可可粉對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的抑制作用 及分子機(jī)制

孫晶晶，季影，王勉，牟明軍，鄒璟，黃葉飛

（徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇徐州 221004）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）與克羅恩?。–rohn’s disease，CD）都是一組病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，同屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）[1]。與CD不同，UC病變連續(xù)，主要累及直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、膿血便等[1-3]；此外，UC腹瀉不超過6周的疾病過程，需要區(qū)別于傳染性腸炎[2]；UC易反復(fù)發(fā)作且遷延不愈、極易誘發(fā)結(jié)直腸腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康[3-5]。UC在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，近年來，中國人群UC的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，亞洲國家中處于較高水平[6,7]。目前UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，受環(huán)境、遺傳、感染等多種因素的影響，但普遍認(rèn)為是遺傳、免疫、飲食、感染和菌群失調(diào)等因素之間相互作用的結(jié)果，其中免疫系統(tǒng)因素是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，很大程度上與炎性因子的失衡和免疫反應(yīng)的異常密切相關(guān)[7,8]?，F(xiàn)有治療藥物可分為氨基水楊酸類、腎上腺相關(guān)激素、免疫抑制劑以及一些生物制劑等，雖然種類繁多，但仍然缺乏安全有效的藥物，長期使用這些藥物會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如機(jī)會(huì)性感染、胃潰瘍、胰腺炎、惡性腫瘤等[9,10]。因此，尋找新型安全、治療有效的藥物具有十分重要的意義。

植物化學(xué)物質(zhì)在改善UC患者營養(yǎng)不良和減少不良反應(yīng)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如多途徑、療效好、副作用小等[11]。研究表明，可可消費(fèi)與心血管疾病和全因死亡率的顯著降低有關(guān)[12]?？煽煞郏–P）含有生物堿、揮發(fā)性物質(zhì)、脂類及豐富的酚類抗氧化劑，研究發(fā)現(xiàn)抗氧化能力最高的50種食品中，有5種是基于可可的[13]。CP富含黃酮類化合物，特別是黃烷醇，在可可中發(fā)現(xiàn)的主要黃烷醇是表兒茶素和兒茶素[12]；黃烷醇是一類天然植物化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保護(hù)心血管、降血脂等多種生物學(xué)功能[12,14-16]，在可可中的黃烷醇含量最高[14]。CP可以有效地改變炎癥過程，從而有可能為動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病和癌癥危險(xiǎn)因素較高的個(gè)體帶來好處，還可以保護(hù)神經(jīng)免受損傷，保護(hù)皮膚免受紫外線輻射的氧化損傷，對(duì)飽腹感、認(rèn)知功能和情緒呈現(xiàn)有益的影響[12,17]。

葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）誘導(dǎo)的小鼠急性和慢性結(jié)腸炎模型是都是腸炎模型中應(yīng)用最廣的，該模型癥狀表現(xiàn)與人類UC極為相似，主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液樣便、糞便潛血、肉眼血便、重量減輕、活動(dòng)度減少，毛色變差等，是研究人類UC的理想模型。DSS是一種高分子的水溶性硫酸多聚糖，對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有直接毒性，通過有效抑制DNA合成，破壞腸黏膜屏障，改變結(jié)腸黏液層菌群變化，還可以使結(jié)腸緊密連接蛋白基因表達(dá)能力下降，同時(shí)可能發(fā)生肝素樣作用，導(dǎo)致急性結(jié)腸炎的發(fā)生[18-20]。本實(shí)驗(yàn)建立3% DSS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過給與CP灌胃治療，觀察結(jié)腸炎小鼠的一般情況、結(jié)腸長度和病理損傷程度，分析結(jié)腸組織中NF-κB p65信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及下游炎癥因子的表達(dá)水平，探討CP對(duì)于小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用雌性6～8周齡C57BL/6小鼠（18～22 g）20只，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司（許可證號(hào)：SYXK(蘇)2021-0038），飼養(yǎng)條件為室溫21 ℃，相對(duì)濕度45%，明暗交替，光照適度，通風(fēng)良好，環(huán)境清潔衛(wèi)生。在整個(gè)適應(yīng)和研究期間，所有動(dòng)物均可自由獲取食物和水。

1.2 藥物及試劑

Navitas無糖生可可粉227 g，購自樂淘美國酮人館；葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量為(3.6～5.0)×104，批號(hào)：160110），MP Biomedicals公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；IκBα、Phospho-IκBα、NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65 (Ser536)、β-tubulin一抗，購自美國Cell Signaling Technology公司，TNF-α、IL-6、IL-1β一抗，購自美國Proteintech公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

RM2016石蠟切片機(jī)，上海萊卡儀器有限公司；Eclipse Ci正置顯微鏡，日本尼康；KZ-Ⅱ高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司；Optima XPN-100超速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國賽默飛公司；Spark多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國賽默飛公司；BIO-RAD ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀，美國伯樂公司。

1.4 試驗(yàn)方法

DSS誘導(dǎo)的急性UC模型的建立：C57BL/6小鼠20只，小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組（Control group）、模型組（DSS group）、低劑量可可粉組（DSS+low CP group）和高劑量可可粉組（DSS+high CP group），每組5只小鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，給與3% DSS連續(xù)飲水7 d，然后繼續(xù)正常飲水3 d。對(duì)照組小鼠一直飲用常規(guī)飲水，模型組小鼠飲用水含3% DSS，低劑量組小鼠在3% DSS飲水的基礎(chǔ)接受50 mg/(kg·d)劑量的CP灌胃處理，高劑量組小鼠在3% DSS飲水的基礎(chǔ)上接受100 mg/(kg·d)劑量的CP灌胃處理，兩組小鼠接受CP治療的時(shí)間都是持續(xù)10 d，同時(shí)正常組和模型組小鼠灌胃同等劑量的溶劑（生理鹽水）對(duì)照，實(shí)驗(yàn)過程中每天記錄小鼠的體重。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠麻醉后用脊椎脫臼方法處死，剖開腹腔暴露結(jié)腸，取下全結(jié)腸，測(cè)量長度，然后縱向剪開，用PBS沖洗干凈，用于后續(xù)的結(jié)腸病理分析以及目的蛋白、mRNA等指標(biāo)的檢測(cè)，剩余小鼠結(jié)腸組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 結(jié)腸病理分析

造模完成取出小鼠全結(jié)腸后，比較研究小鼠結(jié)腸（回盲連接部到肛門外緣）的長度，取部分用PBS沖洗干凈的結(jié)腸，用4%多聚甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織黏膜損傷情況，并由專業(yè)病理人員進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分。結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分=結(jié)腸上皮組織損傷評(píng)分+炎性浸潤評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Colon histopathological scoring system

1.6 RNA提取及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

取一小段小鼠結(jié)腸組織（約0.2 g）至含有1 mL TRIzol的2 mL EP管（已經(jīng)去除RNase）中，用KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）進(jìn)行勻漿，頻率：70 Hz，時(shí)間：共180 s，每60 s暫停30 s。TRIzol法提取總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，每個(gè)樣品上樣總RNA量為0.5 μg，利用Applied Biosystems 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，按照HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit步驟進(jìn)行目的基因TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平檢測(cè)，每份樣品至少重復(fù)三次。目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用CT值衡量，并以GAPDH的CT值作為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算分析。引物由Thermo Fisher公司構(gòu)建，序列見表2。

表2 靶基因引物Table 2 Target gene primers

1.7 免疫印跡分析

取一小段小鼠結(jié)腸組織（約0.2 g）至含有500 μL組織蛋白裂解液的2 mL EP管中，KZ-Ⅱ高速組織研磨儀進(jìn)行勻漿，頻率：70 Hz，時(shí)間：共180 s，每60 s暫停30 s。勻漿制備完成后置于冰上裂解0.5 h，4 ℃、12000×g離心15 min，取上清，用BCA測(cè)定蛋白濃度。然后制備10%的SDS-PAGE，以40 μg蛋白量上樣電泳。恒壓條件下，濃縮膠電泳電壓70 V，分離膠電壓為100 V。電泳結(jié)束后，用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（250 mA，90 min）。轉(zhuǎn)膜完畢，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，接著與IκBα、Phospho-IκBα、NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65（Ser536）抗體、TNF-α、IL-6、IL-1β的一抗（1:1000稀釋度）在4 ℃冰箱孵育過夜，接著用TBST洗滌一抗（5次，5 min/次），與適當(dāng)稀釋的二抗在室溫共孵育1 h，膜用同樣的方法洗滌二抗10次，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)。條帶灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次以上，采用SPSS 21.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用t檢驗(yàn)方法分析，p<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠體重減輕的抑制作用

研究報(bào)道[21]，有18%～62%的UC患者有體重下降的臨床表現(xiàn)，這可能與長期腹瀉、血便導(dǎo)致的繼發(fā)營養(yǎng)不良有關(guān)。觀察CP對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重的影響，結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組小鼠體重增加，精神狀態(tài)良好，飲水、飲食、活動(dòng)及大便等性狀正常，體毛柔軟光亮。各造模組小鼠在給與DSS后，體重開始下降，開始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)量減少、進(jìn)食量下降、毛發(fā)灰暗凌亂無光澤等現(xiàn)象，模型組小鼠在給與DSS 3 d后開始出現(xiàn)稀便、血便、體重減輕、懶動(dòng)、厭食及毛發(fā)干枯等UC急性期癥狀，說明造模成功，到第10 d，模型組小鼠的平均體重僅為初始平均體重的76.81%，而低、高劑量CP組小鼠平均體重分別為初始平均體重的83.02%和87.58%。與模型組相比，CP處理組小鼠的體重丟失明顯減少，且高劑量處理組小鼠的體重丟失也要少于低劑量組，同時(shí)，處理組小鼠的進(jìn)食、體重、活動(dòng)度都有所改善。大量人群和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，可可即使在慢性毒性和致癌實(shí)驗(yàn)中也沒有出現(xiàn)毒副作用[22,23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CP能夠有效的抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的體重丟失，這對(duì)改善UC炎癥期間營養(yǎng)不良可能具有較好的作用。

2.2 CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度縮短的抑制作用

取各組小鼠完整結(jié)腸，觀察CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響，結(jié)果如圖2所示。與正常對(duì)照組（9.85 cm）相比，模型組（6.89 cm）小鼠結(jié)腸長度明顯縮短（p<0.01），CP低劑量（8.16 cm）和高劑量組（9.19 cm）小鼠結(jié)腸長度縮短明顯少于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），且隨著CP劑量增加，結(jié)腸長度縮短進(jìn)一步減少。結(jié)腸炎癥期間，伴有組織水腫，結(jié)腸長度縮短[24]，CP能減少DSS誘導(dǎo)所致的結(jié)腸長度縮短，表明其對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠UC炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。

2.3 CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜損傷的抑制作用

通過小鼠結(jié)腸HE染色病理分析，考察CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜損傷的影響，結(jié)果如圖3所示。與正常對(duì)照組小鼠（結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分，0.60）相比，模型組小鼠（5.20）結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯增高（p<0.01），鏡下正常對(duì)照組小鼠腸腺清晰、排列整齊、無明顯炎性細(xì)胞浸潤、絨毛排列整齊、無明顯斷裂，而模型組小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞、可見大量炎性細(xì)胞浸潤、絨毛排列雜亂無序、可見明顯斷裂、絨毛長度縮短，局部有輕重度壞死，壞死處成纖維細(xì)胞增生，黏膜下層水腫。與模型組相比，CP低劑量（3.20）和高劑量組（2.00）小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯降低（p<0.05），低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯改善，高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，上皮結(jié)構(gòu)較完整，幾乎沒有炎癥細(xì)胞浸潤?？煽墒强寡趸瘎┑呢S富來源，含有大量表兒茶素及黃酮類化合物[13]，Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)表兒茶素能夠明顯減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠體重下降、結(jié)腸黏膜損傷、結(jié)腸縮短和隱窩損害，與本研究的發(fā)現(xiàn)是一致的。研究表明CP能夠減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷，抑制炎癥的嚴(yán)重程度，從而有效改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥病變。

2.4 CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸組織中促炎因子表達(dá)的抑制作用

UC的發(fā)生與炎癥因子的失衡和免疫反應(yīng)的異常密切相關(guān)，UC患者結(jié)腸組織中促炎因子的水平會(huì)增高，產(chǎn)生免疫功能紊亂，最終導(dǎo)致UC的發(fā)展[7,8]。與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平分別升高了9.72、7.08和7.39倍（p<0.01）；與模型組相比，低、高劑量CP組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平分別降低了0.64、0.72、1.05倍和2.03、2.27、2.07倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中的促炎因子TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高了0.93倍（p<0.01），IL-6和IL-1β的蛋白表達(dá)水平分別升高了0.44和0.52倍（p<0.05）；與模型組相比，低劑量CP組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白表達(dá)水平分別降低了0.22、0.14和0.18倍，高劑量CP組小鼠則分別降低了0.58、0.37和0.68倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。大量的人群和動(dòng)物模型研究顯示，IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子在維持UC慢性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[26]。因此，CP可能通過抑制DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸組織中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)從而減輕炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

2.5 CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中NF-κB信號(hào)活化的抑制作用

核因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一類細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化和增殖以及細(xì)胞凋亡過程中都發(fā)揮重要作用[27,28]。同時(shí)，在UC患者結(jié)腸黏膜中，存在著NF-κB p65的高表達(dá)[29]，NF-κB信號(hào)通路激活后，誘導(dǎo)其下游炎癥因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并促進(jìn)這些炎癥因子遷移、黏附及與腸上皮細(xì)胞(IECs)的相互作用[30-32]。觀察CP對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中NF-κB的活化影響，結(jié)果如圖5所示。每個(gè)泳道代表一只小鼠，每組選取了三只不同的小鼠，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65蛋白S536位點(diǎn)的磷酸化水平增高了4.00倍（p＜0.01）；與模型組相比，低、高劑量CP組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65蛋白S536位點(diǎn)的磷酸化水平分別下降了0.62倍和2.07倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；同時(shí)，NF-κB p65總蛋白的表達(dá)水平在各組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Park等[33]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65蛋白S536位點(diǎn)的磷酸化可能會(huì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而影響二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化激活NF-κB p65，活化后的p65經(jīng)過核轉(zhuǎn)位最終介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而直接或間接的調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。IκB是調(diào)節(jié)NF-κB活性的重要蛋白，而IκBα是IκB蛋白家族中最常見的成員，Wang等[34]的研究表明，幾乎所有IκBα磷酸化修飾都促進(jìn)NF-κB活化，同樣，IκBα的去磷酸化對(duì)于抑制NF-κB的激活至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中IκBα蛋白的磷酸化水平增高了2.12倍（p＜0.01）；與模型組相比，低、高劑量CP組小鼠結(jié)腸組織中IκBα蛋白的磷酸化水平分別下降了1.69倍和2.19倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；同時(shí)，IκB總蛋白的表達(dá)水平在各組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，CP可能通過抑制NF-κB p65信號(hào)通路的活化，進(jìn)一步減少相關(guān)促炎細(xì)胞因子的分泌，從而減輕DSS誘導(dǎo)的UC炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論

UC的臨床治療效果不佳，容易反復(fù)發(fā)作，而且具有多種副作用，CP含有許多生物活性化學(xué)物，雖然其抗炎機(jī)制還不是十分清楚，但是其抗炎和無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)決定了其用作UC治療藥物的前景。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CP可以顯著抑制UC引發(fā)的體重減少和結(jié)腸縮短、減輕腸黏膜組織損傷破壞和炎性細(xì)胞浸潤，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，其減輕炎癥的機(jī)制可能與抑制NF-κB p65炎癥信號(hào)通路有關(guān)。上述研究為深入探索UC的發(fā)病機(jī)制及制定UC患者營養(yǎng)支持策略提供了一定的理論基礎(chǔ)。