培育條件對麥胚中蛋白酶活力及蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

張 瑤，沈海炯, ，楊天一，俞 玥，王東旭，郭元新,

（1.江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212100；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

小麥（Triticum aestivum）是世界上最早、最廣泛栽培的糧食作物，全球約有35%~40%的人口以小麥為主食[1]。我國小麥的年產(chǎn)值為1.1 億噸，可產(chǎn)生麥胚約300 萬噸[2]。小麥籽粒主要由皮層、糊粉層、胚乳和胚芽四個部分組成，胚芽是營養(yǎng)價值最豐富的部分，占籽粒重量的1.5%~2.9%。麥胚富含碳水化合物（約53%，包括蔗糖、棉子糖、果糖和葡萄糖）、蛋白質(zhì)（27.0%~30.5%）、脂肪（10%~15%）、纖維素（1.5%~4.5%）、鈣、鉀、鎂等礦物質(zhì)元素（4%）和少量維生素[3?5]。目前，利用生物技術(shù)深入加工麥胚，并研發(fā)功能性食品是研究熱點，該方法既健康、環(huán)保又經(jīng)濟、高效[6?7]。

麥胚經(jīng)過培育，多種內(nèi)源性酶被激活、釋放，從原來的結(jié)合狀態(tài)逐漸變成了游離狀態(tài)，從而促使麥胚內(nèi)部發(fā)生多種生理生化反應(yīng)[8]。在酶活化的過程中，蛋白酶的活化往往第一個進行。研究人員發(fā)現(xiàn)，麥胚中蛋白酶降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多肽具有明顯的生物活性，如降血壓、抗氧化活性、抗癌、降低膽固醇、抗疲勞等[9?11]。目前，已有諸多研究者報道，適度改變麥胚的培育條件，如溫度、時間、pH、液料比，能夠提高麥胚蛋白酶活力，達到富集功能性多肽的作用。楊潤強等[12]通過響應(yīng)面優(yōu)化麥胚培育條件，發(fā)現(xiàn)時間6 h、溫度49 ℃、培育液中pH3.00 及液料比10:1 為最優(yōu)培育組合，此時麥胚中多肽含量達到88.46 mg/g，是原料麥胚的2.98 倍。同樣的，胡立明等[8]提出，時間4.31 h、溫度45 ℃、pH4.39、液料比為30:1 時，麥胚中肽含量進一步提高，達到169.04 mg/g。余南靜等[13]探究了金屬離子對麥胚中蛋白酶活力、多肽含量的影響，指出ZnSO4（0.60 mmol/L）、MnSO4（2.00 mmol/L）和CaCl2（1.41 mmol/L）對蛋白酶活力具有顯著的正效應(yīng)，酶活力達到385.44 U/g，多肽含量達到49.35 mg/g。通過優(yōu)化培育條件激活麥胚內(nèi)源性蛋白酶、提高肽含量的方式，仍表現(xiàn)出肽含量較低的缺點，限制了其應(yīng)用。

近年來，物理加工方法，如微波[14]、超聲波[15?17]、超臨界萃取[18]等技術(shù)，可有效增強農(nóng)產(chǎn)品的功能特性，擴大其應(yīng)用范圍，逐漸成為了農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)發(fā)展的助推器。其中，微波技術(shù)因具有高效、節(jié)能、操作簡便的優(yōu)點，被廣泛開發(fā)利用。王振斌等[19]研究得出，微波預(yù)處理（功率為1.33 W/mL，時間為5 min）輔助堿性蛋白酶酶解芝麻餅粕，是一種制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽快速高效的方法，半數(shù)抑制劑濃度IC50值為2.81 mg/mL。微波輔助堿提可顯著增大麥胚蛋白的提取率，并提高麥胚蛋白的持水/持油性、乳化性和起泡性[20]。從艷霞等[21]采用微波對壓榨前的菜籽進行處理，發(fā)現(xiàn)菜籽油中多酚含量提高了近120 倍，植物甾醇、維生素E 的含量也有明顯提升。微波技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)中發(fā)揮作用的機制主要來源于其對物料組成成分產(chǎn)生的熱效應(yīng)與非熱效應(yīng)。因此，將微波技術(shù)應(yīng)用于麥胚培育具有研究意義。

本研究以脫脂的麥胚為原料，首先進行微波（600 W，10 s）輔助處理，然后在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化麥胚的培育條件，以提高麥胚內(nèi)源性蛋白酶的活力、達到進一步提高麥胚中肽含量的目的。本文旨在為開發(fā)麥胚多肽富集產(chǎn)品提供新策略，從而促進功能性保健食品的開發(fā)和應(yīng)用、提高麥胚資源的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥麥胚 丹陽市蓮湖面粉有限公司；谷胱甘肽、β-疏基乙醇、酪蛋白 上海麥克林生化科技有限公司；酪氨酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、乙二胺四乙酸、三氯乙酸、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、次氯酸鈉、正己烷 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9070 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5424-R 型高速冷凍離心機 上海土森視覺科技有限公司；PHS-25 型pH 測試儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；U-T3 型紫外可見分光光度計 上海屹譜儀器制造有限公司；BSA124S 電子分析天平 常州市幸運電子設(shè)備有限公司；ZW-bp120 型變頻實驗微波爐 蕪湖眾維教研儀器研發(fā)有限公司；Vortex-m 型旋渦混勻儀 上海滬析實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥胚脫脂處理 稱取50 g 麥胚原料，邊攪拌邊緩慢加入500 mL 正己烷，25 ℃下恒溫振蕩12 h，離心（4000 r/min，5 min）后倒掉上清液，獲得的沉淀物為脫脂麥胚，置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 培育溫度對蛋白酶活力和肽含量的影響稱量1 g 脫脂麥胚，將其放入研缽中，加入10 mL，0.1 mol/L，pH4.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，研磨均勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，微波處理10 s（600 W，預(yù)實驗結(jié)果），然后分別在30、40、50、60、70 ℃下培育6 h，測定蛋白酶活力、肽含量。

1.2.2.2 培育時間對蛋白酶活力和肽含量的影響脫脂麥胚的處理方法同上述

1.2.2.1 一致，然后于50 ℃下分別培育2、4、6、8、10 h，分析蛋白酶活力、肽含量。

1.2.2.3 培育液液料比對蛋白酶活力和肽含量的影響 稱量1 g 脫脂麥胚，將其放入研缽中，分別加入液料比為4:1、7:1、10:1、13:1、16:1 mL/g，pH4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，研磨均勻，微波（600 W，10 s）處理，然后于50 ℃下培育6 h，評定蛋白酶活力及肽含量。

1.2.2.4 培育液pH 對蛋白酶活力和肽含量的影響稱量1 g 脫脂麥胚于研缽中，分別加入10 mL，pH3.0、pH3.6、pH4.2、pH4.8、pH5.4、pH6.0、pH6.6 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，同樣進行研磨、微波處理，然后于50 ℃下培育6 h，測定蛋白酶活力及肽含量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在上述單因素實驗基礎(chǔ)上，以培育溫度（A）、培育時間（B）、pH（C）、液料比（D）為影響因素，以蛋白酶活力、肽含量為響應(yīng)值，選取響應(yīng)值較高的三水平，使用Box-Behnken 設(shè)計方法進行響應(yīng)面試驗。試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案Table 1 Design of response surface test

1.2.4 指標(biāo)的測定

1.2.4.1 蛋白酶活力的測定 蛋白酶活力的測定方法參考Harvey 等[22]，并作適當(dāng)修改。取2.0 mL 培育后的麥胚上清液，加入6.0 mL 磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0，0.02 mol/L，并含5 mmol/Lβ-巰基乙醇、2.5 mmol/L EDTA），冰浴10 min，4 ℃下離心（4200 r/min，30 min），獲得上清液，即為粗蛋白酶液；隨后，取1.0 mL 粗蛋白酶液，以1:1 的體積比加入酪蛋白溶液（20 g/L），于40 ℃下反應(yīng)10 min，沸水?。? min）以滅酶，然后加入2.0 mL 三氯乙酸溶液（0.4 mol/L），室溫下靜置（15 min）以沉淀蛋白質(zhì)，最后離心（4000 r/min，15 min）獲得上清液，并測定上清液在275 nm 下的吸光度。對照組則使用去離子水代替粗蛋白酶液，其余步驟同試驗組一致。使用不同濃度酪氨酸溶液的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0077x，R2=0.9991），用于定量分析樣品中的酪氨酸含量。將1 mL 麥胚粗蛋白酶液催化酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μg 酪氨酸定義為1 個酶活力單位（U）。

1.2.4.2 肽含量的測定 肽含量的測定方法參照魯偉等[23]，并作適當(dāng)修改。取2.5 mL 的麥胚上清液，加入2.5 mL 10%（w/v）三氯乙酸，混勻、靜置10 min，離心（4000 r/min，15min）獲得上清，用5%三氯乙酸定容至50 mL，然后取6.0 mL 上述定容后的溶液，加入4.0 mL 雙縮脲試劑，混勻、靜置10 min，最后離心（2000 r/min，10 min）得上清，在540 nm 下測定吸光度值。對照組則使用去離子水作為麥胚上清液，其余步驟相同。使用還原型谷胱甘肽制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0029x，R2=0.9978），用于定量分析樣品中的肽含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗采取3 組平行，使用SPSS 20.0 軟件進行顯著性分析（P＜0.05），采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken 設(shè)計，顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 培育溫度的影響 由圖1 可知，培育溫度對麥胚蛋白酶活力及肽含量有顯著影響（P＜0.05）。在30~70 ℃間，酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，于50 ℃達到最高酶活力（3075.32 U/g），表明適度的環(huán)境溫度有利于激活麥胚中的蛋白酶，從而促使其活性提高。麥胚中含有天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其中，半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃[24]。溫度影響酶的構(gòu)象，溫度過高時，蛋白酶會發(fā)生變性，其活力下降。培育溫度為50 ℃時，肽含量達到峰值，為196.55 mg/g，與30 ℃相比，提高了18.75%；溫度提高至70 ℃時，肽含量逐漸降低至175.86 mg/g。肽含量的變化趨勢也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，同蛋白酶活力的變化趨勢一致，二者呈正相關(guān)關(guān)系。有諸多研究者指出，發(fā)芽處理型生物調(diào)控技術(shù)可有效增強酶促反應(yīng)，從而提高生物活性物質(zhì)的含量[25?28]。因此，由于麥胚中蛋白酶活性的增強，更多蛋白質(zhì)被水解，從而表現(xiàn)為肽含量的增加。

圖1 培育溫度對麥胚蛋白酶活力及肽含量的影響Fig.1 Influence of incubation temperature on the protease activity and peptide amount of wheat germ注：不同大寫字母表示酶活力差異顯著（P＜0.05），不同小寫字母表示肽含量差異顯著（P＜0.05）；圖2~圖4 同。

2.1.2 培育時間的影響 如圖2 所示，培育時間由2 h 增加至6 h 時，蛋白酶活力升高至3075.32 U/g，當(dāng)培育時間延長至8 h 時，蛋白酶活力明顯下降，當(dāng)培育時間達到10 h 時，其活性繼續(xù)下降，并趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，一定培育溫度下，培育時間過長時，容易導(dǎo)致蛋白酶失活。蛋白質(zhì)的活性極易受環(huán)境影響，如酸堿處理、加熱和發(fā)酵等[29?30]。Zheng 等[31]提出，長時間的高溫環(huán)境顯著降低了一種ACE 抑制六肽（來源于山茶花谷蛋白水解物）的活性。由圖2 可知，麥胚中肽含量隨著培育時間的增加而增加。2~4 h時，肽含量顯著上升（P＜0.05），高于4 h 時，肽含量繼續(xù)上升，但上升速率趨于平緩，至10 h 時，累積至203.45 mg/g。雖然蛋白酶活力在培育6 h 后開始下降，但是肽的生成仍在發(fā)生。肽含量隨著培育時間的增長而動態(tài)累積，最終無明顯變化，達到平衡。

圖2 培育時間對麥胚蛋白酶活力及肽含量的影響Fig.2 Influence of incubation time on the protease activity and peptide amount of wheat germ

2.1.3 培育液液料比的影響 培育液液料比明顯地改變了麥胚中蛋白酶的活力和肽含量。由圖3 可知，液料比為7:1 mL/g 時，蛋白酶活力最高，肽含量也最高；液料比為4:1 mL/g 時，酶活力、肽含量均較低，這可能是由于麥胚中的蛋白酶未能被充分提取。此外，提取液中蛋白質(zhì)濃度過高時，也不利于酶與底物充分接觸并發(fā)生反應(yīng)[12]。當(dāng)液料比提高至10:1、13:1、16:1 mL/g 時，待培育液中蛋白酶的濃度隨著料液比的增大而減小，酶活力（U/g 麥胚）隨之下降，肽含量也隨之降低。王淑芳[32]的研究同樣發(fā)現(xiàn)料液比7:1 mL/g 下，麥胚中肽含量最高，并指出合適的酶濃度、底物濃度對酶反應(yīng)至關(guān)重要。因此，合適的液料比有助于提高酶活、富集麥胚多肽。Huang 等[33]開發(fā)了一種以梯度濃度加入底物牛奶蛋白的方式，大大提高了ACE 抑制肽的產(chǎn)量。

圖3 培育液液料比對麥胚蛋白酶活力及肽含量的影響Fig.3 Effect of the ratio of incubation solution volumes to wheat germ weights on the protease activity and peptide amount

2.1.4 培育液pH 的影響 培育液的pH 對麥胚蛋白酶活力及肽含量的影響如圖4 所示，蛋白酶活力隨著pH（3.0~6.6）的升高而增加。pH4.8 時，肽的含量最高，為213.79 mg/g；當(dāng)pH 低于4.8 時，肽含量隨著pH 的升高而升高，而當(dāng)pH 高于4.8 時，肽含量隨著pH 的升高而下降。楊潤強等[12]指出，麥胚中含有較多的酸性蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等，促使麥胚蛋白提取物在酸性環(huán)境下表現(xiàn)出較強的酶活。酸性環(huán)境下，可以通過提供質(zhì)子以穩(wěn)定酶的過渡態(tài)，達到催化反應(yīng)的目的，從而促使肽的富集[32]。此外，酸性環(huán)境下，高分子量的蛋白質(zhì)存在著酸降解作用。由圖4 可知，培育液pH 接近中性時，肽含量逐漸降低，但總蛋白酶活持續(xù)地上升。麥胚裂解物具有中性蛋白酶活性[34]，而麥胚中中性蛋白酶的水解能力可能低于酸性蛋白酶。

圖4 培育液pH 對麥胚蛋白酶活力及肽含量的影響Fig.4 Effect of pH values of incubation solutions on the protease activity and peptide amount of wheat germ

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 Box-Behnken 設(shè)計 選用四因素三水平進行Box-Behnken 試驗優(yōu)化，該方法設(shè)計和分析了培育溫度、培育時間、培育液pH、培育液液料比四個因素對麥胚蛋白酶活力和肽含量的影響（表2）。對表2中的數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到麥胚酶活力（Y1）及肽含量（Y2）預(yù)測值的二次多項回歸方程：

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計與試驗結(jié)果Table 2 Design of Box-Behnken test and experimental results

Y1=?3649.81+100.47A+145.68B+1197.71C?262.07D?2.42AB?9.15AC+5.01AD?32.73BC+15.49 BD+129.18CD?0.75A2+4.67B2?134.98C2?23.05D2

Y2=?1123.31+14.75A+74.93B+248.17C+71.54 D?0.24AB+0.78AC?0.43AD?7.08BC+0.28BD?4.74 CD?0.14A2?2.19B2?26.76C2?1.29D2

2.2.2 回歸方程方差分析 方差分析結(jié)果表明，蛋白酶活力的回歸模型的F=101.83，P＜0.0001，模型極顯著，R2=0.9903，此模型可解釋99.03%的變異（表3）。肽含量的回歸模型的F=13.58，P＜0.0001，模型極顯著，R2=0.9314，此模型可解釋93.14%的變異（表4）。由表3 可以看出，溫度對酶活力影響顯著（P＜0.05），而pH 和液料比對酶活力的影響極顯著（P＜0.01），影響大小為液料比>pH>溫度>時間，此外，溫度和液料比、pH 和液料比對蛋白酶活力有極顯著的交互作用（P＜0.01）。由表4 可知，培育溫度、培育時間、培育液pH、培育液液料比對麥胚中的肽含量皆有顯著性影響（P＜0.05），其中，時間、pH 和液料比對肽含量的影響極顯著（P＜0.01），并且各因素對肽含量的影響大小為液料比>時間>pH>溫度。

表3 Box-Behnken 設(shè)計中蛋白酶活力的方差分析Table 3 The variance analysis of protease activities by Box-Behnken design

表4 Box-Behnken 設(shè)計中肽含量的方差分析Table 4 The variance analysis of peptide amount by Box-Behnken design

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 由圖5 可知，培育溫度和時間分別固定為50 ℃、4 h，培育pH 和液料比對蛋白酶活力也有明顯的交互作用，不同pH 下，蛋白酶活力隨著液料比的升高而升高，pH 為5.4、液料比10:1 mL/g時，蛋白酶活力最高，為4305.45 U/g。由圖6 得知，當(dāng)pH、時間分別固定為4.8、4 h 時，培育溫度和液料比對蛋白酶活力有明顯的交互作用，不同溫度下，蛋白酶活力隨著液料比的升高而升高，當(dāng)培育溫度為60 ℃、液料比為10:1 mL/g 時，蛋白酶活力最高，達到4018.70 U/g。

圖5 培育液pH 和液料比對麥胚蛋白酶活力的交互作用Fig.5 Interaction of incubation pH and liquid-to-material ratio on the activity of proteases from wheat germ

圖6 培育溫度和液料比對麥胚蛋白酶活力的交互作用Fig.6 Interaction of incubation temperature and liquid-tomaterial ratio on the activity of proteases from wheat germ

由圖7 可以看出，培育溫度和液料比之間對麥胚肽含量的交互作用較為明顯，時間和pH 分別為4 h 和4.8，液料比為4:1 mL/g 時，培育溫度升高，肽含量也升高，液料比7:1 mL/g 時，隨著溫度升高，肽含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)液料比10:1 mL/g、溫度50 ℃時，肽含量最高，約270 mg/g。由圖8 可知，當(dāng)時間和溫度分別為4 h 和50 ℃時，培育液pH和液料比二者的交互作用較為明顯，當(dāng)培育液pH由4.2 增加到5.4 時，肽含量隨著液料比的增加而提高，當(dāng)培育液pH 為4.2，液料比10:1 mL/g 時為最高值，達到297.11 mg/g。

圖7 培育溫度和液料比對麥胚中肽含量的交互作用Fig.7 Interaction of incubation temperature and the ratio of incubation solution volume to the wheat germ weight on the peptide amount

圖8 培育液液料比和pH 對麥胚中肽含量的交互作用Fig.8 Interaction of the ratio of incubation solution volume to the wheat germ weight and pH on the peptide amount

2.2.4 響應(yīng)面模型的優(yōu)化與驗證 通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)培育條件為：培育溫度50 ℃，時間6 h，pH4.5 和液料比10:1 mL/g，通過實驗驗證，得到肽含量為303.12 mg/g，蛋白酶活力為3812.34 U/g。在此條件模型預(yù)測下，肽含量為307.44 mg/g，蛋白酶活力為3860.99 U/g，試驗結(jié)果與預(yù)測值相接近，且顯著（P＜0.05）高于兩組隨機試驗（表2 試驗組5、試驗組24）結(jié)果（表5）。楊潤強等[12]通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的最高麥胚肽含量為88.46 mg/g，而本實驗優(yōu)化培育條件后所得到的肽含量是其3.43 倍。因此，通過響應(yīng)面優(yōu)化培育條件，以富集麥胚肽含量，是切實可行的。

表5 驗證試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Validation of the test design and result

3 結(jié)論

優(yōu)化麥胚培育條件是一種有效富集多肽、提高其應(yīng)用價值的方法。本文實驗結(jié)果表明，培育溫度、培育時間、培育液pH 及培育液液料比對麥胚蛋白酶活力及肽含量有顯著影響（P＜0.05）。通過響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計得到最優(yōu)的培育條件為：培育溫度50 ℃、時間6 h、pH4.5 及液料比10:1 mL/g，在此條件下所得的肽含量及酶活力分別為303.12 mg/g 和3812.34 U/g。此外，麥胚經(jīng)脫脂、微波預(yù)處理，是一種提高孵育麥胚中多肽含量的有效方法，具有進一步的研究價值。本研究為擴大麥胚的應(yīng)用范圍、提高其利用率提供了新的策略。