雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化活性分析

邵洋洋，郜海燕，劉瑞玲，李 斌，陳杭君,

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310021）

雙孢菇（Agaricus bisporus）又稱口蘑、白蘑菇、洋蘑菇[1]，是全球生產(chǎn)和消費(fèi)量最高的食用菌[2]，也是我國(guó)生產(chǎn)量最多的食用菌之一[3]。雙孢菇味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富[4]，具有消炎解毒、降低膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈硬化等藥用價(jià)值[5]。但是，在采收與加工過(guò)程中，大量雙孢菇菇柄被切除并丟棄，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。研究發(fā)現(xiàn)，雙孢菇菇柄和菌蓋均含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、核酸、核苷酸等成分[7]，因而可以對(duì)廢棄的菇柄加以綜合利用，進(jìn)一步提高其利用價(jià)值。

酵素主要是以果蔬為原料，經(jīng)過(guò)微生物如酵母、乳酸菌等發(fā)酵，是一種富含礦物質(zhì)、維生素、酶等特定生物活性成分的產(chǎn)品[8]，其能夠有效促進(jìn)新陳代謝，具有預(yù)防衰老、抗菌抗癌、解毒消炎等功能。在發(fā)酵過(guò)程中，益生菌可以將果蔬中的營(yíng)養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、維生素、糖類等通過(guò)代謝轉(zhuǎn)換成氨基酸、酶類、有機(jī)酸等小分子活性物質(zhì)，從而增強(qiáng)果蔬自身的營(yíng)養(yǎng)密度并提高其利用度[9]。劉維兵等[10]以葡萄與海棠果為原材料，利用酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的酵素有一定的抑菌性和抗氧化活性。郭偉峰等[11]研究發(fā)現(xiàn)桑葚酵素飲料的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）酶活力顯著高于桑葚果汁的SOD酶活力。蔣增良等[12]的研究指出，葡萄酵素的還原能力水平、DPPH、超氧陰離子、羥自由基以及ABTS自由基清除能力和酵素濃度之間呈正相關(guān)性。

目前，雙孢菇主要通過(guò)烹飪或以干制的方式被人們食用，菇柄利用以飼料為主，具有很大的局限性。將雙孢菇菇柄進(jìn)行發(fā)酵制成酵素，不僅能夠保持雙孢菇自身的營(yíng)養(yǎng)功能成分還能提高原料的利用率，降低生產(chǎn)成本，此外發(fā)酵生產(chǎn)可以拓寬雙孢菇食用的局限性，提高其附加值[13]。近年來(lái)，酵素產(chǎn)品層出不窮且越來(lái)越受到大眾歡迎，但雙孢菇酵素的工藝優(yōu)化及抗氧化能力研究鮮有報(bào)道。本文以雙孢菇加工中的菇柄為原料，采用植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，研制出一種具有高生物活性的發(fā)酵產(chǎn)物，并評(píng)估其抗氧化能力，繼而為雙孢菇副產(chǎn)物的利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇菇柄 浙江嘉善寧遠(yuǎn)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司；植物乳桿菌（編號(hào)336421） 廣州生物菌種保存中心；福林酚、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、磷酸、鄰菲羅啉、沒(méi)食子酸、3.5-二硝基水楊酸、愈創(chuàng)木酚 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；所有試劑均為分析純。

Awanti J-E 高速離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特（美國(guó)）股份有限公司；MLS-3781L-PC 型高壓蒸汽滅菌器 松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；SPX-250B-G 微電腦光照培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；無(wú)菌超凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；MIR-253 低溫培養(yǎng)箱 日本SANYO 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙孢菇菇柄酵素制備 將新鮮菇柄洗凈，在100 ℃下漂燙2 min，晾干，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳料液比為1:6（W/V），按照此比例進(jìn)行打漿，得到菇柄原液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定加入不同比例的蔗糖與植物乳桿菌在37 ℃條件下發(fā)酵，待發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液過(guò)濾得到菇柄酵素，將其置于4 ℃與25 ℃進(jìn)行貯藏，測(cè)定抗氧化活性。

1.2.2 菌種活化 準(zhǔn)備培養(yǎng)菌種所需的液體培養(yǎng)基（10 g 蛋白胨，10 g 牛肉膏，4 g 酵母粉，20 g 葡萄糖，0.2 g 硫酸鎂，5 g 乙酸鈉，2 g 檸檬酸三銨，2 g 磷酸氫二鉀，0.04 g 硫酸錳，1 g 吐溫80）和2 個(gè)平板。無(wú)菌條件下吸取0.5 mL 液體培養(yǎng)基溶液打入菌種凍干管內(nèi)，混合均勻后再次轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，再吸取0.2 mL 菌懸液進(jìn)行涂布，將涂布完成后的2 個(gè)平板連同液體培養(yǎng)基一起放入37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，得到活菌數(shù)為105~106CFU/mL 的植物乳桿菌懸液。

1.2.3 酵素制備單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 植物乳桿菌接種量 菇柄原液30 mL，糖添加量10%（W/V），分別添加植物乳桿菌1%、2%、3%、4%、5%（V/V）的接種量，于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，樣品發(fā)酵24 h 后即結(jié)束發(fā)酵，然后對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定并測(cè)定總酚含量，考察接種量對(duì)感官評(píng)分與總酚含量的影響。

1.2.3.2 糖添加量 菇柄原液30 mL，植物乳桿菌接種量為3%，分別加入原液體積的0、5%、10%、15%、20%（W/V）的蔗糖，于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，樣品在發(fā)酵24 h 后即結(jié)束發(fā)酵，然后對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定并測(cè)定總酚含量，考察糖添加量對(duì)感官評(píng)分與總酚含量的影響。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間 菇柄原液30 mL，植物乳桿菌接種量3%，加入10%的蔗糖，于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵0、12、24、36、48 h，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)與總酚含量測(cè)定，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分與總酚含量的影響。

以《桂林山水》這篇課文為例，教師可以先提出問(wèn)題，然后采用小組討論的方法讓學(xué)生思考，之后再由每個(gè)小組成員依次匯報(bào)總結(jié)。這樣可以將全員都融合到課堂中來(lái)，也利于提升學(xué)生的語(yǔ)言表達(dá)能力。之后，教師可以采用情境代入法，利用大屏幕或投影儀等多媒體，給學(xué)生播放桂林山水的圖片或視頻，讓學(xué)生直觀地領(lǐng)略到桂林山水的景色，增加感情體驗(yàn)。最后，教師可以組織討論環(huán)節(jié)，討論大家知道的祖國(guó)景觀或人文景點(diǎn)等，再通過(guò)感情渲染激發(fā)出學(xué)生的民族自豪感和愛(ài)國(guó)主義情懷。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、糖添加量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，應(yīng)用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14]，以總酚含量為雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵的響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用Design Expert 12 軟件處理數(shù)據(jù)與回歸分析，從而確定出最優(yōu)的酵素發(fā)酵工藝條件。Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experiment

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 感官評(píng)價(jià) 采用百分制評(píng)分檢驗(yàn)法[15]，選擇5 位男性和5 位女性，年齡在20~30 歲之間的有經(jīng)驗(yàn)品評(píng)者對(duì)加工后成品的色澤、滋味、香氣、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，取均值作為感官評(píng)價(jià)得分。感官評(píng)價(jià)表[13]見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation form

1.2.5.2 總酚含量 參照Folin-Ciocaulten 方法測(cè)定[16]。取1 mL 樣品液于15 mL 的試管中，分別加入1 mL福林酚試劑與3 mL 20% Na2CO3，混勻，在50 ℃水浴反應(yīng)30 min。在765 nm 下測(cè)定吸光度。

1.2.5.3 抗壞血酸含量測(cè)定 參照吳媛媛等[17]的方法測(cè)定。取0.2 g 樣品加入2 mL 50 g/L 的TCA，12000×g 離心10 min，取1 mL 上清液，加入1 mL 的50 g/L 的TCA，然后加入無(wú)水乙醇1.0 mL，混合搖勻后，再加入0.4%磷酸-乙醇溶液，0.5% BP-乙醇溶液，1 mL 0.3 g/L FeCl3-乙醇溶液，在534 nm 處測(cè)定吸光度。

1.2.5.4 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 參考Wang等[18]的方法并加以修改，取1 mL 稀釋5 倍的雙孢菇菇柄酵素樣品稀釋液，加入1 mL 1 mmol/L 的DPPH 混合均勻，暗處?kù)o置30 min，記錄517 nm 處反應(yīng)液吸光度值A(chǔ)1；取1 mL 蒸餾水，1 mL 1 mmol/L 的DPPH 混合均勻，避光靜置30 min，記錄反應(yīng)液吸光度值A(chǔ)0；取1 mL 稀釋樣品，加入1 mL 1 mmol/L 的無(wú)水乙醇，混合均勻，避光靜置30 min，記錄反應(yīng)液吸光度值A(chǔ)2。計(jì)算公式為：

1.2.5.5 ABTS 自由基清除率的測(cè)定 采用Zhang等[19]的方法。將5 mL 7.4 mmol/L ABTS 儲(chǔ)備溶液與88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8混合并靜置12~16 h制備ABTS 工作溶液。用PBS 溶液將ABTS 的工作稀釋，使其在734 nm 處的吸光度值為0.7±0.02。吸取100 μL 稀釋5 倍的試樣上清液與0.5 mL ABTS工作液混勻，樣品于室溫下避光靜置6 min。在734 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.5.6 還原力測(cè)定 參考Liu 等[20]的方法，取0.5 mL稀釋樣品液于10 mL 離心管內(nèi)，然后在試管中加入2.5 mL 0.1 g/mL 鐵氰化鉀混勻，在50 ℃下反應(yīng)30 min 后，繼續(xù)加入2.5 mL 0.1 g/mL 三氯乙酸，混勻后在8000 r/min 條件下離心10 min。取1 mL 離心后的上清液，依次加入1 mL 蒸餾水與0.5 mL 1 g/L三氯化鐵，混勻。以蒸餾水作為對(duì)照，在593 nm 下測(cè)定吸光度值。

1.2.5.7 總抗氧化能力測(cè)定 參考總抗氧化能力（TAOC）測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)以及試劑盒中所帶試劑進(jìn)行測(cè)定，單位U/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)均基于3 個(gè)重復(fù)，采用Design-Expert 12 和Graphpad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制，用SPSS 23.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 植物乳桿菌接種量對(duì)雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響 如圖1 所示，接種量在1%~5%之間時(shí)，感官評(píng)分與總酚含量隨著接種量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，接種量為3%時(shí)，感官評(píng)分與總酚含量達(dá)到最高，分別為84.20 分和1.77 mg/mL；接種量超過(guò)3%后，隨接種量的增加，感官評(píng)分與總酚含量都逐漸下降，下降的原因可能是由于植物乳桿菌接種量不斷增加，導(dǎo)致在相同的時(shí)間內(nèi)糖被完全消耗[21]，雙孢菇菇柄酵素口感較酸。同時(shí)菌體因正常新陳代謝消耗的養(yǎng)分過(guò)多，而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物減少[22]，總酚含量降低，接種量對(duì)酵素的感官品質(zhì)與總酚含量有顯著影響（P＜0.05），故選擇3%的接種量為最佳接種量。

圖1 植物乳桿菌接種量對(duì)菇柄酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響Fig.1 Effect ofLactobacillus plantaruminoculation amount on fermentation quality of stipe enzyme注：不同字母代表同一指標(biāo)不同條件間差異顯著（P＜0.05）；圖2~圖3 同。

2.1.2 糖添加量對(duì)雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

由圖2 可知，在相同的發(fā)酵條件下增加糖添加量，感官評(píng)分與總酚含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)糖添加量為10%時(shí)，感官評(píng)分值最高為84.10 分，總酚含量也達(dá)到最高值為1.78 mg/mL。糖添加量較小時(shí)，酵素的蘑菇氣味較重，口感發(fā)澀，感官評(píng)分較低。當(dāng)植物乳桿菌接種量為3%，糖添加量超過(guò)10%，糖不能夠完全被植物乳桿菌消耗利用，導(dǎo)致酵素偏甜，口感甜膩。糖添加量增加，使pH 升高，從而抑制植物乳桿菌生長(zhǎng)，活菌數(shù)減少[23]，總酚含量下降。因此結(jié)合兩個(gè)指標(biāo)，確定最適糖添加量為10%。

圖2 糖添加量對(duì)菇柄酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of the amount of sugar on fermentation quality of stipe enzyme

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵品質(zhì)的影響

由圖3 可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，感官評(píng)分和總酚含量開(kāi)始上升。發(fā)酵初期時(shí)，酵素具有發(fā)酵的乳酸香味但蘑菇氣味濃重，口感粗糙，感官評(píng)分較低。發(fā)酵12 h 后總酚含量最低。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24 h 時(shí)，感官評(píng)分最高達(dá)到84.70 分，總酚含量達(dá)最高值1.77 mg/mL，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，感官評(píng)分和總酚含量值均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這可能是由于延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，24 h 后植物乳桿菌的密度增加且活性下降，轉(zhuǎn)而消耗營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)物，加快酵素中總酚的氧化分解，致使在24 h 后總酚濃度降低[23]，同時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酵素的酸味濃重且有異味，致使感官評(píng)分下降。因此確定發(fā)酵時(shí)間24 h 為最適發(fā)酵時(shí)間。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菇柄酵素對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation time on fermentation quality of stipe enzyme

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)雙孢菇酵素發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design Expert 12 軟件，對(duì)表3 的數(shù)據(jù)建立二次多元回歸方程為：Y=2.19?0.0252A?0.015B+0.0127 C?0.0392AB+0.2777AC+0.1655BC?0.2858A2?0.084 B2?0.4577C2。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

由表4 可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腇=25.29，P＜0.01，表示該回歸模型極顯著。回歸系數(shù)R2=0.9702>0.9，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.0794>0.05），說(shuō)明響應(yīng)值的97.02%的變化來(lái)自所選變量，擬合度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，表明回歸模型與檢驗(yàn)結(jié)果的擬合程度越高，自變量與響應(yīng)值的關(guān)系顯著[24]。因此，可以利用該模型預(yù)測(cè)上述發(fā)酵條件對(duì)酵素中總酚含量的影響。但并不是意味著R2越大模型的一致性越好，對(duì)于一個(gè)好的統(tǒng)計(jì)模型，模型調(diào)整確定系數(shù)（=0.9318）應(yīng)該與R2相似，以更好地說(shuō)明模型的有效性[25?26]。各項(xiàng)P值小于0.05 時(shí)所對(duì)應(yīng)的工藝條件對(duì)產(chǎn)品總酚含量是有顯著影響的，由表4 可知，一次項(xiàng)A、B、C 均不顯著（P>0.05）；交互項(xiàng)AB（P=0.4053>0.05）不顯著，而B(niǎo)C（P=0.0073＜0.01）、AC（P=0.0004＜0.01）極顯著。F值反映了各因素對(duì)于響應(yīng)值的重要性，A>B>C，對(duì)產(chǎn)品綜合得分的影響大小順序?yàn)椋航臃N量>糖添加量>發(fā)酵時(shí)間。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analyses of variance of regression equation

微生物發(fā)酵可以改變酵素中總酚含量及酚的種類組成[27]，許多研究表明酚類化合物具有很強(qiáng)的自由基清除能力[28?29]，所以酚類物質(zhì)是酵素行業(yè)廣泛測(cè)定的抗氧化指標(biāo)之一。響應(yīng)面和等高線圖都可以直接反應(yīng)各種試驗(yàn)因素間的交互作用，等高線圖也可以反應(yīng)交互影響的大小，圖越趨向橢圓說(shuō)明交互作用就越強(qiáng)[30]。從圖4A 可知，接種量（A）和糖添加量（B）的等高線圖趨于圓形，且響應(yīng)面圖曲面較平，交互作用不明顯，在接種量不變的條件下，總酚含量隨糖添加量的增加而呈先升高后下降的趨勢(shì)，在9%~11%，總酚含量較高，接種量也同單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。由圖4B 可知，接種量（A）與發(fā)酵時(shí)間（C）的等高線圖接近于橢圓型，響應(yīng)面圖曲面陡峭，交互作用顯著，在接種量不變的條件下，總酚含量隨糖添加量的增加而先升高后下降，總酚含量在接種量2.5%~3.5%、發(fā)酵時(shí)間在18~24 h 范圍內(nèi)有最大值。如圖4C 所示，糖添加量（B）與發(fā)酵時(shí)間（C）的等高線圖趨于橢圓，響應(yīng)面圖曲面陡峭，交互作用明顯，在糖添加量不變的條件下，總酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間在18~24 h，總酚含量較高。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface diagram and contour diagram of interaction of various factors

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算得到雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵的最優(yōu)條件為：植物乳桿菌接種量2.95%，糖添加量9.53%，發(fā)酵時(shí)間23.79 h。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)操作，將發(fā)酵條件修改為植物乳桿菌接種量3%，糖添加量9.50%，發(fā)酵時(shí)間24 h，進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，所得總酚含量為（2.20±0.01）mg/mL，與預(yù)測(cè)值2.19 mg/mL 無(wú)明顯差異。以上結(jié)果證實(shí)了該模型能夠充分可靠地優(yōu)化雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵工藝。

2.4 雙孢菇菇柄發(fā)酵前后抗氧化活性的變化

多酚類化合物是蘑菇中主要抗氧化成份之一，它可以防治癌癥、減少心腦血管病變，在保護(hù)健康，抗老化等方面也有著一定的生物學(xué)活性[31]，通過(guò)益生菌的發(fā)酵，雙孢菇菇柄中的多酚類物質(zhì)被轉(zhuǎn)化利用，含量均呈上升趨勢(shì)，在表5 中，雙孢菇菇柄酵素發(fā)酵后總酚含量為2.20 mg/mL，比發(fā)酵前的菇柄原液總酚含量增加了29.41%；抗壞血酸含量為44.40 μg/mL，是發(fā)酵前的1.56 倍。除此以外，DPPH、ABTS 自由基清除率等抗氧化能力也顯著增加（P＜0.05），這與王虹玲等[32]的研究結(jié)果一致。

表5 樣品發(fā)酵前后指標(biāo)對(duì)比Table 5 Comparison of the indexes of samples before and after fermentation

2.5 雙孢菇菇柄酵素貯藏期間抗氧化活性的變化

為分析雙孢菇酵素產(chǎn)品在貯藏期間的抗氧化能力變化，以及最適貯藏溫度，將發(fā)酵完成的雙孢菇菇柄酵素分別置于4 ℃與25 ℃條件下進(jìn)行貯藏，并測(cè)定其貯藏期間DPPH、ABTS 自由基清除率以及鐵離子還原力的變化趨勢(shì)。如圖5A 所示，隨著貯藏時(shí)間的增加，酵素的DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，對(duì)兩組貯藏溫度進(jìn)行比較，25 ℃貯藏的酵素自由基清除率顯著低于4 ℃貯藏（P＜0.05）。貯藏至4 d 時(shí)，4 ℃貯藏的雙孢菇菇柄酵素的DPPH 自由基清除率是25 ℃貯藏的1.11 倍。在貯藏過(guò)程中，ABTS可被活性氧氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的綠色ABTS+·，當(dāng)ABTS+自由基生成過(guò)多或消除速度過(guò)慢時(shí)，會(huì)對(duì)生物體組織造成嚴(yán)重破壞，從而促進(jìn)機(jī)體的老化并引起各類病癥，抗氧化物的存在能夠抑制自由基的產(chǎn)生[33]。如圖5B 所示，雙孢菇酵素的ABTS 自由基清除率均呈下降趨勢(shì)，與DPPH 相同，25 ℃貯藏的酵素自由基清除率顯著低于4 ℃貯藏（P＜0.05）。貯藏至5 d，25 ℃的雙孢菇酵素ABTS 自由基清除率低于35%。這可能是因?yàn)橘A藏時(shí)間延長(zhǎng)，溫度升高，微生物活性降低，使其抗氧化活性降低。李杰等[34]通過(guò)對(duì)核桃青皮果蔬酵素體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，隨著酵素濃度增加，微生物活性增加，其抗氧化能力增加，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。由圖5C 可知，兩組溫度下貯藏樣品的還原力均呈下降趨勢(shì)，貯藏2 d 后，樣品的還原力下降趨勢(shì)變小，兩組貯藏溫度下的雙孢菇菇柄酵素還原力沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。通過(guò)對(duì)圖5D分析可知，兩組溫度下貯藏的樣品總抗氧化能力均呈下降趨勢(shì)，與還原力相同，貯藏2 d 后，樣品總抗氧化能力變化較小，差異不顯著（P>0.05）。

圖5 雙孢菇菇柄酵素在4 ℃與25 ℃貯藏的抗氧化能力變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity ofAgaricus bisporusstipe enzymes stored at 4 ℃ and 25 ℃注：不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同貯藏溫度間差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

雙孢菇菇柄酵素在37 ℃下的最優(yōu)發(fā)酵條件：植物乳桿菌接種量3%、糖添加量9.50%，發(fā)酵時(shí)間24 h。經(jīng)本試驗(yàn)優(yōu)化得到的菇柄酵素口感酸甜適宜，澄清透明，在此條件下得到的酵素總酚含量達(dá)到2.20 mg/mL，比未發(fā)酵樣品提升了29.41%；抗壞血酸含量為44.40 μg/mL，提升了1.56 倍。同時(shí)，對(duì)發(fā)酵后菇柄酵素的抗氧化性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率以及總抗氧化能力顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05），表明通過(guò)現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)，可以制備出具有良好抗氧化活性的酵素產(chǎn)品。將該酵素分別置于4 ℃與25 ℃下進(jìn)行貯藏，進(jìn)一步研究表明，其在貯藏期間的DPPH、ABTS 自由基清除率呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。在貯藏初期，鐵離子還原力與總抗氧化能力下降較快，且酵素的總抗氧化能力隨著貯藏溫度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)不同程度的降低。雙孢菇菇柄酵素的研究開(kāi)發(fā)，有效實(shí)現(xiàn)了廢物利用并減少資源浪費(fèi)，也為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。