樺木酸在胃腸道癌癥中的作用機(jī)制

李懷玉，陳 云，胡子毅，譚飛燕，劉培喆，鄧慧靈，葉 菁

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)a.研究生院2019級(jí)； b.附屬醫(yī)院急診科； c.研究生院2021級(jí)； d.臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教研室，南昌 330006；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，江西 贛州 341000)

胃腸道癌癥(GICs)是世界范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的癌癥，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。2020度GLOBOCAN統(tǒng)計(jì)[1]顯示：結(jié)直腸癌(CRC)、胃癌(GC)、肝細(xì)胞癌(HCC)和食管癌(OC)的發(fā)病率與死亡率均在所有癌癥中位列前十，而胰腺癌(PC)也因較差的預(yù)后成為第七大癌癥相關(guān)死因。目前GICs治療方式多樣，包括手術(shù)治療、放療、化療、抗體靶向治療及免疫治療，但均存在各自的局限性，并有可能導(dǎo)致GICs的進(jìn)一步發(fā)展[2-6]。尋找新的有效藥物一直是GICs研究的重點(diǎn)，而在自然界中挖掘天然的抗腫瘤分子是其重要的方向之一[7]，樺木酸(BA)是一種主要從樺木中提取的羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物，它表現(xiàn)出抗腫瘤、抗病毒、抗高血脂以及抗炎等多種藥理特性[8]。自1995年首次發(fā)現(xiàn)BA能抑制黑色素瘤細(xì)胞活性以來(lái)[9]，BA的抗腫瘤作用一直被廣泛研究。如今，BA已被證實(shí)對(duì)包括GICs在內(nèi)的人體多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。隨著有關(guān)BA抗GICs活性的基礎(chǔ)研究日益深入，其背后越來(lái)越多的內(nèi)在機(jī)制被闡明，更是引起了學(xué)界對(duì)BA的濃厚興趣。本文就BA作用于GICs的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述并展開(kāi)討論，以期為后續(xù)研究提供建設(shè)性框架以及理論指導(dǎo)。

1 BA抑制GICs細(xì)胞增殖

細(xì)胞周期失控引發(fā)的持續(xù)異常增殖是腫瘤的基本特征之一。作為腫瘤發(fā)生的重要一環(huán)，細(xì)胞周期調(diào)控通路被認(rèn)為是抗腫瘤的核心靶點(diǎn)之一。在幾種不同的GICs模型中，BA均表現(xiàn)出了顯著的增殖抑制效應(yīng)，只不過(guò)其阻滯的細(xì)胞周期階段稍有差異：GC中SGC-7901、MGC-803細(xì)胞主要被阻滯于G0/G1期[10-11]；HCC中PLC/PRF/5、MHCC97L細(xì)胞主要阻滯于G2/M期[12]，HepG2細(xì)胞阻滯于S期[13]；PC中BxPC-3、AsPC-1、PANC-1細(xì)胞以及BALB/C裸鼠(接種AsPC-1或PANC-1細(xì)胞)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞主要阻滯于G0/G1期[14-15]。細(xì)胞周期是多種蛋白共同調(diào)控的結(jié)果，目前BA已被證實(shí)可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)中的CDK4[15]和細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子(CKIs)中的p21[16]和p27[17]，還可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白中的cyclin D1[10-11,13,15-16,18-19]和cyclin B1[10-11]，從而抑制GICs細(xì)胞的增殖。其中，p27上調(diào)是由BA降低S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)穩(wěn)定性從而抑制了p27泛素化降解所致。細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白5(CDCA5)作為后期促進(jìn)復(fù)合物(APC)的底物，是S期和G2/M期染色單體穩(wěn)定結(jié)合的主要調(diào)節(jié)器[20]，BA可下調(diào)其表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC中HT29細(xì)胞的增殖抑制[16]。

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)參與DNA修復(fù)、染色質(zhì)重塑以及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，并在許多癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。GC中BGC-823、MNK45細(xì)胞以及OC中TE-11細(xì)胞的增殖受BA抑制同時(shí)，其胞內(nèi)PCNA表達(dá)水平均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，這表明BA抗GC和OC與PCNA的調(diào)節(jié)有關(guān)[18,21]。核纖層蛋白作為細(xì)胞核的主要中間絲，主要在DNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。多數(shù)GICs中核纖層蛋白下調(diào)較為常見(jiàn)，但在PC中則是以過(guò)表達(dá)為特點(diǎn)[22]，下調(diào)核纖層蛋白B1也是BA抑制PC細(xì)胞增殖的機(jī)制之一[15]。細(xì)胞增殖受多條通路調(diào)控，以β-catenin及其下游分子構(gòu)成的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路失調(diào)是引發(fā)增殖異常的常見(jiàn)原因。有研究[19]表明BA能通過(guò)抑制β-catenin下調(diào)cyclinD1和原癌基因c-Myc的異常表達(dá)，從而抑制PC中PANC-1細(xì)胞的增殖。見(jiàn)表1，圖1A。

表1 BA調(diào)控GICs細(xì)胞周期的相關(guān)機(jī)制

2 BA抑制GICs細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散無(wú)論對(duì)于GICs患者還是研究者來(lái)說(shuō)都是一個(gè)挑戰(zhàn)。從臨床角度來(lái)看，絕大多數(shù)GICs致死病例都與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。有效阻止腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移是GICs治療的首要任務(wù)。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是調(diào)節(jié)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的主要因素之一，它參與了入侵-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的絕大多數(shù)環(huán)節(jié)[23]。EMT的主要特征有細(xì)胞間黏附喪失，上皮標(biāo)志物表達(dá)降低及間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上升。作者既往的研究[24]發(fā)現(xiàn)BA能抑制GC中SNU-16細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移活性，并引起神經(jīng)鈣黏蛋白下調(diào)以及上皮細(xì)胞鈣黏蛋白上調(diào)，這表明BA可通過(guò)阻止EMT進(jìn)程來(lái)抑制GC細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。EMT過(guò)程受多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，TGF-β/Smads通路是其中的重要途徑之一，BA抑制CRC中HCT116細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的能力便與其下調(diào)該通路中TGF-β、Smad2/3蛋白的能力有關(guān)[25]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用最突出的蛋白酶家族，其活性受組織內(nèi)在金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)調(diào)節(jié)。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)激活MMPs的活性破壞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，引發(fā)組織重塑，最終穿過(guò)ECM構(gòu)成新的轉(zhuǎn)移灶。Skp2、CDCA5不僅在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，對(duì)于MMPs也具有調(diào)節(jié)功能。在CRC中的HCT116、HT29細(xì)胞[16,26]以及GC中的SGC7901、BGC823細(xì)胞[17]中，BA表現(xiàn)了顯著的侵襲與轉(zhuǎn)移抑制能力，其機(jī)制不僅包括對(duì)TIMP-2的上調(diào)，還包括對(duì)Skp2、CDCA5的表達(dá)抑制，從而下調(diào)MMP-2、MMP-9。

血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)對(duì)細(xì)胞骨架具有重要的調(diào)節(jié)功能，能夠促進(jìn)肌動(dòng)蛋白形成突出膜結(jié)構(gòu)并維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[27]。近幾年來(lái)，陸續(xù)有學(xué)者在各類GICs中發(fā)現(xiàn)VASP表達(dá)異常，VASP在GICs侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用逐漸受到重視。有研究[18]指出VASP在GC的BGC-823細(xì)胞中存在過(guò)表達(dá)，而B(niǎo)A能通過(guò)抑制NF-κB下調(diào)GC細(xì)胞中VASP的含量，從而阻止GC細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。見(jiàn)表2，圖1B。

表2 BA抑制GICs細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制

3 BA誘發(fā)GICs細(xì)胞凋亡

程序性細(xì)胞死亡(PCD)的抵抗能力是癌癥的十大基本特征之一[28]，在PCD的各種途徑中，有關(guān)細(xì)胞凋亡的研究最為廣泛。目前公認(rèn)的二大細(xì)胞凋亡途徑包括死亡受體(DRs)介導(dǎo)的外源性途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑，半胱氨酸蛋白酶(caspases)與Bcl-2家族是整個(gè)細(xì)胞凋亡過(guò)程的核心分子集團(tuán)。目前眾多研究均認(rèn)為內(nèi)源性線粒體途徑是BA誘發(fā)GICs細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。一般而言，BA能引發(fā)GICs胞內(nèi)Bcl-2下調(diào)以及Bax上調(diào)，從而使線粒體膜電位降低[14,26,29-30]。隨著線粒體功能逐漸喪失，細(xì)胞色素C(Cyt C)[31-32]與凋亡抑制蛋白(IAPs)[12]釋放增加，進(jìn)一步引發(fā)caspase-3、caspase-9上調(diào)，促進(jìn)PARP裂解并最終導(dǎo)致GICs細(xì)胞的凋亡。WANG等[33]研究發(fā)現(xiàn)BA能促進(jìn)CRC中HCT116、SW480、HT29細(xì)胞內(nèi)PARP裂解，但不能改變?nèi)甙麅?nèi)Bax的表達(dá)水平，這與ZENG等[26]報(bào)道的HCT-116細(xì)胞中Bax上調(diào)的結(jié)果相互矛盾，因此有必要進(jìn)行進(jìn)一步的核實(shí)。活性氧分子(ROS)有極強(qiáng)的氧化能力，在細(xì)胞內(nèi)主要由線粒體產(chǎn)生，其大量存在時(shí)能以正反饋形式改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致線粒體受損而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。CRC中的HCT-116細(xì)胞以及HCC中的HepG2細(xì)胞在BA作用下均出現(xiàn)了ROS上調(diào)，其中HCC細(xì)胞內(nèi)ROS的上調(diào)受抑癌基因p53的調(diào)控[26,31]。作為“基因守護(hù)者”，活化的P53能與眾多靶基因的調(diào)控序列相結(jié)合，以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的一系列過(guò)程。該研究指出p53可通過(guò)促進(jìn)氧化還原因子p66shc生成以及促進(jìn)miR-21表達(dá)而抑制Sod2提升HCC細(xì)胞中ROS的含量，繼而激發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)細(xì)胞凋亡[31]。此外，有研究[34]指出人參皂甙Rh2與BA聯(lián)用促進(jìn)HCC中HepG2細(xì)胞、A549細(xì)胞凋亡的療效要優(yōu)于單用，這表明人參皂甙Rh2可能對(duì)BA誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑具有協(xié)同作用。

與TNF超家族的其他成員不同，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL，亦稱Apo2L)能介導(dǎo)DRs選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。但由于多種原因，TRAIL受體激動(dòng)劑(TRAs)在臨床試驗(yàn)中顯現(xiàn)的實(shí)際效益相當(dāng)有限[35]。有研究[36]發(fā)現(xiàn)重組Apo2配體(rh-Apo2L)與BA聯(lián)用后，體內(nèi)外模型中的HCC細(xì)胞對(duì)TRAIL觸發(fā)的外源性凋亡途徑變得更為敏感。當(dāng)前雖無(wú)證據(jù)表明BA能直接通過(guò)DRs途徑促進(jìn)GICs細(xì)胞凋亡，但BA可以通過(guò)增強(qiáng)TRAIL活性，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAs的耐藥性，為其臨床應(yīng)用創(chuàng)造新的可能。見(jiàn)表3，圖1C。

表3 BA誘發(fā)GICs細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制

4 BA啟動(dòng)GICs細(xì)胞自噬

自噬是細(xì)胞自我消化的代謝調(diào)控過(guò)程，在饑餓、缺氧或其他特定細(xì)胞應(yīng)激條件下，自噬允許細(xì)胞大分子被溶酶體降解并作為代謝前體循環(huán)到代謝及生物合成途徑中。自噬一方面可使細(xì)胞達(dá)到應(yīng)激適應(yīng)規(guī)避死亡，另一方面又可構(gòu)成另一種細(xì)胞死亡—自噬性細(xì)胞死亡[37]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，一直是自噬研究的熱門(mén)靶點(diǎn)。有研究[29,33,38]表明BA對(duì)GICs細(xì)胞mTOR的抑制既受AMPK/mTOR、PI3K/Akt/mTOR通路的調(diào)控，又受非mTOR依賴通路中P53的影響。自噬主要包括自噬小泡形成、自噬小泡延伸、自噬溶酶體形成與降解3個(gè)過(guò)程，大部分研究認(rèn)為BA對(duì)GICs細(xì)胞自噬整個(gè)過(guò)程均具有促進(jìn)作用。BA能通過(guò)上調(diào)Beclin1、ATG7、ATG12、ATG5，下調(diào)p62，促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化等途徑增加自噬通量而增強(qiáng)GICs細(xì)胞的自噬[29,33,39]。個(gè)別研究[12]發(fā)現(xiàn)BA處理HCC的MHCC97L細(xì)胞后，雖然能促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，但引發(fā)的是p62上調(diào)、自噬溶酶體形成與降解的抑制，這表明BA雖能誘導(dǎo)MHCC97L細(xì)胞自噬，但其對(duì)自噬下游環(huán)節(jié)的阻斷使得最終的自噬通量處于較低水平。細(xì)胞凋亡與自噬之間關(guān)系復(fù)雜，BA在誘導(dǎo)GICs凋亡的同時(shí)也引發(fā)自噬的產(chǎn)生，兩種過(guò)程共同決定著GICs的發(fā)展趨勢(shì)。采用自噬抑制劑預(yù)處理后，觀察BA對(duì)GICs細(xì)胞凋亡的影響是目前研究?jī)烧哧P(guān)系的常用方法。關(guān)于BA對(duì)GICs細(xì)胞自噬與凋亡的影響，現(xiàn)有證據(jù)呈現(xiàn)出2種相反的觀點(diǎn)：有的研究[29]發(fā)現(xiàn)自噬被阻斷的情況下，HCC中HepG2細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞的凋亡均受到了抑制，說(shuō)明兩者在HCC中相互協(xié)調(diào)；而另有研究[33]數(shù)據(jù)表明，自噬受阻后，CRC中HCT116、SW480和HT29細(xì)胞的凋亡均得到了增強(qiáng)，說(shuō)明自噬在CRC中主要起保護(hù)性作用。見(jiàn)表4，圖1D。

表4 BA啟動(dòng)GICs細(xì)胞自噬相關(guān)機(jī)制

圖1 BA抗GICs的相關(guān)機(jī)制

5 BA抑制GICs干細(xì)胞

作為具有干細(xì)胞類似特征的癌細(xì)胞亞群，腫瘤干細(xì)胞(CSCs)以其獨(dú)特的自我更新、分化能力與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及耐藥性密切聯(lián)系在一起。GICs中的CSCs于2007年在CRC中被首次報(bào)道[40]，隨后陸續(xù)在各類GICs中被發(fā)現(xiàn)。目前數(shù)據(jù)表明BA對(duì)HCC[13]、PC[41]干細(xì)胞均具有抑制作用。在HCC中，陳飛宇[13]以干細(xì)胞標(biāo)志分子CD44、CD90、CD133和CD326的表達(dá)水平為鑒定依據(jù)，在體外無(wú)血清培養(yǎng)體系中成功富集了HepG2干細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)BA能通過(guò)阻止細(xì)胞周期抑制HepG2干細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，其中高濃度(40 μmol·L-1)BA主要阻滯HepG2干細(xì)胞于S期，而低濃度(10 μmol·L-1)BA將其阻滯于G0/G1期[13]。在PC中以胰腺導(dǎo)管腺癌最為常見(jiàn)，因其細(xì)胞亞群具有干細(xì)胞樣特征，故被稱為胰腺癌干細(xì)胞(PCSCs)，清除PCSCs是治療這種難治性GICs的關(guān)鍵目標(biāo)之一。SUN等[41]研究發(fā)現(xiàn)BA不僅能減少PC中MIA PaCa-2和PANC-1細(xì)胞腫瘤球的形成，還能通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)阻止EMT進(jìn)程進(jìn)而抑制其侵襲與轉(zhuǎn)移，并下調(diào)Sox2、Oct4、Nanog等CSCs標(biāo)志物表達(dá)，抑制其干細(xì)胞特性。由于CSCs在不同GICs中均存在異質(zhì)性，而與CSCs相關(guān)的特異性標(biāo)記物又相對(duì)匱乏，以BA靶向CSCs的腫瘤治療方案還需進(jìn)行大量的研究。

6 BA增敏GICs治療藥物

腫瘤細(xì)胞同時(shí)對(duì)多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象稱為多重藥耐藥性(MDR)。MDR是癌癥治療失敗的主要原因之一，癌癥患者生存率很大程度上取決于腫瘤細(xì)胞MDR的水平[42]。MDR是多種不同機(jī)制共同作用產(chǎn)生的結(jié)果，了解腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR的機(jī)制對(duì)抑制其耐藥性的產(chǎn)生尤為重要。目前研究數(shù)據(jù)表明BA能從促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制突變型p53、促進(jìn)細(xì)胞焦亡以及抑制表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)4個(gè)方面分別降低CSCs中CRC[33,43]、OC[21]、PC[41,44]細(xì)胞的MDR。p53是一個(gè)重要的抑癌基因，參與細(xì)胞的多種生理過(guò)程，大部分癌癥中突變型p53可以幫助細(xì)胞規(guī)避凋亡命運(yùn)，加速腫瘤的進(jìn)展及化療耐藥性的產(chǎn)生，這種現(xiàn)象稱為突變型p53的功能增益(GOF)[45]。BA與阿霉素和5-FU聯(lián)用能明顯抑制CRC中SW-480細(xì)胞內(nèi)突變型p53的表達(dá)并降低其Ser15位點(diǎn)磷酸化的水平，從而改善這類依賴于降解突變型p53蛋白的化療藥物在CRC中的療效[33]。細(xì)胞焦亡是一種新型的PCD方式，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。與細(xì)胞凋亡不同的是，焦亡常伴有細(xì)胞膜溶解的炎癥反應(yīng)。由Caspase-1前體、NLR家族蛋白與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)構(gòu)成的炎癥小體可活化Caspase-1繼而觸發(fā)經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑，對(duì)炎癥小體的準(zhǔn)確調(diào)控有助于GICs的治療以及胃腸道穩(wěn)態(tài)的維持[46]。有研究[21]發(fā)現(xiàn)BA與順鉑聯(lián)用在體內(nèi)外均能促進(jìn)OC中TE-11細(xì)胞炎癥小體的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡并提高其對(duì)順鉑的敏感性；同時(shí)BA聯(lián)合順鉑(DDP)能抑制TE-11細(xì)胞CSCs標(biāo)記物SOX2、OCT4、CD133的表達(dá)，說(shuō)明BA對(duì)順鉑的增敏作用與其抑制CSCs的能力存在聯(lián)系。此外，BA聯(lián)合吉西他濱抑制PC中Panc-1細(xì)胞也與CSCs的抑制有關(guān)[41]。EGFR的過(guò)表達(dá)已在PC中被證實(shí)，然而絕大多數(shù)初期受益于EGFR抑制劑的PC患者終究會(huì)因腫瘤MDR的逐漸形成而失去有效藥物[47]。腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑的耐藥性與STAT3反饋性激活有關(guān)[48]。有研究[44]表明BA可與Panc-1、MIA PaCa-2細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白的Lys-591、Ser-613位點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合，抑制其磷酸化以提高EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)吉非替尼對(duì)PC細(xì)胞的抑制效果。見(jiàn)表5。

表5 BA增敏GIC治療藥物相關(guān)機(jī)制

7 展望

對(duì)正常細(xì)胞的非特異性毒性，如化療導(dǎo)致的肝腎毒性與神經(jīng)累積性病變[49]，以及腫瘤耐藥細(xì)胞的形成是傳統(tǒng)GICs治療的兩大局限性。BA憑借其優(yōu)異的抗腫瘤活性和較低的毒副作用成為了腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，在GICs研究領(lǐng)域內(nèi)更是如此。絕大部分的研究均指出BA在抗GICs上呈劑量依賴性，并不具有明顯的細(xì)胞毒性。此外，BA能從多方面抑制不同GICs細(xì)胞的MDR，這為抗MDR聯(lián)合療法提供了新思路。本文首次對(duì)BA抗GICs機(jī)制進(jìn)行梳理，但目前已完成的關(guān)于BA抗GICs的研究仍有待深入，例如：BA對(duì)GICs細(xì)胞凋亡、自噬以及p53的影響尚存在爭(zhēng)議，對(duì)于BA能否從抑制炎癥反應(yīng)、改善有氧糖酵解以及阻滯腫瘤血管形成等角度抑制GICs的問(wèn)題還沒(méi)有明確解答。綜上所述，BA無(wú)疑具有成為臨床治療GICs的重要藥物的潛力，但其抗腫瘤機(jī)制還有待大量研究進(jìn)一步闡明。