β-珠蛋白基因CD114突變導致β-地中海貧血的研究*

文火月，林偉雄，肖 璇，陳 萍△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科；2.國家衛(wèi)生健康委地中海貧血防治重點實驗室；3.中國醫(yī)學科學院地中海貧血防治研究重點實驗室；4.廣西醫(yī)科大學地中海貧血防治重點實驗室，南寧 530021）

β-地中海貧血是一種由β-珠蛋白基因突變或缺失導致β-珠蛋白合成障礙的單基因遺傳病，在我國南方地區(qū)具有較高的基因攜帶率，其中尤以兩廣地區(qū)為重[1]。通常情況下，單個β-珠蛋白等位基因突變即突變的雜合子不會出現(xiàn)臨床癥狀，突變的純合子或雙重雜合子才會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀[2]。血液學檢查和血紅蛋白分析是識別地中海貧血攜帶者的基礎，分子診斷對于明確地中海貧血診斷和預測疾病的嚴重程度起到重要的作用，對實施地中海貧血的治療和預防具有重要意義[3]。目前國內外已發(fā)現(xiàn)的β-珠蛋白基因突變類型有400多種，而外顯子3區(qū)域的突變較少[4]。本研究報道1 例罕見的β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG，HBB：c.344T＞C）突變導致β-地中海貧血的血液學特點和臨床特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2021年1～12月就診于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院并且地中海貧血篩查提示β-地中海貧血的病例共440例。

1.2 血常規(guī)檢查 用EDTA-K2抗凝采血管采集患者外周靜脈血，通過血細胞自動分析儀（CELLDYN1700，Abbott，美國）及配套試劑檢測患者的血紅蛋白含量（Hb）、紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血紅細胞（RBC）計數(shù)和紅細胞比容（HCT）等血常規(guī)檢測指標。

1.3 血紅蛋白分析 應用血紅蛋白分析儀（HbVaruantⅡ，Bio-Rad，美國）進行Hb分析，檢測Hb組分如Hb A、Hb A2、Hb F和異常血紅蛋白。

1.4 DNA提取 采用Lad-Aid 820核酸提取儀及儀器配套核酸提取Midi 試劑提取血樣本的基因組DNA（廈門致善生物科技有限公司），用微量紫外分光光度計（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific，美國）檢測提取到的基因組DNA的濃度和純度。

1.5 β-地中海貧血基因突變分析

1.5.1 β-珠蛋白基因21 個位點的21 種突變類型定性檢測 采用基于熒光PCR 熔解曲線法的β-地中海貧血基因檢測試劑盒（廈門致善生物科技有限公司）檢測21 種β-地中海貧血突變（包括IVS-Ⅱ-654 M、-28 M、-29 M、14-15 M、15-16 M、17 M、41-42 M、26 M、27-28 M、30 M、37 M、43 M、71-72 M、IVS-2 M M、IVS-2 M M、IVS-2 M M、-30 M、-31 M、-32 M、-73 M、-90 M）。根據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 β-珠蛋白基因測序 設計引物上游引物：5’-TACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG-3’，下游引物：5’-ATGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3’（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）。使用PCR擴增儀（Gene-Amp9700，Thermo Fisher Scientific，美國）擴增DNA樣本目的片段。PCR擴增采用寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司提供的TaKaRa LA Taq酶和2×GC Buffer。擴增體系50 μL：含2×GC Buffer 25 μL，dNTP 8 μL，待測DNA樣本（100 ng/gL）3 μL，15 pmol/μL 的上游和下游引物各1 μL，LA Taq 酶0.3 μL，去離子水11.7 μL。反應條件：94 ℃5 min，94 ℃60 s、58 ℃60 s、72 ℃120 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 擴增產物送華大基因公司進行β-珠蛋白基因測序。

1.6 α-地中海貧血基因分析

1.6.1 4種缺失型α-地中海貧血突變基因型檢測

采用基于Gap-PCR 方法的缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳市億立方生物技術有限公司），檢測α-地中海貧血4 種缺失型突變基因型：-α4.2，-α3.7，--SEA，--THAI。

1.6.2 3種非缺失型α-地中海貧血突變基因型檢測

采用基于熒光PCR 熔解曲線法的非缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒（廈門致善生物科技有限公司），檢測α-地中海貧血3種點突變基因型：Hb CS、Hb QS和Hb WS。

2 結果

2.1 一般資料 440 例β-地中海貧血雜合子病例中，男性185 例，年齡范圍10 個月至83 歲，女性255例，年齡范圍7 個月至79 歲。從440 例β-地中海貧血病例中檢出1 例罕見的β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）突變雜合子。該病例為女性，29 歲，面色較蒼白，皮膚鞏膜無黃疸，無出血點，無肝脾腫大，無輸血史，既往血清鐵蛋白檢查結果為429.87 ng/mL。

2.2 血常規(guī)結果 1例β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）雜合子突變病例的血常規(guī)結果：Hb 78.3 g/L，RBC 3.65×1012/L，MCV 66.52 fL，MCH 21.48 pg，MCHC 322.9 g/L及HCT 0.243。提示患者有中度貧血。其他439例單純β-地中海貧血雜合子的血常規(guī)結果：Hb（115.2±12.46）g/L，RBC（5.79±0.68）×1012/L，MCV（64.27±5.48）fL，MCH（20.10±1.94）pg，MCHC（312.58±8.41）g/L及HCT（0.37±0.03）。進一步對439例β-地中海貧血雜合子病例中不同性別患者的血常規(guī)分析結果進行比較，見表1。

表1 β-地中海貧血雜合子病例中不同性別患者血常規(guī)分析結果比較

2.3 血紅蛋白分析結果 β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）雜合子突變病例血紅蛋白分析結果：Hb A24.4%，Hb F 2.6%，未見異常血紅蛋白。

2.4 β-地中海貧血基因分析結果

2.4.1 β-地中海貧血突變基因型檢測 患者未檢測到21種β-地中海貧血突變基因型。

2.4.2 基因測序結果患者基因測序 結果表明，在β-珠蛋白基因第114 位密碼子處檢測到T＞C 雜合突變，即CTG＞CCG突變（圖1），根據(jù)人類基因組變異學會（HGVS）命名規(guī)則命名為HBB：c.344T＞C。

圖1 β-珠蛋白基因測序序列圖

2.5 α-地中海貧血基因檢測結果

2.5.1 缺失型α-地中海貧血試劑盒檢測 結果患者未檢出試劑盒范圍內的4種缺失型α-地中海貧血基因型。

2.5.2 非缺失型α-地中海貧血試劑盒檢測 患者未檢出試劑盒范圍內的3種非缺失型α-地中海貧血基因型。

3 討論

目前國內外已報道β-珠蛋白基因突變類型有400多種（HbVar數(shù)據(jù)庫），國內已報道β-珠蛋白基因點突變129種[5]，其中CD41-42、CD17、IVS-Ⅱ-654、-28、CD71-72、CD26、IVS-Ⅰ-1、-29 這8 種突變就占據(jù)了中國人群β-地中海貧血突變總體的絕大部分[6]。β-珠蛋白基因外顯子3區(qū)域突變相對較少，國內外顯子3 區(qū)域突變報道罕見，已報道的如CD112（TGT＞TGA）（HBB:c.339T＞A）[7]和CD121（GAA＞TAA）（HBB:c.364G＞T）[8]基因突變，均為單個病例報道。

β-珠蛋白基因不同位點發(fā)生的突變對β-珠蛋白基因功能的影響不同。β-珠蛋白基因外顯子3區(qū)域為基因的編碼區(qū)，該區(qū)域的突變可能影響RNA 翻譯，從而干擾了β-珠蛋白基因的功能，合成異常的β-珠蛋白鏈。外顯子3的CD114（CTG＞CCG）突變使該位點編碼的亮氨酸被脯氨酸替換，該突變位于G-螺旋中，可能會對G-螺旋中用于血紅蛋白初始二聚體的形成和血紅蛋白四聚體的組裝的α1β1接觸點產生負面干擾。由此產生的未結合的異常β-珠蛋白鏈伴隨過剩的α-珠蛋白鏈沉淀于紅細胞內，使紅細胞內蛋白水解機制超載，造成無效的紅細胞生成，最終導致β-地中海貧血[9]。

β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）雜合子突變最先于意大利人群中發(fā)現(xiàn)[10]，患者為1例14歲兒童，是該突變與（ααα/αα）三聯(lián)體形成的復合雜合子，中度貧血（Hb 75 g/L，MCV 71 fL，MCH 20.3 pg），Hb分析顯示：Hb A23.2%，Hb F 16%?；颊?歲左右開始出現(xiàn)貧血，最初分別在3歲和5歲時輸血1次，7歲以后每月輸血1次，表現(xiàn)為中間型β-地中海貧血。

其它文獻報道的CD114（CTG＞CCG）雜合子突變導致地中海貧血病例大部分為中度貧血，如見于愛爾蘭裔美國白人[11]、韓國[12]、日本[13]、智利的西班牙裔[14]的4例CD114（CTG＞CCG）雜合子突變病例，均為中度貧血（Hb 74～86 g/L），Hb 分析顯示Hb A2升高（3.3%～7.0%），1例病例Hb F為＜0.5%，其余病例Hb F為3.0%～7.5%。其中西班牙裔病例為1 例40 歲男性，從7 歲開始需要每6 周輸注兩個單位紅細胞以維持Hb水平在80～85 g/L，被診斷為中間型β-地中海貧血。Curur 等[15]報道的2 個俄羅斯家系6 例CD114（CTG＞CCG）雜合子病例，Hb 60～125 g/L，Hb 分析顯示Hb A24.0%～5.0%，Hb F 1.0%～14.7%。

CD114（CTG＞CCG）合并其它β-珠蛋白基因突變病例也有報道。Cannata 等[9]報道1 例CD114（CTG＞CCG）與IVS-Ⅰ-110（G＞A）的雙重雜合子，患者為10個月大的意大利女嬰，重度貧血（Hb 35 g/L，MCV 63.2 fL，MCH 19.6 pg），脾臟和肝臟腫大，表現(xiàn)為典型的重型β-地中海貧血。

至目前國內未見CD 114（CTG＞CCG）突變病例報道。本研究在廣西人群中發(fā)現(xiàn)1 例CD114（CTG＞CCG）突變雜合子病例，患者血常規(guī)檢測顯示：RBC 3.65×1012/L，Hb 78.3 g/L，Hb 分析有Hb A2升高，為4.4%?；颊吲R床表現(xiàn)為中度貧血，無脾腫大和輸血史，未合并其它α-和β-地中海貧血基因突變。本病例與上述報道的大多數(shù)雜合子突變病例相似，有中度貧血，Hb A2升高。

單純β-珠蛋白基因突變雜合子病例臨床上一般無癥狀或有輕度貧血，通常表現(xiàn)為輕型β-地中海貧血[16]。本研究中除CD114（CTG＞CCG）突變雜合子病例外的439例β-地中海貧血雜合子病例表現(xiàn)為輕度貧血或無貧血。其中男性病例Hb、RBC 均值分別為122.06 g/L 和6.17×1012/L，較女性病例高，分析其原因，在正常生理情況下，男性的Hb、RBC 等的數(shù)值均高于女性。此外，439 例β-地中海貧血雜合子病例的MCV、MCH等均降低，這些改變符合β-地中海貧血的血液學特征。而男性病例MCV、MCH較女性病例低，造成這種差異的原因還需要更多病例做進一步分析。

本文和國外報道的CD114（CTG＞CCG）雜合子病例表現(xiàn)為中度貧血。其可能機制為此突變可產生異常β-珠蛋白，異常β-珠蛋白伴隨過剩α-珠蛋白鏈的降解會給紅細胞前體的蛋白水解過程添加額外負擔，導致更嚴重的無效紅細胞生成[12]，從而導致較嚴重的臨床表型。但因為病例數(shù)較少，仍需發(fā)現(xiàn)更多的病例做進一步的研究，以便更全面了解該基因突變類型的血液學特點及臨床特征。

當CD114（CTG＞CCG）合并β-珠蛋白基因IVS-Ⅰ-110（G＞A）突變時，由于IVS-Ⅰ-110（G＞A）突變可引起異常剪接mRNA的產生，兩種突變之間可能存在協(xié)同效應，從而引起更嚴重的β-地中海貧血表型[9]。當CD114（CTG＞CCG）合并α-珠蛋白基因三聯(lián)體時，患者嚴重的臨床表現(xiàn)可能與α-珠蛋白肽鏈產量增加進一步加劇了α-珠蛋白肽鏈的過剩有關[16]。

β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）突變在國內外都較為罕見，其雜合子在臨床上可表現(xiàn)為中度貧血，部分病例需要輸血等相應治療。這些特征與其它大多數(shù)單純β-珠蛋白基因雜合子突變僅導致無癥狀或有輕度貧血不同[17]，值得我們重視，特別在臨床診療、遺傳咨詢和產前診斷中要加以注意，避免漏診和誤診，導致延誤治療。