益生菌發(fā)酵刺麒麟菜制備硫酸多糖工藝優(yōu)化及性質(zhì)分析

張 軍，谷福蝶，劉 艷，周 鈺，劉慶梅,2，劉光明,

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，疑難重癥及罕見(jiàn)病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005）

近年來(lái)，海洋藻類作為豐富且重要的海洋生物資源，因含有糖類、多酚、蛋白質(zhì)等豐富的天然活性物質(zhì)，被廣泛報(bào)道[1?2]。據(jù)《2021 中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2020 年我國(guó)麒麟菜養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)3856 噸，同比2019 年增長(zhǎng)818%。刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）屬于紅藻綱，紅翎菜科，是生產(chǎn)卡拉膠的主要原材料，其富含的硫酸多糖在卡拉膠加工過(guò)程中一直被當(dāng)作廢棄物處理[3]。但硫酸基團(tuán)被認(rèn)為是酸性多糖主要的活性基團(tuán)，硫酸多糖也被證實(shí)具有更高的生物活性[4]，因此富含硫酸基團(tuán)的刺麒麟菜硫酸多糖在食品工業(yè)與醫(yī)藥領(lǐng)域具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

刺麒麟菜硫酸多糖的物理制備方式以熱水浸提和低溫凍融為主，常輔以超聲破碎處理以提高得率，低溫凍融刺麒麟菜硫酸多糖（Low temperature freeze-thawEucheuma spinosumsulfate polysaccharide，L-ESP）對(duì)比熱提多糖粘度降低，溶解性提高，硫酸基團(tuán)保護(hù)較好，但依舊存在著分子量大、生物利用度低等問(wèn)題，往往給進(jìn)一步加工利用帶來(lái)困難。因此，刺麒麟菜硫酸多糖制備方式的開(kāi)發(fā)備受關(guān)注。

益生菌不僅可以生產(chǎn)健康的發(fā)酵食品[5]，益生菌與膳食互作更是被定為2020 年益生菌科學(xué)研究十大熱點(diǎn)之一[6]。有研究報(bào)道，采用益生菌發(fā)酵得到的多糖，生物活性物質(zhì)溶出率顯著提升，分子量降低，更易被腸道吸收[7?8]，其生物活性也優(yōu)于未發(fā)酵多糖[9?11]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是一種益生菌菌株，常作為乳品[12]、飲料[13]、保健食品或飼料的原料或發(fā)酵劑被廣泛使用。Wu 等[14]利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵四種海藻，發(fā)現(xiàn)得到的海藻低聚糖（SwOSLAFP）顯示出更大的還原能力和亞鐵離子螯合能力以及對(duì)過(guò)氧化氫的清除能力，抗氧化活性顯著提高。綜上所述，益生菌發(fā)酵已經(jīng)應(yīng)用于天然多糖的制備，但刺麒麟菜多糖的發(fā)酵制備工藝、性質(zhì)特征、抗過(guò)敏活性以及相關(guān)的構(gòu)效關(guān)系尚不明確。

因此本文利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵刺麒麟菜制備發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖（FermentedEucheuma spinosum、 sulfate polysaccharide，F(xiàn)-ESP），借助Box-Behnken 響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化制備條件，并對(duì)其化學(xué)成分、物理性質(zhì)和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步解析，通過(guò)大鼠嗜堿性粒細(xì)胞（Rat Basophilic Leukemia-2H3，RBL-2H3）經(jīng)典脫顆粒模型初步評(píng)價(jià)其抗過(guò)敏活性，旨在為刺麒麟菜多糖工業(yè)化生產(chǎn)和功能食品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為刺麒麟菜的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺麒麟菜 綠新（福建）食品有限公司；鼠李糖乳桿菌（BNCC185356） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；RBL-2H3 細(xì)胞 上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司；MEM 液體培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone 公司；胎牛血清 美國(guó)Gemini 生物科技公司；臺(tái)氏緩沖液（PB180338） 武漢普諾賽生命科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、DEAE-52 纖維素 北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒 廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；MTT、β-氨基己糖苷酶底物、抗二硝基苯單克隆抗體小鼠抗 美國(guó)sigma 公司；DNPBSA 基因生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

InfiniteM200PRO 酶標(biāo)儀 德國(guó)Tecan 公司；NP80 紫外分光光度計(jì) 德國(guó)IMPLEN 公司；內(nèi)徑0.7~0.8 mm 烏氏粘度計(jì) 上海寶山啟航玻璃儀器廠；Waters 2695 型高效液相色譜 美國(guó)Waters 公司；Forma3111 水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；SG-403 生物安全柜 美國(guó)Baker 公司；Nunc細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Thermo 公司；PhenomPro 臺(tái)式掃描電鏡 美國(guó)Phenomworld 公司；ALPHA 傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖的制備 刺麒麟菜淘洗去除泥沙后于50 ℃烘箱烘干，將干燥后的刺麒麟菜剪碎放入破壁機(jī)粉碎過(guò)100 目篩，置于保鮮盒存放于陰涼干燥處待用。參考Zhang 等[15]的方法稍作修改，將刺麒麟菜菜粉按照一定料液比與超純水混合后，加入2.5%（w/w）的果葡糖漿，然后121 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫后加入適量已活化的鼠李糖乳桿菌，于37 ℃厭氧發(fā)酵，然后100 ℃滅活10 min，于室溫下8000 r/min 離心10 min，收集上清。加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，8000 r/min 離心10 min 得到沉淀，將沉淀復(fù)溶于超純水，冷凍干燥后，即得到發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖。參考陳玉芳等[16]的方法，將刺麒麟菜粉和超純水按照料液比1:90 混合，?18 ℃冷凍2 h，解凍溫度55 ℃，反復(fù)凍融三次，制備冷凍刺麒麟菜多糖作為后續(xù)樣品對(duì)照。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取刺麒麟菜10 g，固定接菌量為4%（v/v），發(fā)酵時(shí)間為24 h，探究料液比（w/v）為1:40、1:50、1:60、1:70，1∶80 時(shí)對(duì)粗多糖得率的影響；固定料液比1:70、發(fā)酵時(shí)間為24 h，探究接菌量為0.5%、1%、2%、4%、8%時(shí)對(duì)粗多糖得率的影響；固定料液比1:70、接菌量4%，探究發(fā)酵6、12、18、24、30 h 時(shí)對(duì)粗多糖得率的影響。粗多糖得率以凍干粗多糖質(zhì)量與菜粉質(zhì)量之比計(jì)算。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖制備工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、接菌量、發(fā)酵時(shí)間為自變量，以發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖得率為響應(yīng)值，以Box-Benhnken 設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），用Design Expert 12 軟件擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，分析回歸方程從而預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Table 1 Factors and level of response surface test design

1.2.4 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的分離純化 按照最佳工藝發(fā)酵得到發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖后，取1 g 按10 mg/mL 復(fù)溶于超純水，上樣于預(yù)裝20 g 的DEAE Cellulose-52 的直徑2.5 cm 的層析柱，恒流泵流速設(shè)置為2 mL/min，依次用0、0.5、1、2 mol/L 的氯化鈉溶液階段洗脫，每管收集5 mL。蒽酮硫酸比色法測(cè)定每管洗脫液在630 nm 處的吸光度，并做出洗脫曲線，收集糖含量較高的部分，3 kDa 透析膜透析72 h，冷凍干燥機(jī)凍干，即得到發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖F-ESP；低溫凍融刺麒麟菜硫酸多糖L-ESP 純化方式同上。

1.2.5 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的化學(xué)組成分析 按照Z(yǔ)hang 等[17]的方法進(jìn)行單糖組成分析；以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品，利用蒽酮硫酸顯色法[18]對(duì)純化后的發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖和低溫凍融刺麒麟菜多糖的總糖含量進(jìn)行測(cè)定；參考趙凱等[19]的方法，利用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量；硫酸根含量參考Yu 等[20]以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)品，利用Dodgson-Price 法[21]進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)含量參考Tang 等[22]采用碧云天BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定；利用鱟試劑內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)內(nèi)毒素含量。

1.2.6 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的物理性質(zhì)分析

1.2.6.1 平均分子量的測(cè)定 參照Gong 等[23]的方法利用高效凝膠滲透法（HPGPC），采用示差檢測(cè)器，配制pH 為6 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按照2%（w/v）的濃度溶于磷酸鹽緩沖液，分別進(jìn)樣于TSK-GELG4000 SWXL 色譜柱，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，對(duì)兩種多糖樣品的純化產(chǎn)物的平均分子量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.2 溶解度的測(cè)定 稱取純化后的凍干樣品200 mg 置于烘干至恒重的15 mL 離心管中，加入10 mL 超純水混合，室溫下振蕩30 min，使多糖樣品充分溶解，將樣液全部轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，定容至刻度線后混勻。吸取10 mL 于8000 r/min 離心10 min，將上清液完全轉(zhuǎn)入稱量瓶中烘干，恢復(fù)至室溫后稱重。按照式（1）計(jì)算：

式中：DSI 溶解度（%）；m0樣品質(zhì)量（g）；m1稱量瓶質(zhì)量（g）；m2烘干樣品+瓶質(zhì)量（g）。

1.2.6.3 比濃粘度的測(cè)定 在25 ℃恒溫條件下，使用內(nèi)徑為0.7~0.8 mm 的烏氏粘度計(jì)測(cè)定濃度為0.5 g/dL 的L-ESP 和F-ESP 的比濃粘度（ηre），參照Liu 等[24]的方法進(jìn)行，每個(gè)樣品獨(dú)立測(cè)定5 次，分別記錄樣液通過(guò)毛細(xì)管的時(shí)間，按照式（2）計(jì)算：

式中：t0純水流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間（s）；t 樣品流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間（s）；η0純水的粘度；ηr相對(duì)粘度；ηsp特性粘度；ηre比濃粘度（dL/g）；C 樣品濃度（g/dL）。

1.2.6.4 掃描電鏡分析 將多糖樣品固定在載物臺(tái)導(dǎo)電膠表面，將載物臺(tái)轉(zhuǎn)移至蒸金室，打開(kāi)真空泵，達(dá)到真空度后，濺射儀噴金90 s，然后在放大倍數(shù)為500×、1000×、3000×條件下進(jìn)行拍照，觀察多糖樣品的微觀形貌。

1.2.7 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜分析 將樣品與干燥的溴化鉀以1:100 比例混合后研磨，經(jīng)手動(dòng)壓片后利用傅里葉紅外光譜儀在400~4000 cm?1進(jìn)行掃描[25]。

1.2.8 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖抗過(guò)敏活性評(píng)價(jià)RBL-2H3 細(xì)胞使用10% FBS-MEM 在5% CO2，37 ℃下培養(yǎng)，并采用MTT 試劑按照說(shuō)明書檢測(cè)不同濃度樣品對(duì)細(xì)胞活力的影響；RBL-2H3 細(xì)胞脫顆粒參考Zhang 等[26]的方法，將RBL-2H3 細(xì)胞計(jì)數(shù)后用10%的FBS-MEM 稀釋，按照5×104個(gè)/孔鋪至96 孔培養(yǎng)板，用終濃度0.1 μg/mL 的anti-DNP-IgE 敏化過(guò)夜，然后PBS 洗滌一次，樣品組加入不同濃度樣品（10、25、50、100 μg/mL）的臺(tái)氏緩沖液100 μL 孵育1 h，然后向陽(yáng)性組和樣品組加入終濃度為0.5 μg/mL的DNP-BSA 激發(fā)，陰性孔加入同體積的PBS 緩沖液，1 h 后收集上清，向板底加入含有0.1% TritionX-100 的臺(tái)氏緩沖液100 μL，裂解5 min，吹打均勻后吸取上清和裂解液各25 μL，置于黑色熒光板，加入100 μL 1.2 mmol/mL 的β-氨基己糖苷酶底物，混勻后37 ℃孵育30 min，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm 條件下的吸光度值。β-氨基己糖苷酶抑制率按照式（3）、（4）計(jì)算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)三次以上，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用SPSS 20.0 軟件中的圖基檢驗(yàn)（Tukeytest）進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1A 所示，料液比不斷增大，粗多糖得率呈現(xiàn)先快速增長(zhǎng)后平緩的趨勢(shì)，分析是因?yàn)榱弦罕仍龃髮?dǎo)致內(nèi)外滲透壓以及溶液飽和度的變化，當(dāng)料液比為1:40 時(shí)溶液極易達(dá)到飽和，且粘稠度高，不易于多糖的進(jìn)一步析出，當(dāng)液體體積不斷增大至1:80，刺麒麟菜粉末與發(fā)酵液接觸面積增大，多糖溶出率也隨之上升，到達(dá)工藝上限。但料液比為1:70 和1:80 時(shí)，多糖得率差異不顯著（P>0.05），因此選擇1:70 作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

圖1B 所示，得率隨著接菌量的增大逐漸升高，接菌量為4%時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)擴(kuò)大至8%時(shí)，得率明顯下降，分析是因?yàn)槭罄钐侨闂U菌能夠以刺麒麟菜中某些糖類為碳源，利用了一部分可代謝的糖，從而導(dǎo)致最終得率的下降，這也印證了刺麒麟菜可能具有益生元特性，也有大量文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道[27?29]。

圖1 料液比（A）、接菌量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖得率的影響Fig.1 Effects of material-liquid ratio(A), inoculation amount(B) and fermentation time(C) on the yield of F-ESP

刺麒麟菜皮層最外2~3 層多為小型薄壁細(xì)胞，內(nèi)容物較少，向內(nèi)逐漸增大[30]，而發(fā)酵前期主要分解了外側(cè)小型薄壁細(xì)胞的初生壁，隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，內(nèi)層較大的薄壁細(xì)胞被分解，大量?jī)?nèi)容物析出，得率顯著提高，如圖1C 所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間不斷增長(zhǎng)至30 h時(shí)得率達(dá)到峰值，但與24 h 差異不顯著（P>0.05）。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖制備工藝

響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù) Box-Benhnken 原理利用DesignExpert 12 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，稱量?jī)龈珊蟮乃泄绦挝锊⒂?jì)算多糖得率，結(jié)果如表2 所示。

采用Design-Expert 12 軟件對(duì)表2 結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到多糖得率對(duì)料液比（A）、接菌量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型：

表2 發(fā)酵制備刺麒麟菜硫酸多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface for preparation of F-ESP

Y= 40.00+2A+2.03B+0.6038C?1.75AB?1.87AC?0.0475BC?3.49A2?4.71B2?2.04C2

如表3 所示，相關(guān)系數(shù)R2為模型與總和的比值=272.80/281.95=0.9675，表示模型擬合性能良好，且失擬檢驗(yàn)P值大于0.05，表明模型未失擬，模型P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，說(shuō)明各因素與響應(yīng)值的線性關(guān)系十分顯著，模型F值為23.20，說(shuō)明該模型有意義，上述結(jié)果表明回歸二次模型建立成功，可用于評(píng)價(jià)發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的工藝條件。根據(jù)ANOVA 分析數(shù)據(jù)差異項(xiàng)，接菌量和液料比的變化對(duì)多糖得率的影響顯著差異（P＜0.01），根據(jù)各因素的F值判斷主次因素并進(jìn)行排序：接菌量>液料比>發(fā)酵時(shí)間。綜合上述數(shù)據(jù)和分析，擬合出發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖最佳工藝條件為料液比1:72.3、接菌量5.5%、發(fā)酵時(shí)間24.2 h，預(yù)測(cè)值為40.41%。為便于操作，條件參數(shù)設(shè)置為料液比1:70，接菌量5%，發(fā)酵時(shí)間24 h，按照該條件獨(dú)立重復(fù)制備三次的粗多糖得率均值為41.70%±2.0%，與預(yù)測(cè)值相符合，且顯著大于凍融法的得率（33.52%±2.71%）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

如圖2 所示，響應(yīng)曲面映射在等高線上的圖形越接近橢圓表明差異越顯著，越接近圓越不顯著。

圖2 各因素對(duì)發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖得率交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors on the yield of F-ESP注：A 為料液比-發(fā)酵時(shí)間，B 為接菌量-料液比，C 為發(fā)酵時(shí)間-接菌量。

根據(jù)表3 和圖2A 結(jié)合判斷，料液比和發(fā)酵時(shí)間相互作用顯著（P＜0.05），分析可能是因?yàn)榱弦罕纫欢〞r(shí)，發(fā)酵時(shí)間的增加導(dǎo)致多糖的逐漸溶出，使得多糖得率先增加再平緩，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，料液比同樣決定了多糖的溶出量以及刺麒麟菜纖維內(nèi)部和溶液的濃度差；圖2B 可以看出料液比與接菌量的響應(yīng)曲面較陡峭，結(jié)合表3 中可知AB 交互項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響顯著（P＜0.05），說(shuō)明料液比與接菌量的交互作用對(duì)多糖得率影響較大；接菌量和發(fā)酵時(shí)間的等高線圖曲面比較平緩（圖2C），交互作用不顯著（P>0.05）。

2.3 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的分離純化

如圖3 所示，圖3A 為凍融法制備的L-ESP 洗脫曲線，圖3B 為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵制備的F-ESP 洗脫曲線，將兩種粗多糖上樣于DEAE-52 層析柱，經(jīng)過(guò)0、0.5、1、2 mol/L 的NaCl 溶液階段洗脫，測(cè)定總糖含量繪制洗脫曲線，各得到3 個(gè)組分，命名為L(zhǎng)ESP-1、L-ESP-2、L-ESP-3，F(xiàn)-ESP-1、F-ESP-2、FESP-3。據(jù)報(bào)道硫酸根的存在能夠顯著提高植物多糖的生物活性[31]，因此對(duì)三個(gè)組分的硫酸根含量進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合得率選取L-ESP-3 和F-ESP-3 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品。

圖3 L-ESP（A）和F-ESP（B）的DEAE-52 洗脫曲線Fig.3 DEAE-52 elution curves of L-ESP (A) and F-ESP(B)

2.4 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的化學(xué)成分分析

將L-ESP-3 與F-ESP-3 經(jīng)三氟乙酸水解后還原乙?；玫接糜跈z測(cè)的糖醇乙酰酯衍生物，利用氣相色譜法進(jìn)行單糖組成的檢測(cè)。取九個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合處理后測(cè)得標(biāo)品的氣相色譜圖，如圖4 所示，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比發(fā)現(xiàn)：L-ESP-3 主要成分為半乳糖（91.14%）、含少量木糖（1.53%）與葡萄糖（7.33%），F(xiàn)-ESP-3 在儀器精度范圍內(nèi)只檢出半乳糖，未檢出其他單糖。說(shuō)明鼠李糖乳桿菌發(fā)酵消耗了葡萄糖并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為半乳糖，改變了F-ESP-3 的單糖組成。Gao 等[32]同樣發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌發(fā)酵使苦瓜中葡萄糖含量降低，半乳糖含量升高。

圖4 L-ESP-3 及F-ESP-3 單糖組成的氣相色譜圖Fig.4 GC of monosaccharide composition of L-ESP-3 and F-ESP-3注：標(biāo)準(zhǔn)品：1.鼠李糖，2.巖藻糖，3.阿拉伯糖，4.木糖，5.甘露糖，6.葡萄糖，7.半乳糖，8.葡萄糖醛酸，9.半乳糖醛酸。

如表4 所示，L-ESP-3 與F-ESP-3 的總糖含量均達(dá)到98%左右，證明兩種方法均得到了純度較高的刺麒麟菜硫酸多糖，F(xiàn)-ESP-3 的還原糖含量為7.87%±0.09%較L-ESP-3（1.45%±0.10%）極顯著提升（P＜0.01）；二者硫酸根含量分別為28.76%±2.23%和28.40%±1.40%，硫酸根結(jié)構(gòu)均未被破壞，說(shuō)明這兩種方法均能夠保護(hù)多糖的硫酸根。同時(shí)發(fā)酵法還提高了刺麒麟菜硫酸多糖中還原糖的比例，乳酸菌發(fā)酵的酸性環(huán)境有效去除一部分蛋白質(zhì)，且內(nèi)毒素含量小于0.03 EU/mg，符合中華人民共和國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)[33]。

表4 刺麒麟菜硫酸多糖化學(xué)組成成分表Table 4 Chemical composition ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides

2.5 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的物理性質(zhì)分析

分子量測(cè)定結(jié)果如圖5 所示，L-ESP-3 分子量大于670 kD，與陳玉芳等[16]得到的刺麒麟菜多糖分子量相似（690.12 kD）；F-ESP-3 的分子量為33.58 kD明顯降低，分析可能是因?yàn)槭罄钐侨闂U菌屬于乳酸菌，乳酸菌在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生大量胞外酶系，如纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等，這些非特異性酶能夠隨機(jī)降解多糖糖苷鍵[34]。同時(shí)也有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為發(fā)酵的酸性環(huán)境能夠使復(fù)雜多聚糖水解為低聚糖，導(dǎo)致分子量進(jìn)一步降低[35]。孫菁雯[36]利用發(fā)酵復(fù)合酶解法制備的銅藻和龍須菜多糖＜3 kD 的組分含量上升，表明多糖被降解，本研究獲得了相似的結(jié)果。

圖5 刺麒麟菜硫酸多糖的分子量分布圖Fig.5 Molecular weight distribution of sulfated polysaccharides fromEucheuma spinosum

經(jīng)計(jì)算，L-ESP-3 溶解度為56.51%±3.8%，F(xiàn)-ESP-3 的溶解度為89.33%±3.1%；L-ESP-3 和F-ESP-3 的比濃粘度分別為3.85±0.25 dL/g 和0.01±0.002 dL/g（P＜0.01），由此可知，益生菌發(fā)酵法制備的刺麒麟菜多糖黏度極顯著降低，溶解度極顯著提高。有研究表明聚合物溶液的粘度較高的原因在于當(dāng)分子鏈長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于溶劑分子，加上溶劑化作用，使其在流動(dòng)時(shí)受到較大的內(nèi)摩擦阻力，分子量大，分子鏈纏結(jié)越嚴(yán)重，使流動(dòng)阻力變大，粘度升高[37]。所以分子量的降低可能是F-ESP 黏度降低的主要影響因素。

如圖6 所示，L-ESP-3 的微觀結(jié)構(gòu)整體呈片狀，3000 倍放大后，可以看到結(jié)構(gòu)非常完整且表面光滑致密，而F-ESP-3 微觀結(jié)構(gòu)截然不同，呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀，3000 倍放大后，發(fā)現(xiàn)表面粗糙有裂紋，內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有大量孔隙。刺麒麟菜多糖作為卡拉膠多糖的一種，屬于天然高分子凝膠，有研究報(bào)道，天然高分子凝膠的表面粗糙度增加可能是因?yàn)樘擎滈g一般通過(guò)氫鍵連接，當(dāng)糖苷鍵斷裂后，導(dǎo)致糖鏈間氫鍵交聯(lián)密度變小，疇結(jié)構(gòu)變大[38]。

圖6 刺麒麟菜硫酸多糖的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope picture ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharide

2.6 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜分析

如圖7 所示，在特征譜帶區(qū)3450 cm?1為O-H的伸縮振動(dòng)，2923 cm?1為C-H 的伸縮振動(dòng)[39]，這部分為多糖類的特征吸收，1641 cm?1為C=O 的特征吸收[40]，在指紋區(qū)1249 cm?1為O=S=O 的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明該多糖含有硫酸酯基[41]，在1071cm?1處的特征吸收說(shuō)明在主鏈中存在吡喃半乳糖，929 cm?1為C-O 上的3,6 內(nèi)醚半乳糖殘基的特征吸收[42]；846 cm?1為吡喃糖環(huán)C4 上的C-O-SO3的特征吸收[43]，成苷的半縮醛羥基為α構(gòu)型[44]，804 cm?1為吡喃糖環(huán)C2 上的C-O-SO3的特征吸收[43]，這與ι-卡拉膠的特征光譜相似[45]。綜上所述，兩種方式制備的多糖結(jié)構(gòu)相似，發(fā)酵并未改變多糖的糖鏈結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ESP-3 是一種含3,6 內(nèi)醚半乳糖殘基的α硫酸吡喃糖。

圖7 刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides

2.7 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的抗過(guò)敏活性評(píng)價(jià)

如圖8 所示，在10~400 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，LESP-3 和F-ESP-3 均無(wú)明顯細(xì)胞毒性，且RBL-2H3細(xì)胞活力均在90%以上，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響（P>0.05）。

圖8 刺麒麟菜硫酸多糖對(duì)RBL-2H3 細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effect of polysaccharide sulfate fromEucheumaspinosumon the viability of RBL-2H3 cells

肥大細(xì)胞在效應(yīng)階段受到致敏原刺激后脫顆粒，β-氨基己糖苷酶的大量釋放是肥大細(xì)胞脫顆粒的經(jīng)典標(biāo)志，可以引發(fā)體內(nèi)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，而抑制β-氨基己糖苷酶釋放可以有效緩解過(guò)敏癥狀[46]。大鼠嗜堿性粒細(xì)胞與肥大細(xì)胞相似，受抗原刺激同樣釋放β-氨基己糖苷酶，并被廣泛用作在細(xì)胞水平上研究過(guò)敏反應(yīng)的替代和可靠模型[47]。如表5 所示，L-ESP-3 和F-ESP-3 兩個(gè)樣品組均可以抑制β-氨基己糖苷酶的釋放，抑制率均大于30%，呈濃度依賴，但F-ESP-3 較L-ESP-3 展現(xiàn)出更好的抑制活性，說(shuō)明發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖通過(guò)抑制β-氨基己糖苷酶的釋放進(jìn)一步發(fā)揮抗過(guò)敏活性。

表5 刺麒麟菜硫酸多糖抑制β-氨基己糖苷酶釋放的活性評(píng)價(jià)Table 5 The activity ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides in inhibiting the release ofβ-hexosaminidase

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵制備刺麒麟菜粗多糖最佳條件為：料液比1:70，接菌量5%，發(fā)酵時(shí)間24 h，主次因素排序?yàn)榻泳?液料比>發(fā)酵時(shí)間，最佳條件下粗多糖得率為41.70%±2.00%；純化后的F-ESP-3 總糖含量為97.77%±1.1%，主要單糖成分為半乳糖，硫酸根含量為28.40%±1.40%，F(xiàn)-ESP-3 還原糖含量（7.87%±0.09%）對(duì)比L-ESP-3 的還原糖含量（1.45%±0.10%）極顯著提高（P＜0.01）；F-ESP-3 分子量（33.58 kD）較L-ESP-3（>670 kD）極顯著降低（P＜0.01），溶解度為（89.33%±3.1%）對(duì)比L-ESP-3 的溶解度（56.51%±3.8%）極顯著提高（P＜0.01），在相同濃度下，F(xiàn)-ESP-3 的比濃粘度為（0.01±0.002 dL/g）對(duì)比L-ESP-3 的比濃粘度（3.85±0.25 dL/g）極顯著降低（P＜0.01）；二者在微觀形態(tài)上，L-ESP-3 呈現(xiàn)均勻片狀結(jié)構(gòu)，表面光滑結(jié)構(gòu)致密，而F-ESP-3 呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀，表面粗糙且內(nèi)部具有孔隙結(jié)構(gòu)；紅外結(jié)構(gòu)上二者較為相似，均含有硫酸酯基和3,6 內(nèi)醚半乳糖殘基，成環(huán)方式為α構(gòu)型吡喃糖環(huán)，指紋區(qū)呈現(xiàn)ι-卡拉膠型多糖的特征吸收。同時(shí)F-ESP-3 的β-氨基己糖苷酶抑制活性高于L-ESP-3，呈濃度依賴。

綜上所述，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的方式并沒(méi)有破壞多糖的鏈環(huán)結(jié)構(gòu)和硫酸基團(tuán)，因?yàn)槎嗵堑姆肿恿亢臀⒂^結(jié)構(gòu)的疏松多孔化，導(dǎo)致多糖骨架鏈間的氫鍵相互作用改變，親水基團(tuán)外露，分散性能提高，從而提高溶解度，降低粘度。同時(shí)，分子量的降低進(jìn)一步提高了F-ESP-3 透過(guò)細(xì)胞膜的能力，提高了生物利用度，從而更好地抑制RBL-2H3 細(xì)胞釋放β-氨基己糖苷酶，展現(xiàn)出良好的抗過(guò)敏活性。由于發(fā)酵多糖的糖苷鍵連接方式、空間構(gòu)象、取代基團(tuán)之間的非共價(jià)相互作用及抗過(guò)敏具體作用機(jī)理尚不清楚，因此對(duì)于發(fā)酵多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)和抗過(guò)敏活性之間的關(guān)系以及抗過(guò)敏作用靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步深入研究。