL洗脫液，即為金線蓮苷粗提液。

1.3.2 金線蓮苷的定性分析

采用薄層層析硅膠對金線蓮苷進行快速定性分析。在距離層析板底部約1 cm處，吸取樣液點樣，樣點直徑不超過0.5 cm，吹干樣點后放入裝有展開劑（乙酸乙酯:乙醇:冰醋酸=5:5:0.2，V/V/V）的層析缸中，當展開劑前端距離層析板頂部1 cm時，完成層析。用kedde試劑進行顯色，計算金線蓮苷的Rf值。

1.3.3 金線蓮苷的定量分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（2:98，V/V），等度洗脫，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量為10 μL。蒸發(fā)光散射檢測器霧化溫度和漂移管溫度均為60 ℃，載體為氮氣，流速1.7 L/min。

1.3.3.2 標準曲線及線性范圍

將金線蓮苷標準品用超純水配置為濃度分別為59.17、118.33、177.50、236.66、295.83、591.66 μg/mL的標準系列溶液，按照色譜條件進樣，記錄峰面積。以峰面積積分值的對數(shù)值（log A）為縱坐標，以標準品溶液濃度的對數(shù)值（log C）為橫坐標，繪制標準曲線。如圖1所示。經(jīng)計算，金線蓮苷含量的回歸方程為y=1.6639x-1.2298（R2=0.9996），在59.17～591.66 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方程可用于后續(xù)研究中金線蓮苷含量的測定。

1.3.4 金線蓮苷的穩(wěn)定性研究

將待測液置于冰箱冷藏室（4 ℃）中，分別在0、2、4、6和12 h時通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD），記錄峰面積并計算RSD值。

1.3.5 大孔樹脂分離金線蓮苷的研究

1.3.5.1 大孔吸附樹脂的篩選

本實驗中所使用的4種大孔樹脂的類型和性質(zhì)如表1所示，稱取5 g預(yù)處理過的大孔樹脂于錐形瓶中，加入20 mL金線蓮苷粗提液，室溫下于搖床中吸附24 h后過濾，測定濾液中金線蓮苷濃度，計算吸附量。大孔樹脂過濾后，加入20 mL蒸餾水，振搖12 h以充分洗去深度共熔溶劑，隨后再加入20 mL 80%乙醇溶液，振搖12 h后，過濾，測定解析液中金線蓮苷的濃度，計算解析率。

表1 不同類型大孔樹脂的性質(zhì)Table 1 Properties of different types of macroporous resins

1.3.5.2 DM130型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附曲線

稱取適量DM130型濕樹脂填充入直徑為2 cm的玻璃層析柱中，填充高度20 cm，加入濃度為1 mg/mL的金線蓮苷提取液，以2 BV/h的流速上樣，分別測定流出液在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 BV時金線蓮苷的濃度。以流出液體積為橫坐標，對應(yīng)的金線蓮苷濃度為縱坐標，繪制DM130型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附曲線。

1.3.6 硅膠柱層析分離金線蓮苷的研究

1.3.6.1 洗脫溶劑比例對金線蓮苷分離的影響

分別選擇不同的展開劑體系對金線蓮苷標準品和分離純化中間產(chǎn)物樣品進行展開，根據(jù)樣品在薄層硅膠板上的顯色斑點的比移值Rf值和拖尾情況選擇最佳展開劑，從而確定最佳洗脫溶劑，Rf值的計算公式如下：

式中：

Rf——比移值；

a——原點到斑點的距離；

b——原點到展開劑前沿的距離。

1.3.6.2 上樣量對金線蓮苷分離的影響

根據(jù)單因素實驗確定了最佳洗脫溶劑比例，現(xiàn)考察金線蓮苷的上樣量對金線蓮苷分離純化的影響。將干燥的硅膠采用濕法裝柱法填入直徑為2 cm的玻璃層析柱，裝柱徑高比為1:10，分別稱取上樣量0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 g加載到硅膠床層頂面，設(shè)置洗脫流速為1 mL/min，采用自動部分收集器以10 mL/管收集洗脫液，將收集的洗脫液進行薄層硅膠層析，將顯示含有金線蓮苷顯色反應(yīng)的收集管經(jīng)真空干燥（50 ℃）除去有機溶劑后，用蒸餾水復(fù)溶，通過HPLC-ELSD檢測并計算金線蓮苷的回收率。

1.3.6.3 洗脫速率對金線蓮苷分離的影響

根據(jù)上述實驗確定了最佳洗脫溶劑比例和上樣量?，F(xiàn)考察洗脫速率對金線蓮苷分離純化的影響。將干燥的硅膠采用濕法裝柱法填入直徑為2 cm的玻璃層析柱，裝柱徑高比為1:10，稱取金線蓮苷粗品0.6 g加載到硅膠床層頂面，設(shè)置洗脫速率分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL/min。采用自動部分收集器以10 mL/管收集洗脫液，將收集的洗脫液進行薄層硅膠層析，將顯示含有金線蓮苷顯色反應(yīng)的收集管經(jīng)真空干燥（50 ℃）除去有機溶劑后，用蒸餾水復(fù)溶，通過HPLC-ELSD檢測并計算金線蓮苷的回收率。

1.3.7 金線蓮苷的分離制備

采用Agilent 1260半制備型高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器對金線蓮苷進行分離制備。半制備色譜柱為YMC-Pack ODS-A（250×10 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（2:98，V/V），等度洗脫，流速2.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量為100 μL。ELSD霧化溫度和漂移管溫度均為60 ℃，載體為氮氣，流速1.7 L/min。收集樣品峰，真空冷凍干燥后得到金線蓮苷純品。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均為三組平行，采用SPSS 22對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性水平為p<0.05，不同的字母表示具有顯著差異，采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 金線蓮苷的定性分析

薄層層析硅膠法可用于金線蓮苷分離純化過程中間產(chǎn)物樣品的快速檢測。如圖2所示，樣品1為金線蓮苷標準品，樣品2為金線蓮提取液，經(jīng)kedde試劑顯色均為紫色斑點，計算兩者的Rf值均為0.51。該方法可根據(jù)薄層層析硅膠板上斑點的位置及大小實現(xiàn)樣品中金線蓮苷的快速檢測。

2.2 金線蓮苷的穩(wěn)定性研究

隨著儲存時間的延長，金線蓮苷可能發(fā)生自降解或其他反應(yīng)，導(dǎo)致其含量降低。實驗結(jié)果如表2所示，在4 ℃條件下，0～12 h內(nèi)金線蓮苷的穩(wěn)定性良好。故金線蓮苷樣品可在4 ℃下，12 h內(nèi)完成進樣測定。

表2 金線蓮苷的穩(wěn)定性研究Table 2 Study on the stability of kinsenoside

2.3 大孔樹脂分離金線蓮苷的研究

2.3.1 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂對化合物的分離受樹脂極性、比表面積和孔徑大小等多種因素影響[20]，其性能主要體現(xiàn)在吸附和解吸兩個方面，一般來說，吸附量越大，解吸越容易，則大孔樹脂的性能越好。本實驗通過比較吸附量和解吸率兩個參數(shù)來選擇適宜的大孔樹脂，用于金線蓮苷粗提液的分離精制。

4種不同型號大孔樹脂對金線蓮苷粗提液的靜態(tài)吸附效果及80%乙醇對各樹脂的解吸效果如圖3、4所示，四種大孔樹脂的吸附、解吸效果表現(xiàn)并不優(yōu)良，但DM130型大孔樹脂的吸附效果和解吸效果均優(yōu)于其他三種樹脂，其吸附量可達24.69 mg/g，解吸率為17.89%。原因可能是大孔樹脂對于目標化合物的吸附作用與樹脂的極性、孔徑比表面積和目標化合物之間形成的靜電作用力、氫鍵和尺寸共同作用的結(jié)果。因此，選擇DM130型大孔樹脂用于后續(xù)研究。

2.3.2 DM130型大孔樹脂動態(tài)吸附曲線

DM130型大孔樹脂對金線蓮苷的動態(tài)吸附曲線如圖5所示，當流出液體積由1 BV增至3 BV時，金線蓮苷的濃度由0.04 mg/mL迅速升至0.15 mg/mL，但當流出液體積逐步增至12 BV時，金線蓮苷濃度在0.12～0.16 mg/mL范圍內(nèi)波動，無明顯變化。故易知DM130型大孔吸附樹脂對金線蓮苷無選擇性吸附作用，分離效果較差，后續(xù)實驗選擇硅膠柱層析法用于金線蓮苷的分離。

2.4 硅膠柱層析分離金線蓮苷的研究

2.4.1 洗脫溶劑比例對金線蓮苷分離的影響

配制不同比例組分的洗脫溶劑進行實驗[21]，各種洗脫溶劑對金線蓮苷的分離結(jié)果如表3所示，前6種展開劑不含乙酸，斑點的拖尾現(xiàn)象比較嚴重，而后6種展開劑均加入了少量乙酸，斑點圓整清晰。拖尾嚴重的現(xiàn)象說明此種展開劑分離效果欠佳。雖然含有氯仿的洗脫溶劑體系分離效果較好，但其毒性較大，不適宜用于金線蓮苷的分離純化。7號和9號展開劑能使金線蓮苷展開充分，且Rf值在0.40～0.60之間比較合適，故本實驗選擇9號展開劑做硅膠柱分離的洗脫溶劑，洗脫溶劑乙酸乙酯/乙醇/乙酸比例為6:4:0.2（體積比）。

表3 洗脫溶劑比例對金線蓮苷分離的影響Table 3 Effect of eluting solvent ratio on the separation of kinsenoside

2.4.2 上樣量對金線蓮苷分離的影響

硅膠柱層析的分離效率會受到上樣量的影響[22]。分別稱取金線蓮苷粗品0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 g，探究上樣量對分離純化的影響，結(jié)果如圖6所示，在0.40～0.60 g的上樣量變化范圍內(nèi)，上樣量不斷增加，純化效果逐漸變好；當上樣量為0.60 g時，回收率最高可達69.12%，但當上樣量繼續(xù)增加時，純化效果逐漸變差，推測其原因可能為層析柱填料洗脫能力有限，已達到層析上限；當上樣量為0.30 g時，回收率也可達到60%左右，推測其在可洗脫樣品質(zhì)量范圍內(nèi)，金線蓮苷純化率與上樣量的關(guān)系為多極值型曲線。

2.4.3 洗脫速率對金線蓮苷分離的影響

硅膠柱的分離過程中，洗脫速率的影響是比較明顯的。洗脫速率過快，目標化合物在未被分離的情況下便被洗脫，分離效果不佳，而洗脫速率過慢，目標化合物可能會出現(xiàn)擴散現(xiàn)象，從而導(dǎo)致分離效率較低。本實驗選取了0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL/min五個流速點進行實驗，結(jié)果如圖7所示，在0.5～1.25 mL/min的流速范圍內(nèi)，隨著洗脫速率的不斷增大，金線蓮苷的回收率不斷增大；當流速為1.25 mL/min時，金線蓮苷的分離純化效果最佳，回收率最高可達79.29%；當流速繼續(xù)增大時，純化效果變差。

在乙酸乙酯/乙醇/乙酸比例為6:4:2（體積比）、上樣量為0.60 g、洗脫速率為1.25 mL/min的硅膠柱層析條件下獲得的硅膠柱層析洗脫組分，經(jīng)半制備型高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器進一步純化，在洗脫時間10 min時收集目標組分，真空冷凍干燥后得到金線蓮苷純品，純度大于99.00%。因此，硅膠柱層析法分離結(jié)合半制備型高效液相色譜制備得到的金線蓮苷純度較高，該方法切實有效。

3 結(jié)論

本實驗首先采用NKA-9、AB-8、D101、DM130四種大孔樹脂對金線蓮苷深度共熔溶劑粗提液進行分離，結(jié)果表明四種大孔樹脂分離效果較差，均不適用于金線蓮苷的分離。最終確定采用硅膠柱層析方法分離金線蓮苷，最佳條件為：洗脫溶劑比例為乙酸乙酯:乙醇:乙酸=6:4:0.2（V/V/V），上樣量0.60 g，洗脫速率1.25 mL/min，在此優(yōu)化條件下，采用半制備型高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器對金線蓮苷進行分離制備，可以獲取純度大于99.00%的金線蓮苷純品。本研究通過硅膠柱層析分離金線蓮苷并結(jié)合半制備型高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器對其進行制備，分離純化流程操作簡單高效，步驟少，純化效果佳，為金線蓮苷分離純化工藝的研究打下堅實基礎(chǔ)。