低共熔溶劑提取的黃精多糖性質(zhì)分析

劉 旭，孟繼坤，葛鑫會，張 楠，裴海生，張秀清,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究所，北京 100121）

黃精為百合科植物，其根莖是中國的傳統(tǒng)藥品，味甘性平，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功效；2017 年成為新資源食品之一，含有多種營養(yǎng)成分，包括多糖、蛋白質(zhì)、維生素等，生食、燉服、曬干食用均可。黃精主要分為雞頭黃精（Polygonatum sibiricum）、滇黃精（Polygonatum kingianum）和多花黃精（Polygonatum cyrtonema）。從黃精中分離出多種化合物，包括甾體皂苷類、三萜皂苷類、異黃酮類、生物堿類、木質(zhì)素類、苯乙肉桂類、多糖和凝集素等[1]。黃精多糖是黃精的主要活性成分之一，具有抗氧化[2?4]、調(diào)節(jié)糖脂代謝[5?7]、調(diào)節(jié)免疫[8?9]、抗衰老[10]等活性。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs）是一種新型的綠色溶劑[11]，呈弱酸性，有助于分解植物細胞壁中的木質(zhì)素及纖維素，促進植物活性物質(zhì)的溶出[12]，已被成功應(yīng)用于植物活性成分的萃取過程中，對天然活性成分表現(xiàn)出高效的提取效果[13?16]。尤其是隨著溫度的升高，DESs 粘度降低[17]，更有利于植物多糖的提取，但高溫對DESs 提取黃精多糖的影響機制還有待研究。

在前期研究中，本團隊優(yōu)化了低共熔溶劑提取黃精多糖的工藝，多糖得率大大提高。70 ℃時低共熔溶劑提取的黃精多糖得率為18%，相比于水提黃精多糖提高了36%。本實驗主要研究低共熔溶劑提取的黃精多糖的性質(zhì)和活性，尤其是對不同溫度條件下提取的黃精多糖相對分子量、單糖組成等性質(zhì)和體外抗氧化活性進行對比分析，為低共熔溶劑提取黃精多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞頭黃精 湖北省十堰市丹江口市武當山基地；氯化膽堿 上海國藥控股化學試劑有限公司；草酸 國藥集團化學試劑有限公司；總抗氧化能力試劑盒 南京建成生物工程研究所；無水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、磷酸、苯酚、葡萄糖 北京化工廠；甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖 標準品，純度≥99%，Sigma 公司。

Agilent1200 高效液相色譜儀（配有示差檢測器和B.03.01 色譜工作站） 安捷倫科技有限公司；島津LC-20AD 液相色譜儀 島津有限公司；FD-2A 冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TU-1810PU 紫外分光光度計 北京普析通用儀器廠；TG16-WS 臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精多糖的提取與制備

1.2.1.1 黃精預(yù)處理 取黃精60 ℃干燥6 h，粉碎并過60 目篩。取粉末0.5 g，加入80%乙醇25 mL混勻，超聲30 min，4000 r/min 離心10 min，用80%乙醇洗滌沉淀2~3 次，得到黃精沉淀，備用。

1.2.1.2 水提醇沉法提取黃精多糖 參考《中國藥典》方法，略有改動。取黃精沉淀按1:50（g/mL）的料液比加入蒸餾水，沸水回流2 h。趁熱過濾，保留濾渣備用。濃縮濾液，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置12 h，離心后取沉淀凍干，得到黃精粗多糖WPSP。

1.2.1.3 DESs 法提取黃精多糖 參考汪濤等[18]的實驗方法，略有改動。將氯化膽堿和草酸按摩爾比1:1 加熱混合形成DESs，冷卻后保存?zhèn)溆?。取黃精按1:20（g/mL）料液比加入DESs，溫度70 ℃條件下反應(yīng)40 min，過濾后取濾液濃縮，加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置12 h，離心后取沉淀凍干，得到黃精粗多糖DPSP。為研究低共熔溶劑極端提取條件對黃精多糖性質(zhì)的影響，將提取溫度提高至100 ℃，按前面操作得到黃精粗多糖HDPSP。

1.2.1.4 DESs 法處理WPSP 取1 g WPSP 按1:20（g/mL）料液比加入DESs，溫度70 ℃，反應(yīng)40 min，過濾后取濾液濃縮，加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置12 h，離心后取沉淀凍干，得到黃精粗多糖DESWPSP。

1.2.1.5 DESs 法處理濾渣 取1.2.1.2 中的濾渣1 g，采用同1.2.1.4 的方法處理，得到黃精粗多糖DESRPSP。

1.2.2 黃精多糖性質(zhì)的測定

1.2.2.1 多糖含量的測定 采用苯酚硫酸法[19]。準確吸取0.1 mg/mL 葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分別置于比色試管中，加蒸餾水補至1.0 mL。各加入5%苯酚1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，搖勻，冷卻后于490 nm 條件下測定其吸光值，以水作空白試驗，繪制標準曲線，并求得標準線性方程為：y=8.8071x+0.0005，R2=0.9998。取1 mg/mL 樣品溶液1.0 mL 采用上述方法測定樣品吸光值后，代入標準線性方程計算多糖含量。

1.2.2.2 還原糖含量的測定 參考黃小蘭等[20]的方法，繪制標準曲線，并求得標準線性方程為：y=8.8071x+0.0005，R2=0.9998。多糖樣品以同樣方法測還原糖含量。

1.2.2.3 多糖相對分子量的測定 參考黃奕誠等[21]的方法，略加改動。采用示差折光檢測器，安捷倫水相GPC/SEC 色譜柱PL aquagel-OH MIXED-M （8 μm,300 mm×7.5 mm），流動相為水，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，1 mg/mL 樣品溶液過0.22 μm 濾膜后進樣，進樣量為20 μL。以保留時間為橫坐標，lgMw為縱坐標繪制標準曲線，并求得標準線性方程為：y=?1.0984x+13.66，R2=0.9925。

1.2.2.4 單糖組成的測定 參考周彥強等[22]和張璐等[23]的實驗條件，略加改動。儀器為島津LC-20AD，色譜柱為Xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，進樣量為20 μL，流動相為0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液：乙腈=83:17。精確吸取50 μg/mL 混合對照標準品溶液（甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖）250 μL，加入0.6 mol/L NaOH 溶液250 μL、0.4 mol/L 的PMP-甲醇500 μL，70 ℃反應(yīng)1 h。冷卻后加入0.3 mol/L HCl 500 μL、1 mL 氯仿混勻，離心后取上清，萃取3 次。上清用于HPLC。樣品測定方法與標準品相同。

1.2.3 多糖抗氧化活性的測定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考Wang等[24]的實驗方法并略加改動。取500 μL 不同濃度的WPSP、DPSP 和HDPSP 溶液（0.5~3.0 mg/mL），加入0.1 mg/mL DPPH 乙醇溶液500 μL，混勻后黑暗中放置30 min，于517 nm 處測吸光度值A(chǔ)1；以無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液進行實驗，測定樣品溶液本底的吸光度值A(chǔ)2；以蒸餾水代替樣品進行實驗，測定空白對照組的吸光度值A(chǔ)0。DPPH 自由基的清除率為：

1.2.3.2 羥基自由基清除能力的測定 參考Ling 等[25]的實驗方法并略加改動。取500 μL 不同濃度的WPSP、DPSP 和HDPSP 溶液（0.5~3.0 mg/mL），加入2 mg/mL FeSO4溶 液150 μL、1% H2O2溶 液500 μL、1.5 mg/mL 水楊酸乙醇溶液500 μL 混勻，37 ℃水浴1 h，于526 nm 處測定吸光度值B1；以無水乙醇代替水楊酸乙醇溶液進行實驗，測定樣品溶液本底的吸光度值B2；以蒸餾水代替樣品進行實驗，測定空白對照組的吸光度值B0。羥基自由基清除率為：

1.2.3.3 總抗氧化能力（T-AOC）的測定 參照總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒中的操作方法：依次加入試劑一1 mL、0.5 mL 不同濃度的WPSP、DPSP和HDPSP 溶液（0.5~3.0 mg/mL）、試劑二應(yīng)用液2 mL、試劑三應(yīng)用液0.5 mL 混勻，37 ℃水浴30 min，加入0.1 mL 的試劑四混勻，靜置10 min，于波長520 nm 處測定各管吸光度值。以蒸餾水替代樣品溶液，同樣步驟加入試劑一至四，測定，為對照管吸光度值。

式中：在37 ℃時每分鐘每毫克多糖使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01 時為1 U；對照管的吸光度記為C0；樣品管的吸光度記為C1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 20 軟件進行處理，結(jié)果均用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取黃精多糖得率的比較

傳統(tǒng)水提醇沉提取的多糖（WPSP）、70 ℃條件下DESs 法提取的多糖（DPSP）和100 ℃條件DESs法提取的多糖（HDPSP）的得率和還原糖含量如圖1所示。70 ℃低共熔溶劑法提取黃精多糖得率為18%，相較于傳統(tǒng)水提醇沉法得率提高了36%；且DPSP的還原糖含量比WPSP 提高了77%，這可能是由于低共熔溶劑對多糖分子長鏈具有打斷作用，產(chǎn)生了更多的低分子量多糖或者有更多的還原性基團暴露出來，從而引起還原性末端含量升高。但是100 ℃ 條件下低共熔溶劑法提取得到的黃精多糖HDPSP 得率和還原糖含量都有所降低，其機理尚不清晰。

圖1 提取方法對還原糖含量（A）和得率（B）的影響Fig.1 Effects of extraction methods on reducing sugar content(A) and yield (B)

2.2 不同方法提取黃精多糖分子量的比較

為了研究DESs 對多糖的作用，在WPSP、DPSD、HDPSP 之外，用DESs 處理WPSP 后得到了多糖DES-WPSP，用DESs 處理傳統(tǒng)水提多糖剩余的渣滓得到了多糖DES-RPSP。5 種黃精多糖的GPC 分子量測定保留時間-信號圖如圖2 所示，分子量匯總結(jié)果如表1 所示。通過B、C、D 和A 的對比，峰a、b的含量變少甚至消失，并出現(xiàn)新的峰c，說明DESs處理對黃精多糖具有降低分子量的作用。而且通過C、D 的對比發(fā)現(xiàn)沒有新增加的峰且峰形相似，說明DESs 法可以進一步將黃精渣滓內(nèi)剩余的多糖RPSP更充分地提取出來。E 是多糖HDPSP 的GPC 分子量測定結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)分子量較為集中，分子量為4.8 kDa。

圖2 黃精多糖的GPC 分子量檢測圖Fig.2 GPC molecular weight detection diagram ofPolygonatum sibiricumpolysaccharides注：A、B、C、D、E 分別是WPSP、DPSP、DES-WPSP、DESRPSP、HDPSP 的GPC 分子量測定曲線；線a、b、c、d 處所代表 的 相 對 分 子 量 分 別 是1.01×108、4.22×106、8.50×103、4.06×103Da；峰e、f 分別是氯化膽堿峰和草酸GPC 峰。

表1 不同處理條件下黃精多糖的分子量Table 1 Molecular weight ofPolygonatum sibiricumpolysaccharide under different treatment conditions

2.3 不同方法提取黃精多糖單糖組成的比較

為了研究DESs 提取對黃精多糖單糖組成的影響，本實驗對WPSP、DPSP、HDPSP、DES-WPSP、DES-RPSP 多糖的單糖組成進行分析比較，結(jié)果如表2。這幾種多糖的單糖組成以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主要成分，還含有鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等。經(jīng)過DESs 處理的多糖相較于水提醇沉法得到的多糖在單糖組成上差異明顯。由于DESWPSP 為DESs 直接降解多糖、DPSP 為邊提取黃精多糖邊降解多糖、DES-RPSP 為邊提取黃精渣滓多糖邊降解多糖，按照此順序，隨著體系中多糖與DESs接觸面積比例的減小，甘露糖含量逐漸降低，DESRPSP 的甘露糖含量為4.04%；半乳糖含量逐漸升高，DES-RPSP 的半乳糖含量為72.85%。HDPSP 的單糖組成變化最為明顯，除葡萄糖及其醛酸含量升高及核糖、木糖含量基本不變外，其他的單糖含量均降低，可能是因為低共熔溶劑劇烈的降解作用引起了單糖的丟失，導(dǎo)致這些單糖含量降低。

表2 五種黃精多糖中單糖組分含量的比較（%）Table 2 Comparison of five kinds of PSPs’ monosaccharides components(%)

2.4 不同方法提取黃精多糖體外抗氧化活性的比較

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 DPPH 分析法是用來篩選自由基清除劑和判斷抗氧化活性的常見方法，抗氧化劑的清除能力可以用DPPH 自由基半數(shù)清除率（IC50值）時抗氧化劑的濃度來表示。對WPSP、DPSP、HDPSP 的DPPH 自由基清除能力進行測定，結(jié)果如圖3。在0.5~3.0 mg/mL 的范圍內(nèi)，DPSP和HDPSP 的DPPH 自由基清除率隨濃度的提高而增強，且在此范圍內(nèi)，DPSP 的清除能力都比同濃度下的WPSP 和HDPSP 高。WPSP、DPSP、HDPSP的半數(shù)清除率分別是3.89、2.50、15.63 mg/mL，即DPPH 自由基的清除能力從高到低依次是DPSP、WPSP、HDPSP。

圖3 三種黃精多糖對DPPH 自由基清除能力的比較Fig.3 Comparison of DPPH radical scavenging ability of threePolygonatum sibiricumpolysaccharides

2.4.2 羥自由基清除能力 利用Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，通過對比羥自由基清除率來反映抗氧化劑的抗氧化能力。三種多糖WPSP、DPSP、HDPSP 對羥自由基清除能力如下圖4 所示。在0.5~3.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，多糖對羥自由基清除能力隨濃度的升高而增強。WPSP、DPSP、HDPSP 對羥自由基半數(shù)清除率分別是8.87、4.70、11.18 mg/mL，即羥自由基清除能力從高到低依次是DPSP、WPSP、HDPSP。

圖4 三種黃精多糖對羥自由基清除能力的比較Fig.4 Comparison of hydroxyl radical scavenging ability of threePolygonatum sibiricumpolysaccharides

2.4.3 總抗氧化能力 采用T-AOC 法測得三種多糖WPSP、DPSP、HDPSP 總抗氧化能力如下圖5 所示。隨著多糖濃度的升高，多糖的總抗氧化能力增強。當濃度為3.0 mg/mL 時，DPSP 的總抗氧化能力為4.5 U/mL，是WPSP 的4.3 倍，是HDPSP 的7.4 倍。它們的總抗氧化能力的高低依次是：DPSP、WPSP、HDPSP。

圖5 三種黃精多糖總抗氧化能力的比較Fig.5 Comparison of the total antioxidant capacity of threePolygonatum sibiricumpolysaccharides

3 討論與結(jié)論

DESs 提取可以有效提高黃精多糖的得率，而且得到的多糖在分子量、單糖組成、抗氧化能力等性質(zhì)方面存在差異。DESs 法提取生黃精多糖得率為18%，比經(jīng)典水提法提高了36%，但是其作用機理尚不清晰。張成武[26]研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)低共熔溶劑一定程度上破壞了纖維素分子內(nèi)氫鍵，使纖維素的結(jié)晶度降低、表面變得粗糙。低共熔溶劑對木質(zhì)素和纖維素的破壞，有利于DESs 通過植物纖維層提取多糖，大部分多糖能通過氫鍵作用被提取出來。結(jié)果表明，DESs 可以降低黃精多糖分子量，當溫度提高至100 ℃時，大部分的多糖分子量被降低至4 kDa 左右。此外，從水提取后剩余的黃精渣滓中采用DESs法再次提取，得到的多糖GPC 測定結(jié)果中沒有新的峰出現(xiàn)。DESs 可以將水提得到的多糖分子打開，分子量降低，并進一步將渣滓里的殘留多糖更充分地提取出來。黃精多糖分子量的降低，可能會促進機體對多糖的吸收[27?28]，但還需要進一步的驗證。

黃精多糖是以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主的多聚糖。和WPSP 相比，DESs 處理黃精多糖會引起單糖組成的變化，尤其是甘露糖和半乳糖的比例。具體DESs 的作用機制，還需進一步純化黃精多糖，或者采用模式寡糖為原料，探究DESs 降解黃精多糖后多糖結(jié)構(gòu)和組分的變化。

低共熔溶劑提取的多糖有更好的體外抗氧化活性。黃秀紅等[29]根據(jù)茶多糖的特性優(yōu)化茶多糖低共熔溶劑提取工藝，與經(jīng)典水提醇沉法相比，茶多糖得率、DPPH 自由基抗氧化能力和羥自由基抗氧化能力分別提高了20%、54%、33%。Shang 等[30]的研究發(fā)現(xiàn)海膽多糖經(jīng)低共熔溶劑處理后具有良好的體外抗氧化活性。本研究體外抗氧化試驗中，DPSP 具有更好的體外抗氧化活性，這可能是因為黃精多糖經(jīng)DESs 在70 ℃溫度下打開分子鏈，官能團暴露增加，還原性末端含量增加。研究結(jié)果可以為低共熔溶劑在黃精多糖提取方面的應(yīng)用提供科學參考，促進黃精的開發(fā)利用，提升黃精多糖的藥用價值和經(jīng)濟價值。