過氧化氫調(diào)控菜心采后木質(zhì)化的機(jī)理初探

王玲，陳銳雯，陳敏惠，葉明強(qiáng)，陳飛平，戚英偉，羅政，戴凡煒，吳繼軍，袁兆飛，陳于隴*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）（2.廣東全農(nóng)農(nóng)業(yè)科技投資有限公司，廣東東莞 523290）

菜心（Brassica campestrisL. ssp.ChinensisMakino），是華南地區(qū)栽培廣泛的莖、葉、花同食類蔬菜，富含豐富的Vc、氨基酸、黃酮類等營養(yǎng)物質(zhì)，深受消費(fèi)者青睞[1]。菜心采收時(shí)從基部切割，機(jī)械損傷嚴(yán)重，易造成采收后莖部失水、空心、木質(zhì)化等問題，加速采后菜心的品質(zhì)劣變，限制菜心的貯運(yùn)銷售。因此，研究菜心莖部衰老木質(zhì)化的機(jī)理，探索適宜的保鮮方法以延長采后菜心的貨架期亟待加強(qiáng)。目前，菜心采后品質(zhì)調(diào)控的保鮮報(bào)道主要通過預(yù)冷[2]、低溫貯藏[3]、化學(xué)保鮮[4]、氣調(diào)包裝[5]等對(duì)葉片黃化延緩效果，以及從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平探討菜心葉片貯藏期衰老黃化機(jī)理[6-9]。同時(shí)，部分研究注意到貯藏期菜心莖部硬度增加，發(fā)生空心、木質(zhì)化現(xiàn)象[10,11]，但并未對(duì)菜心采后莖木質(zhì)化等衰老問題進(jìn)一步的研究。因此，研究菜心采后莖部品質(zhì)劣變，尤其是木質(zhì)化、空心化等劣變衰老的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制對(duì)探索針對(duì)性的貯藏保鮮技術(shù)具有重要意義。

過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的重要組成之一，是在植物體內(nèi)參與脅迫應(yīng)答傳導(dǎo)、生理調(diào)節(jié)和激素信號(hào)等多代謝途徑的重要信號(hào)分子[12]。研究報(bào)道外源施用H2O2可形成氧化脅迫，激活植物體內(nèi)H2O2信號(hào)，可提高抗氧化和抗逆性[13,14]，例如1.0 μmol/L H2O2預(yù)處理的鋁敏感型黑豆幼苗，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性增加，SOD基因（Mg/Fe-SOD和Mn-SOD）的表達(dá)水平提高，提高對(duì)鋁的脅迫性[15]；水稻細(xì)胞-水稻白葉枯病菌互作體系，外源添加H2O2脅迫條件，顯著地誘導(dǎo)了過氧化氫酶（catalase，CAT）相關(guān)基因表達(dá)，活化H2O2降解途徑[16]。研究發(fā)現(xiàn)施用低濃度的H2O2可延長果蔬貯藏期，具備無污染、無殘留等優(yōu)勢(shì)[17]。利用外源H2O2處理“黃冠”梨研究發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L的H2O2抑制了多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性，不同程度提高了POD、SOD、CAT、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力[18]。真空滲透10 mmol/L H2O2結(jié)合冷激處理番茄，誘導(dǎo)的果實(shí)內(nèi)H2O2含量的升高和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的提高[19]，20 mmol/L H2O2處理香蕉，提高了SOD和POD活性，抑制CAT活性，H2O2在果皮中積累增加[20]，1.96 mmol/L H2O2處理降低了龍眼果皮CAT、SOD、APX等ROS清除酶活性[21,22]，0.1 mmol/L的H2O2浸泡草莓后，H2O2含量上升，CAT活性和APX活性下降[23]。以上研究結(jié)果表明，不同濃度H2O2處理對(duì)采后果蔬品質(zhì)影響作用不同，對(duì)果蔬貯藏期品質(zhì)變化具有重要的調(diào)控功能。此外，在菜心采后衰老研究中，Tan等[24]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理采后菜心延緩葉片衰老，其重要機(jī)制是由于抑制呼吸爆發(fā)氧化酶（respiratory burst oxidase homologue，Rboh）基因催化ROS產(chǎn)生，提高了ROS清除酶系統(tǒng)酶活性、上調(diào)抗壞血酸-谷胱甘肽代謝途徑（AsA-GSH）等，清除H2O2，該研究結(jié)果表明ROS含量變化及其調(diào)控機(jī)制在菜心采后衰老過程中具有重要作用。

植物組織木質(zhì)化是生長發(fā)育及衰老的重要生理現(xiàn)象之一。菜心薹莖的木質(zhì)化表現(xiàn)為薹莖硬度增加、空心等現(xiàn)象、極大地影響采后品質(zhì)及商品價(jià)值。木質(zhì)素的生物合成途徑已經(jīng)研究得比較清晰，包括苯丙烷類代謝、木質(zhì)素合成特異途徑，單體聚合過程，并且H2O2和O2參與此過程[25]。然而，果蔬采后木質(zhì)化進(jìn)程中H2O2對(duì)木質(zhì)素生物合成的具體調(diào)控研究尚缺乏詳細(xì)研究報(bào)道。本文主要研究了外源H2O2處理對(duì)菜心貯藏過程中呼吸速率、木質(zhì)素、內(nèi)源H2O2、木質(zhì)素合成酶活性及其生物合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的相對(duì)表達(dá)水平等變化情況，初步探討H2O2對(duì)菜心薹莖木質(zhì)化發(fā)生的影響及其調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步闡明H2O2調(diào)控菜薹木質(zhì)化機(jī)理并探索有效的、針對(duì)性的貯藏保鮮技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選取受廣大消費(fèi)者喜愛的嫩食性的寧夏菜心為研究材料，選取播種育苗后約60 d的新鮮菜心，在1～2 h內(nèi)快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)用菜心選取無機(jī)械損傷，單菜心長度、莖粗細(xì)均勻的新鮮菜心，存放于4 ℃預(yù)冷1～2 h備用，進(jìn)行后續(xù)保鮮實(shí)驗(yàn)研究。

主要試劑：上海源葉生物科技有限公司的甲硫氫酸（MET）、愈創(chuàng)木酚、氧化型輔酶Ⅱ、反式肉桂酸、肉桂酸（cinnamic acid）；南京建成生物工程研究所研發(fā)的H2O2試劑盒；南京奧多福尼生物科技有限公司的苯丙氨酸；天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒；湖南艾科瑞生物工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑，熒光定量PCR試劑等。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；水浴鍋，澳華儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技；便攜式二氧化碳檢測(cè)儀，中國上海本杉儀器設(shè)備有限公司；熒光定量PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)（上海）有限公司；多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將選取好的菜心分作兩組，一組作為對(duì)照組完全沒入清水（水溫20 ℃）中浸泡處理15 min，撈出；另一組菜心為處理組沒入5 mmol/L的H2O2水溶液15 min，撈出；然后晾干菜心表面水分，每500 g裝入PE袋包裝，放入4 ℃低溫貯藏。在預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中配制了0、5、15、20、25 mmol/L H2O2濃度處理菜心，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L H2O2處理能明顯導(dǎo)致菜心品質(zhì)劣變，木質(zhì)化程度加劇。為研究H2O2在木質(zhì)化品質(zhì)劣變的作用，因此在本實(shí)驗(yàn)中使用了5 mmol/L H2O2處理菜心。分別于0、3、6、9、12 d取樣，測(cè)定呼吸速率，取菜心從上往下數(shù)展開葉片第4片至6片葉之間莖部組織，液氮速凍，存-80 ℃冰箱待用。

1.3.2 呼吸速率測(cè)定

將菜心從包裝袋取出稱重，并將二氧化碳檢測(cè)儀一起放入密封罐中密封，每隔1 min記錄一次CO2濃度。根據(jù)CO2濃度變化、密封罐容積、樣品鮮重、密封時(shí)間計(jì)算呼吸速率，以mg CO2/(kg·h)為單位。

1.3.3 木質(zhì)素含量測(cè)定

主要參考Huang等[26]方法，稱取莖部樣品，利用乙醇溶液沸水浴直至無色，收集沉淀、干燥，溴化乙酰-冰醋酸溶解，恒溫水浴，加入氫氧化鈉溶液終止，在280 nm處測(cè)樣品提取液吸光值。稱取堿性木質(zhì)素作為標(biāo)準(zhǔn)物，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，用mg/g鮮重表示。

1.3.4 H2O2含量測(cè)定

參照H2O2試劑盒測(cè)定說明書（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行測(cè)定。稱取莖部組織粉末，加入緩沖液提取H2O2，配制反應(yīng)液混勻后，在405 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算H2O2含量，用μmol/g鮮重表示。

1.3.5 木質(zhì)素各合成酶活性測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性測(cè)定參考Lisker等[27]的方法：稱取1.5 g莖部組織粉末，加入3.5 mL pH 8.8硼酸-硼砂緩沖提取液[含少量聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）]，震蕩混勻，低溫離心30 min，取上清液，測(cè)定PAL活性。每個(gè)樣品分別取兩份0.5 mL酶液，一份作為樣品管，另一份煮沸5 min失活作為對(duì)照管。然后，分別加入3.0 mL緩沖液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液，混勻。反應(yīng)液置于80 ℃溫水浴，鹽酸終止反應(yīng)。測(cè)定290 nm處的吸光度值。計(jì)算PAL活性，以每克樣品每小時(shí)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為1個(gè)PAL活性單位（U）。計(jì)算公式如下：

式中：

OD樣品——樣品管反應(yīng)溶液的吸光度值；

OD對(duì)照——對(duì)照管反應(yīng)溶液的吸光度值；

V——樣品提取液總體積，mL；

Vs——測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；

t——酶促反應(yīng)時(shí)間，h；

m——樣品質(zhì)量，g。

4-香豆酸輔酶A連接酶（4-Coumarate-CoAligase，4-CL）活性測(cè)定參考Knobloch等[28]的方法，稱取莖部組織粉末，加入pH 7.8 Tris-HCl提取緩沖液及少量β-巰基乙醇，低溫離心，取上清。取50 μL酶液加入5 mmol/L ATP、5 mmol/L MgCl2、0.33 mmol/L CoA（輔酶A）、0.2 mmol/L 4-香豆酸，適量緩沖液配制3 mL反應(yīng)體系，37 ℃恒溫水浴10 min，加入30%三氯乙酸終止反應(yīng)，以恒溫水浴前加入1 mL 30%三氯乙酸溶液的反應(yīng)液作為對(duì)照，于333 nm測(cè)吸光值。計(jì)算4-CL酶活性。計(jì)算公式：參照PAL的計(jì)算方法計(jì)算4-CL活，以每克樣品每小時(shí)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為1個(gè)酶活單位（U）。

肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcoholdehydrogenas，CAD）活性測(cè)定參考Goffner等[29]的方法，稱取莖部組織粉末，加入適量磷酸緩沖提取液及少量β-巰基乙醇、PVPP、氧化型輔酶Ⅱ震蕩混勻，離心，取上清。3 mL酶反應(yīng)體系（含10 mmol/L氧化型輔酶Ⅱ，5 mmol/L反式肉桂酸），200 μL粗酶液，對(duì)照管反應(yīng)管加200 μL磷酸提取緩沖液，30 ℃水浴30 min，1 mol/L HCl終止反應(yīng)后，于340 nm處測(cè)吸光值。酶活性以每小時(shí)每克吸光度變化0.01為1個(gè)酶活單位。參照PAL的計(jì)算方法計(jì)算CAD活性，以每小時(shí)每克菜心樣品酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為1個(gè)CAD活性單位（U）。

過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性測(cè)定參考Fang等[30]的方法，稱取莖部組織粉末，加入適量磷酸提取緩沖液，離心，取上清液。取一支試管，按順序先加入2.0 mL磷酸緩沖溶液和0.5 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液，再加入0.5 mL現(xiàn)配的2% H2O2溶液，最后加入適量的酶溶液，傾倒混勻，用動(dòng)力學(xué)模式測(cè)定在波長470 nm處的吸光值。隔1 min再記錄一次。重復(fù)三次。制作OD470值隨時(shí)間變化曲線，根據(jù)曲線的初始線性部分計(jì)算每分鐘吸光度變化值△OD470，計(jì)算公式如下：

式中：

△OD470——每分鐘反應(yīng)吸光度變化值；

OD470F——反應(yīng)混合液吸光度終止值；

OD470I——反應(yīng)混合液吸光度初始值；

tP——反應(yīng)終止時(shí)間，min；

tI——反應(yīng)終止時(shí)間，min;

計(jì)算POD酶活性。以每克果蔬樣品(鮮重)每分鐘吸光度變化值增加1時(shí)為1個(gè)過氧化物酶活性單位。計(jì)算公式：

式中：

V——樣品提取液總體積，mL；

VS——測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RNA提取：利用提取試劑盒，參照說明書步驟[天根生化科技（北京）有限公司]。取0.1 g組織樣品，加入500 μL裂解液后迅速震蕩搖勻，經(jīng)過離心、洗脫、沉淀總RNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

將提取的RNA用多功能酶標(biāo)儀微孔板進(jìn)行RNA濃度檢測(cè)。采用艾瑞科生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Evo M-ML V Kit with gDNA Clean for qPCR II）將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成得到cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增分析。配制20 μL qPCR反應(yīng)體系。根據(jù)參考文獻(xiàn)選取GAPDH為內(nèi)參基因[31]。熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)參考實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（表1），參考說明書進(jìn)行運(yùn)行程序設(shè)定。每個(gè)樣品3次重復(fù)。目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量通過利用2-??CT公式的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算[32]，得到的表達(dá)量數(shù)據(jù)經(jīng)過log2轉(zhuǎn)換后，用Tbtools繪制熱圖分析[33]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、Origin Pro 9作圖，SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 H2O2處理對(duì)菜心呼吸速率的影響

如圖1，菜心采后呼吸速率變化呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，H2O2處理菜心在第3 d出現(xiàn)呼吸峰，為199.31 mg/(kg·h)，在貯藏3～9 d內(nèi)呼吸速率都處于較高水平為187.87～199.31 mg/(kg·h)；而對(duì)照組在第6 d達(dá)到高峰，呼吸峰值為164.72 mg/(kg·h)。采后菜心經(jīng)5 mmol/L H2O2處理，貯藏期間的呼吸速率均顯著性高于對(duì)照組（圖1）。植物組織的呼吸速率上升將導(dǎo)致各生理活動(dòng)的快速變化，各營養(yǎng)物質(zhì)如糖類、淀粉消耗加快，呼吸電子傳遞鏈等生理效用發(fā)生改變。Lin等[34]報(bào)道，H2O2處理龍眼增加呼吸強(qiáng)度，對(duì)照組和H2O2處理組在貯藏期6 d達(dá)到呼吸高峰，但對(duì)照組呼吸速率明顯低于處理組，在本研究中，H2O2處理增加了呼吸強(qiáng)度，并提前了呼吸峰的出現(xiàn)，推測(cè)H2O2處理增加呼吸作用，可能引起菜心在采后貯藏過程中營養(yǎng)品質(zhì)的下降。

2.2 H2O2處理對(duì)菜心莖木質(zhì)素含量的影響

菜心采后葉片黃化衰老與莖木質(zhì)化是影響其采后品質(zhì)劣變的主要因素。菜心莖部木質(zhì)素積累導(dǎo)致硬度增加，口感“變粗”[35]。如圖2所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，菜心莖組織的木質(zhì)化現(xiàn)象加劇，木質(zhì)素含量不斷增加，H2O2處理顯著性地促進(jìn)木質(zhì)素含量積累，在貯藏期12 d時(shí)，H2O2處理組木質(zhì)素含量達(dá)到11.27 mg/g，相比0 d增加了5.86 mg/g，而對(duì)照組僅增加到8.30 mg/g，處理組比對(duì)照組高了35.78%。H2O2參與木質(zhì)素的聚合和沉積過程，是木質(zhì)化過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟[25]。Wang等[10]通過基因表達(dá)和蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，采后菜心莖部木質(zhì)化與硬度呈正相關(guān)性（r2= 0.90，p<0.01），并且伴隨著H2O2含量發(fā)生改變，高氧氣調(diào)包裝處理減緩菜心莖部木質(zhì)化，誘導(dǎo)抗氧化酶積累，緩解ROS快速積累。任艷芳等[12]研究發(fā)現(xiàn)適宜濃度H2O2處理小白菜降低O2－·產(chǎn)生速率及H2O2含量，緩解鹽脅迫。而在本研究H2O2處理加劇了木質(zhì)素含量的增加，可能增加了內(nèi)源ROS含量導(dǎo)致品質(zhì)劣變快速發(fā)生。

2.3 H2O2處理對(duì)菜心內(nèi)源H2O2含量的影響

活性氧在采后果蔬品質(zhì)劣變中具有重要的調(diào)節(jié)作用。正常生長狀態(tài)下，植物組織ROS作為重要的信號(hào)物質(zhì)，維持正常生長和對(duì)抗環(huán)境脅迫；但在衰老、失水、病原菌侵染等逆境脅迫下，ROS平衡系統(tǒng)失衡，果蔬體內(nèi)會(huì)積累超量的ROS物質(zhì)，加速果蔬采后衰老[36,37]。由圖3所示，H2O2處理組的菜心莖部組織內(nèi)H2O2含量隨貯藏時(shí)間不斷增加，貯藏12 d時(shí)，H2O2含量為30.82 mmol/g，比對(duì)照組高2.71倍，對(duì)照組的H2O2含量在貯藏6 d最高（19.02 mmol/g）后開始下降；處理組的內(nèi)源H2O2含量均顯著高于對(duì)照組（p<0.01），5 mmol/L H2O2處理增加了莖部組織內(nèi)源H2O2含量。Lin等[34]報(bào)道H2O2處理增加了龍眼果皮ROS產(chǎn)生，ROS清除酶活性降低，加速龍眼果皮褐變。龐學(xué)群等[20]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的H2O2處理香蕉，加速了內(nèi)源H2O2積累，并且增加ROS清除酶超氧化物歧化酶（SOD）和POD活性，但降低氧化氫酶（CAT）活性。劉歡等[23]也發(fā)現(xiàn)H2O2處理草莓，H2O2含量高于對(duì)照組，在貯藏3～4 d達(dá)到最大值。由此可見，H2O2處理增加果蔬貯藏期內(nèi)源H2O2含量，外源H2O2處理可能打破了組織ROS產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)，引起相關(guān)生理狀態(tài)發(fā)生改變。

2.4 H2O2處理對(duì)菜心木質(zhì)素合成酶活力的影響

木質(zhì)素生物合成受多種關(guān)鍵合成酶的調(diào)節(jié)[38]。PAL和4-CL是參與苯丙烷代謝途徑的重要酶，合成木質(zhì)素前體物質(zhì)。PAL酶活力先上升后下降，對(duì)照組在貯藏第6 d，酶活力值最大，為51.33 U/g，但比處理組（62.84 U/g）低18.31%，而H2O2處理組在貯藏第9 d，達(dá)到峰值為74.67 U/g，比對(duì)照組（40.21 U/g）高85.70%，在貯藏6～9 d均顯著高于對(duì)照組（p<0.05）（圖4a）。與PAL不同的是，4-CL活性逐漸上升，尤其是9 d后快速升高；在貯藏12 d H2O2處理組（196.77 U/g）的4-CL活性顯著高于對(duì)照組（160.77 U/g）酶活性22.39%（圖4b）。PAL、4-CL主要負(fù)責(zé)參與類黃酮、木質(zhì)素等下游產(chǎn)物生物合成的前體物質(zhì)的產(chǎn)生。羅政等[39]發(fā)現(xiàn)在采后菜心常溫貯藏過程中，PAL酶活性在貯藏3 d達(dá)到峰值，隨后下降；本實(shí)驗(yàn)在低溫貯藏環(huán)境，兩組處理分別在貯藏6 d、9 d酶活力值最大，隨后下降，低溫環(huán)境下酶活力變化被延遲。孫涵等[40]研究雙寶蘑菇木質(zhì)化進(jìn)程中，4-CL酶活力不斷上升，與木質(zhì)素變化積累一致，認(rèn)為，4-CL與木質(zhì)素合成顯著相關(guān)；本研究中，H2O2處理組4-CL酶活力持續(xù)上升，木質(zhì)素含量不斷升高，與該結(jié)果一致。Hu等[41]利用反義抑制技術(shù)下調(diào)楊樹4-CL基因，木質(zhì)素含量減少45%，也證實(shí)4-CL是木質(zhì)素合成的重要參與者。在菜心采后貯藏過程中，H2O2處理通過促進(jìn)PAL、4-CL活力，影響木質(zhì)素合成前體物質(zhì)的產(chǎn)生，促進(jìn)木質(zhì)素合成速率。

CAD在木質(zhì)素單體形成的最后步驟起重要調(diào)節(jié)作用，CAD酶活水平上升是木質(zhì)化的標(biāo)志[42]。在本研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和H2O2處理組均在貯藏3 d（240.67 U/gvs263.33 U/g）和9 d（234.00 U/gvs270.33 U/g）酶活力較高，H2O2處理組分別提高了9.41%，15.53%，在貯藏6 d和12 d時(shí)，處理組和對(duì)照組酶活力值都有所下降，H2O2處理促進(jìn)CAD酶活增加，加快了木質(zhì)素單體物質(zhì)的合成（圖5a）。Ková?ik等[43]報(bào)道認(rèn)為ROS水平的減少降低了Cu誘導(dǎo)的洋甘菊根部木質(zhì)化，主要?dú)w因于抑制CAD酶活性，ROS水平與CAD酶活性變化趨勢(shì)具有一致性，在菜心組織中作為ROS主要形式之一的H2O2影響CAD酶活性。

POD主要是參與木質(zhì)醇單體脫氫聚合。由圖5b可知，H2O2處理組POD活力在貯藏期有所上升，保持較高的酶活性，在貯藏3 d時(shí)，H2O2處理組酶活性最大170.33 U/g，比對(duì)照組（140.95 U/g）高20.84%，在貯藏12 d時(shí)，H2O2處理組酶活性下降為128.22 U/g，比對(duì)照組低14.92%，對(duì)照組達(dá)到最大酶活性為150.71 U/g，對(duì)照組POD活性的升高速率相對(duì)于處理組較緩慢，H2O2處理促進(jìn)POD活力在貯藏前期上升，貯藏后期下降。楊騰達(dá)等[44]報(bào)道在桑葉菜木質(zhì)化過程中，真空預(yù)冷通過抑制貯藏后期（貯藏6 d后）POD酶活力變化，調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成，而本研究中，處理組POD酶活力主要在貯藏前期（貯藏9 d前）高于對(duì)照組。外源褪黑素噴施茶樹葉，加速了茶樹葉木質(zhì)素積累，發(fā)現(xiàn)處理8 d和16 d后，POD酶活性增加了2.04倍和3.79倍[45]；本研究中，處理組酶活性變化在貯藏3 d時(shí)變化最大，增加20.84%，變化差異相對(duì)于褪黑素處理茶樹較小，可能與處理方式和品種差異相關(guān)，但也說明POD參與到木質(zhì)素調(diào)節(jié)過程。

上述研究結(jié)果表明，H2O2處理可能通過加快PAL、4-CL、CAD、POD活力變化，因而導(dǎo)致菜心采后貯藏過程中木質(zhì)素合成增加。Wen等[11]報(bào)道高氧氣調(diào)包裝通過抑制PAL、4-CL、CAD、POD活性來調(diào)控菜心采后木質(zhì)化。Wang等[10]報(bào)道菜心H2O2與木質(zhì)素含量積累之間存在相關(guān)性，采后貯藏過程中。在水稻中，發(fā)現(xiàn)H2O2與木質(zhì)素同時(shí)大量生成抵御病原菌[46]。因此，外源H2O2處理可增加呼吸速率，內(nèi)源H2O2產(chǎn)生，并影響木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶活性水平的變化，從而加快菜心采后莖組織木質(zhì)化而導(dǎo)致品質(zhì)劣變。

2.4 H2O2處理對(duì)菜心木質(zhì)素合成酶基因表達(dá)的影響

木質(zhì)素合成途徑涉及多種酶參與，這些酶大部分都是綜合性的酶類，參與植物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)，可受到外界環(huán)境刺激誘導(dǎo)參與植物木質(zhì)化防御及衰老過程[47,48]。隨著對(duì)木質(zhì)素合成的不斷探索，各合成酶基因被克隆、鑒定，研究發(fā)現(xiàn)PAL、4-CL、CAD、POD等都是由多基因家族編碼，通過對(duì)其表達(dá)模式、功能調(diào)控的研究，發(fā)現(xiàn)各基因成員之間的功能機(jī)理存在著差異[49-52]。本研究以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，參考課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，比較分析了9個(gè)PAL基因，3個(gè)4-CL基因，9個(gè)CAD基因，6個(gè)POD基因的表達(dá)差異。如圖6所示，相對(duì)于其他木質(zhì)素合成基因，POD37、PAL4、PAL8在對(duì)照組及處理組貯藏期內(nèi)表達(dá)水平處于較高；PAL9、4-CL1、4-CL4、POD42、POD55在整個(gè)貯藏期表達(dá)量低；PAL3、PAL5、PAL6、CAD2、CAD4在對(duì)照組貯藏早期3 d表達(dá)量最高，在H2O2處理組則在貯藏6 d、9 d表達(dá)最強(qiáng)；PAL1、PAL2、CAD3、CAD11相對(duì)于對(duì)照組，在H2O2處理組3 d基因表達(dá)受到抑制；CAD7、CAD10、POD47在貯藏中期6 d、9 d表達(dá)較高，而H2O2處理組分別貯藏期3 d、12 d促進(jìn)CAD7、POD47表達(dá)，CAD10在貯藏期6 d被抑制表達(dá)，；4-CL7、CAD1、CAD5、CAD6、POD31、POD63貯藏期內(nèi)，對(duì)照組表達(dá)量較低，而在貯藏期12 d，H2O2處理組促進(jìn)這些基因表達(dá)。

從以上結(jié)果得出，在采后菜心貯藏過程中，PAL、4-CL、CAD、POD在木質(zhì)素合成途徑各不同時(shí)段發(fā)揮功能，各基因家族成員表達(dá)模式不同，發(fā)揮各自不同的作用，在不同的貯藏期影響木質(zhì)素合成。這與前人的研究報(bào)道是相似的，發(fā)現(xiàn)PAL多基因家族中，基因啟動(dòng)子序列的順式作用元件不同，可能是受不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，表現(xiàn)出不同成員的表達(dá)特異性[49]。在擬南芥At4-CL基因家族功能和表達(dá)特性也存在明顯差異，與木質(zhì)素的合成相關(guān)的At4-CL1和At4-CL2基因主要在維管束組織中表達(dá)；而At4CL-3與調(diào)控類黃酮合成相關(guān)，主要在花中表達(dá)[48]。已發(fā)現(xiàn)的多種植物CAD基因成員之間的功能機(jī)理存在著差異，多個(gè)CAD同時(shí)參與到木質(zhì)素單體合成[50]。在植物體內(nèi)，超級(jí)基因家族編碼的POD參與到各個(gè)生命活動(dòng)，而在植物木質(zhì)化過程中，擬南芥、煙草中都已鑒定到其作為氧化劑催化H2O2共同參與木質(zhì)素單體聚合[52,53]。因此，菜心采后貯藏過程中莖部木質(zhì)素合成，表達(dá)豐度較高的POD37、PAL4、PAL8基因可能與木質(zhì)素生物合成有重要關(guān)系。盡管如此，這些顯著表達(dá)的基因是否作為主要調(diào)控基因參與到采后菜心莖組織的木質(zhì)素合成，及H2O2處理在不同貯藏期誘導(dǎo)表達(dá)的差異基因與ROS信號(hào)途徑的關(guān)系，尚需進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證及分析。

2.5 H2O2處理對(duì)ROS生成酶及清除酶基因表達(dá)的影響

植物中ROS的產(chǎn)生及信號(hào)途徑受到呼吸爆發(fā)氧化酶（respiratory burst oxidase homologue，Rboh）的調(diào)控，Rboh是ROS的重要來源，由多基因編碼。在本研究中，H2O2處理促進(jìn)了RbohF，RbohB兩個(gè)基因表達(dá)增強(qiáng)，抑制RbohG基因的表達(dá)。研究報(bào)道，在擬南芥組織中RbohD和RbohF表達(dá)誘導(dǎo)生成ROS，增強(qiáng)抗性[54]；在水稻組織中，OsRbohA與OsRbohE在免疫時(shí)期負(fù)責(zé)產(chǎn)生H2O2時(shí)間段不同，OsRbohA主要負(fù)責(zé)生成早期H2O2，而晚期H2O2的產(chǎn)生是OsRbohE生成[55]?？梢姡琑boh基因家族各成員在表達(dá)上的差異而影響H2O2的生成。PAO1和PAO2基因都是編碼多胺氧化酶（PAO）的基因，多胺氧化酶催化多胺氧化降解成H2O2[56]，也是ROS產(chǎn)生的方式之一。本研究結(jié)果PAO1和PAO2基因表達(dá)豐度較低，不是主要的ROS產(chǎn)生基因（圖7）。

植物體內(nèi)本身具有一系列的ROS清除機(jī)制，ROS清除酶是重要的方式之一，包括POD、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等。通過對(duì)菜心SOD、CAT基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，H2O2處理增加SOD1、SOD2、SOD3、CAT3基因表達(dá)。劉建新等[57]研究也發(fā)現(xiàn)外源H2O2處理燕麥提高SOD、CAT、POD和APX酶活性，抗氧化能力增強(qiáng)。劉歡等[23]報(bào)道H2O2處理草莓增加了超氧陰離子產(chǎn)生速率，CAT活性下降。本研究結(jié)果顯示H2O2處理增加了ROS清除酶基因的表達(dá)，RbohF、RbohB兩個(gè)基因表達(dá)也增強(qiáng)。因此，我們推測(cè)H2O2處理激發(fā)了ROS清除酶系統(tǒng)的作用，但同時(shí)增加了H2O2含量生成的速率，而ROS清除酶系統(tǒng)并未表達(dá)達(dá)到清除過量的ROS的水平，導(dǎo)致H2O2含量增加。研究已表明，外源H2O2處理植物形成氧化脅迫，而適度的氧化脅迫激活內(nèi)源H2O2，再經(jīng)受各脅迫響應(yīng)時(shí)，抗氧化防護(hù)能力增強(qiáng)[58-60]?？梢姡煌瑵舛鹊腍2O2對(duì)植物本身的作用效果不同，表現(xiàn)出不同的生理生化效應(yīng)。

3 結(jié)論

采后菜心木質(zhì)化導(dǎo)致硬度的增加、質(zhì)地變差、貯藏性能下降、嚴(yán)重影響口感和質(zhì)量。本研究采用5 mmol/L H2O2處理菜心較對(duì)照組加速了呼吸速率，莖木質(zhì)素含量增加了35.78%，內(nèi)源H2O2含量上升2.71倍，可能引起采后菜心薹莖在貯藏過程中的加速衰老進(jìn)程。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)H2O2處理促進(jìn)木質(zhì)素代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶PAL、CAD、4-CL、POD等活性及其基因水平的變化；PAL、CAD活性在貯藏9 d比對(duì)照組酶活性分別提高85.70%、15.53%，4-CL活性在貯藏12 d比對(duì)照組酶活性分別提高22.39%，POD活性在貯藏3 d比對(duì)照組高20.84%?；蛩缴戏治霭l(fā)現(xiàn)貯藏期內(nèi)莖木質(zhì)素合酶基因POD37、PAL4、PAL8，活性氧生成酶基因RbohB、RbohG，活性氧清除酶基因SOD1、SOD2、SOD3、CAT3等表達(dá)豐度較高，H2O2處理提高了這些基因在不同貯藏時(shí)期內(nèi)的表達(dá)。由此可見，5mmol/L H2O2處理菜心不利于菜心貯藏保鮮，H2O2對(duì)采后菜心木質(zhì)化具有重要的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合本研究結(jié)果推斷外源H2O2調(diào)控木質(zhì)素合成途徑主要有：（1）內(nèi)源H2O2積累，ROS清除酶系統(tǒng)也被激發(fā)，但無法及時(shí)清除大量的ROS導(dǎo)致ROS代謝失衡，積累的ROS作用于木質(zhì)素單體聚合過程，加速木質(zhì)素合成代謝；（2）ROS代謝失衡被認(rèn)為是影響果蔬采后衰老的重要因素之一，易導(dǎo)致呼吸代謝紊亂，H2O2處理導(dǎo)致了采后菜心的呼吸代謝增加，并引起一系列衰老反應(yīng)，加速了菜心木質(zhì)化的進(jìn)程。盡管如此，基于H2O2濃度效應(yīng)對(duì)菜心采后品質(zhì)劣變的調(diào)節(jié)作用及其分子調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。