背角無齒蚌幼蚌不同組織的銅積累特征

劉凱，陳修報，劉洪波，姜濤，楊健，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價和資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214081）

重金屬污染嚴(yán)重威脅我國淡水漁業(yè)水域生態(tài)環(huán)境健康，Cu 已經(jīng)成為其中污染最為嚴(yán)重的重金屬之一。《2019 年中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報》指出我國江河重要漁業(yè)水域中Cu 的超標(biāo)率為7.5%，湖泊、水庫重要漁業(yè)水域中Cu 的超標(biāo)率高達(dá)11.0%。Cu 污染具有毒性強(qiáng)、難以降解、易于沿食物鏈發(fā)生生物放大等特點(diǎn)，因此，研究水體Cu污染的生物監(jiān)測對淡水生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。雙殼貝類對重金屬的耐受性較強(qiáng)，且對重金屬具有低代謝和高富集的特性，是一種良好的水體重金屬監(jiān)測評價指標(biāo)生物。目前，國際上利用雙殼貝類對水域環(huán)境進(jìn)行生物監(jiān)測的研究已有很多，早在1970 年美國國家海洋和大氣管理局就選用紫貽貝作為指標(biāo)生物進(jìn)行“貝類觀察”研究并沿用至今。

背角無齒蚌（）是起源于我國長江和黑龍江流域，現(xiàn)今已在全球廣泛分布的雙殼貝類。2003 年本課題組率先選用背角無齒蚌對太湖水域進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測，而后經(jīng)過十幾年的研究發(fā)展，已經(jīng)逐漸形成了一套較為完整的以背角無齒蚌為指示生物的“淡水貝類觀察”研究體系。研究表明，背角無齒蚌富集能力明顯高于其他淡水雙殼貝類，其各組織內(nèi)的重金屬分布情況也不同，含量排列順序為鰓＞內(nèi)臟團(tuán)＞外套膜＞斧足＞閉殼肌。周晏敏等針對嫩江3 種蚌類對重金屬富集能力的研究發(fā)現(xiàn)，背角無齒蚌對重金屬的積累能力最強(qiáng)，不同組織對重金屬的積累能力也有所不同，各組織Cu 的積累能力順序為鰓＞外套膜＞斧足。背角無齒蚌對水體Cu的去除率是三角帆蚌（）的1.2 倍。夏天翔等研究背角無齒蚌和三角帆蚌發(fā)現(xiàn)，這兩種蚌類體內(nèi)重金屬的積累規(guī)律為鰓＞外套膜＞斧足＞殼，除殼外，背角無齒蚌其他組織中的重金屬含量均大于三角帆蚌。

本課題組前期研究成果表明，背角無齒蚌幼蚌比成蚌對Cu 毒性更加敏感，Cu 對幼蚌的96 h-EC為3.4 mg·L，而成蚌的96 h-EC為22.1 mg·L，約是幼蚌的6.5 倍。目前有關(guān)幼蚌對Cu 的組織積累特征研究仍較薄弱，因此本研究選定背角無齒蚌幼蚌為實驗對象，分析背角無齒蚌幼蚌不同組織（鰓、斧足、外套膜、消化腺和其余組織）的Cu 積累特征。本研究旨在為背角無齒蚌作為“淡水貝類觀察”的指示生物在組織積累特征方面提供相關(guān)資料，從而為淡水環(huán)境Cu污染監(jiān)測評估生物標(biāo)志物的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究所采用的背角無齒蚌幼蚌均源自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實驗基地，人工養(yǎng)殖以及水環(huán)境條件參考文獻(xiàn)[14]。

1.2 暴露實驗

本研究參照在國際上被廣泛認(rèn)可的美國“Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussel”研究方法，開展Cu 對背角無齒蚌幼蚌的毒性暴露實驗。

選取大小相近、健康無病、體表無傷的1 齡幼蚌，殼長為（6.4±0.4）cm，質(zhì)量為（25.1±5.0）g。用刷子清洗蚌殼附著物后，將蚌暫養(yǎng)于實驗室水族箱中2 周以適應(yīng)實驗條件，每日投喂一次小球藻（），投喂量約為4×10個·L。實驗開始前3 d 停止投喂，排空幼蚌腸道內(nèi)雜物。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果（Cu 對背角無齒蚌幼蚌96 h-EC為3.4 mg·L）以及我國《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（GB 11607—1989）中Cu 限量（0.01 mg·L），用人工配制軟水（pH 值7.3～7.5、硬度40～48 mg·L、堿度30～35 mg·L）配制5個Cu 理論濃度（2.0、1.0、0.1、0.01、0.005 mg·L），另設(shè)置不添加Cu 的對照組，每組設(shè)置3 個平行。水體Cu 的實測濃度分別為2.1、1.0、0.1、0.01、0.003 mg·L。鑒于水體Cu 的實測濃度和理論濃度總體很接近，本實驗應(yīng)用理論濃度來表述。本實驗在貝類重金屬暴露系統(tǒng)中進(jìn)行，以一次成型的10 L 玻璃缸為容器，按照每只蚌500 mL 標(biāo)準(zhǔn)，每缸加入16 只幼蚌，添加8 L 人工配制軟水。實驗期間水溫控制在（20±1）℃，亮暗比為16∶8，光強(qiáng)為1 000 lx，溶氧量＞5.0 mg·L。為保持溶液Cu濃度穩(wěn)定，在24、48、72、96 h分別從各濃度組取3 只幼蚌，同時更換一次溶液。實驗期間不投喂，并根據(jù)本課題組前期建立的背角無齒蚌幼蚌判斷死亡的方法（幼蚌雙殼張開且用玻璃棒刺激不閉殼即判斷為死亡）監(jiān)測幼蚌存活情況，本實驗期間無幼蚌死亡。

1.3 樣品制備與測定

樣本制備：將蚌樣從冰箱取出放室溫下解凍，用不銹鋼解剖刀和剪刀分離出整個軟組織，然后分別取出鰓、斧足、外套膜、消化腺和其他組織，用Milli-Q 水將組織清洗6遍，稱取質(zhì)量后放入80 ℃的干燥箱中烘24 h至質(zhì)量恒定，計算濕質(zhì)量和干質(zhì)量比率，以便干、濕組織中Cu 含量間的換算。鰓、外套膜、斧足、消化腺和其余組織的平均干濕比分別為0.088、0.066、0.082、0.090和0.103。使用瑪瑙研缽將組織研磨至粉末狀后用稱量紙包好放入干燥器中保存。

樣本消解和測定：精準(zhǔn)稱量樣本于酸洗后的特氟隆消解管中，然后加入5 mL 純硝酸，使用T260 微波消解儀按照設(shè)定溫度10 min（120 ℃）、15 min（170 ℃）和15 min（170 ℃）將樣品徹底消解，消解后轉(zhuǎn)移到酸洗烘干后的特氟隆定容瓶中，加入Milli-Q 水稀釋至100 mL。應(yīng)用ICP-MS 測定蚌樣中重金屬Cu 含量。通過標(biāo)準(zhǔn)添加回收確認(rèn)儀器的測量精度，Cu 的回收率在104%～109%。

1.4 統(tǒng)計分析

本研究中背角無齒蚌的Cu含量（以干質(zhì)量計）均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 軟件，暴露組與對照組的差異性檢驗采用單因素方差分析（One-way ANOVA），＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰓中Cu積累

經(jīng)Cu 暴露后，在24、48、72、96 h 時，幼蚌鰓中Cu含量隨著暴露濃度的升高總體呈現(xiàn)出增加的趨勢（圖1）。0.005 mg·L和1.0 mg·LCu 暴露組隨暴露時間的延長Cu 含量逐漸增加。24、48、72、96 h 時，0.01、0.1、2.0 mg·LCu 暴露組與對照組相比差異顯著（＜0.05），且3組Cu含量均隨暴露時間的延長先增加后減少，最高值均出現(xiàn)在72 h，分別為（20.69±5.75）、（17.58±4.17）μg·g和（319.04±6.77）μg·g。72 h時，2.0 mg·L暴露組中鰓的Cu含量達(dá)到最大值，為（319.04±6.77)μg·g（＜0.05）。

圖1 背角無齒蚌幼蚌鰓組織Cu含量Figure 1 Cu content in the gill of juvenile A.woodiɑnɑ

2.2 外套膜中Cu積累

外套膜經(jīng)Cu 暴露后，在24、48、72、96 h 時的Cu含量隨著暴露濃度的升高總體呈現(xiàn)出增加的趨勢（圖2）。0.005 mg·LCu 暴露組在24、48、72 h 時的Cu 含量變化不顯著，在96 h時有明顯增加。0.01 mg·L和1.0 mg·LCu 暴露組隨暴露時間的延長Cu 含量呈現(xiàn)出增加趨勢，最高值均出現(xiàn)在96 h（＜0.05）。0.1 mg·L和2.0 mg·LCu 暴露組隨暴露時間的延長Cu含量先增加后減少，最高值均出現(xiàn)在72 h，分別為（30.05±3.86）μg·g和（669.20±32.42）μg·g（＜0.05）。當(dāng)Cu暴露時間為72 h時，2.0 mg·LCu 暴露組中外套膜的Cu 含量達(dá)到最大值，為（669.20±32.42）μg·g（＜0.05）。

圖2 背角無齒蚌幼蚌外套膜組織Cu含量Figure 2 Cu content in the mantle of juvenile A.woodiɑnɑ

2.3 斧足中Cu積累

如圖3 所示，在Cu 暴露24、48、72、96 h 時，幼蚌斧足中Cu含量隨暴露濃度的升高總體呈現(xiàn)出增加趨勢，0.005、0.01 mg·L以及0.1 mg·LCu 暴露組與對照組相比差異不顯著，而1.0 mg·L和2.0 mg·LCu暴露組與對照組相比差異顯著（＜0.05）。96 h 時，在2.0 mg·LCu 暴露組中幼蚌斧足的Cu 含量達(dá)到最大值，為（629.95±26.23）μg·g（＜0.05）。

圖3 背角無齒蚌幼蚌斧足組織Cu含量Figure 3 Cu content in the axe-shaped foot of juvenile A.woodiɑnɑ

2.4 消化腺中Cu積累

圖4為消化腺經(jīng)24、48、72、96 h Cu 暴露后的組織Cu 含量。幼蚌消化腺的Cu 含量隨暴露濃度的升高總體呈現(xiàn)出升高的趨勢。24 h 和48 h 時，0.005、0.01、0.1、1.0（24 h除外）、2.0 mg·LCu暴露組與對照組相比Cu 含量差異顯著（＜0.05）。72 h 時，在2.0 mg·LCu 暴露組中幼蚌消化腺的Cu 含量達(dá)到最大值，為（642.97±29.62）μg·g（＜0.05）。

圖4 背角無齒蚌幼蚌消化腺組織Cu含量Figure 4 Cu content in the digestive gland of juvenile A.woodiɑnɑ

2.5 其余組織中Cu積累

如圖5 所示，經(jīng)24、48、72、96 h 的Cu 暴露，幼蚌其余組織的Cu含量隨暴露濃度的升高總體上呈現(xiàn)出增加的趨勢。在24 h和48 h時，各暴露組與對照組相比差異顯著（＜0.05）。2.0 mg·LCu 暴露組Cu 含量隨暴露時間的延長呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，最高值出現(xiàn)在72 h時，為（556.51±17.17）μg·g（＜0.05）。

圖5 背角無齒蚌幼蚌其余組織Cu含量Figure 5 Cu content in other tissues of juvenile A.woodiɑnɑ

2.6 整個軟組織中Cu積累

根據(jù)不同組織（鰓、外套膜、斧足、消化腺、其余組織）的Cu 含量及其質(zhì)量，計算出整個軟組織的Cu 積累量。如圖6 所示，經(jīng)Cu 暴露后，在24、48、72、96 h時，幼蚌整個軟組織Cu 含量隨暴露濃度的升高整體上呈現(xiàn)出升高趨勢。其中0.01 mg·LCu 暴露組Cu含量隨暴露時間的延長呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。而0.1 mg·L和2.0 mg·LCu暴露組Cu含量隨暴露時間的延長呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，最高值均出現(xiàn)在72 h，分別為12.42μg·g和524.76μg·g。當(dāng)暴露時間為72 h時，在2.0 mg·LCu暴露組中幼蚌整個軟組織的Cu含量達(dá)到最大值，為524.76μg·g。

圖6 背角無齒蚌幼蚌整個軟組織Cu含量Figure 6 Cu content in whole soft tissue of juvenile A.woodiɑnɑ

3 討論

背角無齒蚌等雙殼貝類體內(nèi)重金屬的積累情況可以直接反映出水體重金屬的污染程度。研究發(fā)現(xiàn)，雙殼貝類對Cu等重金屬的積累能力與暴露濃度和暴露時間直接相關(guān)，但同時又受到物種差異、個體差異、酸堿度、溫度等很多其他生物和非生物因素的影響。如在相同水環(huán)境中背角無齒蚌軟組織Cu積累量是斑馬貽貝（）的7 倍；由于H與Cu競爭結(jié)合位點(diǎn)，斑馬貽貝對水體中Cu的吸收率會隨著水環(huán)境pH 從8.3 降低到6.5 而逐步下降。由本研究可知，背角無齒蚌幼蚌整個軟組織的Cu 含量隨Cu 暴露濃度的增加而增加，這與夏天翔等對背角無齒蚌和三角帆蚌的Cu 積累研究結(jié)果一致。井維鑫在研究Cd 暴露背角無齒蚌時也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。本實驗結(jié)果表明，幼蚌軟組織的Cu 含量在0.1 mg·L和2.0 mg·LCu暴露96 h后出現(xiàn)明顯降低。這與郭遠(yuǎn)明等研究泥蚶和菲律賓蛤仔的結(jié)果相似，泥蚶和菲律賓蛤仔體內(nèi)Cu 含量均在第1 天上升，在第3 天下降。推測可能與雙殼貝類動物體內(nèi)的解毒機(jī)制有關(guān)：其一，受到環(huán)境脅迫時，雙殼貝類會出現(xiàn)增加閉殼時間、降低縮殼頻率等行為，減少軟組織與外界水體的接觸；其二，當(dāng)雙殼貝類受到外界刺激時會增加體表黏液分泌量；其三，金屬硫蛋白可以與Cu等重金屬結(jié)合起到解毒作用。

雙殼貝類不同組織Cu積累能力與其吸收途徑有關(guān)：一是鰓通過濾水吸收溶解態(tài)的Cu，然后Cu 隨血液循環(huán)被輸送到其他組織；二是外套膜或其他體表可以直接與水體接觸的軟組織通過滲透作用吸收溶解態(tài)的Cu；三是幼蚌的攝食過程，使得食物中的Cu 以及顆粒態(tài)的Cu經(jīng)過消化系統(tǒng)被機(jī)體吸收。鰓、外套膜、斧足、消化腺和其余組織是背角無齒蚌幼蚌整個軟組織的關(guān)鍵組成部分（圖7）。值得注意的是，幼蚌各個組織Cu 含量并不相同。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)24 h Cu 暴露，暴露組各組織Cu 含量與對照組相比均有所增加，Cu 含量的排列順序為外套膜＞鰓＞斧足＞消化腺＞其余組織。其中鰓和外套膜反應(yīng)最為靈敏，在24 h 時組織Cu 含量顯著增加，且明顯大于斧足和消化腺，后隨暴露時間的延長逐漸升高，鰓和外套膜分別在96 h和72 h時濃度值達(dá)到最大值。在96 h時，各組織Cu 含量的排列順序為斧足＞消化腺＞其余組織＞外套膜＞鰓。

圖7 背角無齒蚌幼蚌（＞1齡）及成蚌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖[6]Figure 7 The schematic internal structure diagram of juvenile（＞one-year old）and adult A.woodiɑnɑ[6]

鰓作為背角無齒蚌等雙殼貝類的呼吸器官，是機(jī)體與外界水體進(jìn)行物質(zhì)交換最為頻繁的組織，同時也是短期富集重金屬的重要組織。研究表明，Cu 可以通過不同方式轉(zhuǎn)運(yùn)到鰓中，例如主動運(yùn)輸、被動擴(kuò)散以及與金屬硫蛋白結(jié)合等方式。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)96 h Cu 暴露，鰓Cu含量總體上隨暴露濃度的增加和時間的延長呈現(xiàn)升高趨勢，該結(jié)果在其他雙殼貝類中也有發(fā)現(xiàn)，如孟曉林在研究蝦夷扇貝時也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，在24 h 時，各暴露組鰓組織Cu含量顯著增加，其中0.005、0.01、0.1、1.0、2.0 mg·LCu 暴露組Cu含量分別是對照組的1.7、3.9、5.5、7.8、31.9倍，相較于其他組織反應(yīng)較為靈敏。這可能與鰓的呼吸功能有關(guān)，而且鰓與水體接觸面積大，Cu進(jìn)入血液的距離短。然而，在96 h時Cu含量下降約20%。李涌泉在研究Cd暴露背角無齒蚌時發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，16.86 mg·L和33.72 mg·L濃度組的Cd含量隨暴露時間延長先升高后降低，最高含量出現(xiàn)在48 h時。推測可能是因為Cu含量達(dá)到飽和狀態(tài)后，Cu會隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到其他組織。

外套膜是外套腔的組成部分，其與水體直接接觸，具有分泌珍珠質(zhì)及促進(jìn)性腺發(fā)育等功能。本研究表明，暴露24 、48 h 和72 h 時，外套膜在0.005、0.01、0.1、1.0 mg·LCu 暴露組的Cu 含量均大于斧足和消化腺，且隨暴露時間的延長呈上升趨勢，最大值出現(xiàn)在72 h，為669.20 μg·g，這主要與外套膜是幼蚌與水體接觸面積最大的軟組織有關(guān)，水體中的Cu可以直接通過滲透作用進(jìn)入組織，所以在短時間內(nèi)即發(fā)生大量富集。

斧足作為幼蚌的運(yùn)動器官，主要由大量肌肉細(xì)胞組成。本研究表明，經(jīng)96 h Cu 暴露，斧足在0.005、0.01 mg·L和0.1 mg·LCu 暴露組的Cu 含量與對照組相比有所增加，但隨暴露時間的延長Cu 含量變化并不顯著；而1.0 mg·L和2.0 mg·LCu 暴露組隨暴露時間的延長Cu 含量顯著增加，最大值出現(xiàn)在96 h時2.0 mg·LCu暴露組，為629.95μg·g。96 h時，斧足Cu 含量顯著高于其他組織，推測可能是由于暴露濃度過高引起斧足上皮細(xì)胞受損，上皮細(xì)胞作為斧足的第一層保護(hù)屏障被破壞后，斧足內(nèi)部組織細(xì)胞直接與水體接觸，Cu 更容易進(jìn)入組織中，導(dǎo)致組織Cu 含量較高，但這需要利用組織切片技術(shù)進(jìn)行深入探究。姜會超等研究菲律賓蛤仔時也得到了相似的結(jié)果，即經(jīng)暴露后斧足Cd含量明顯高于鰓和外套膜。

消化腺是幼蚌重要的消化器官，同時也是解毒器官。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)96 h 暴露，0.005、0.01、0.1 mg·LCu 暴露組Cu 含量整體變化不顯著，總體呈現(xiàn)出隨暴露濃度升高而升高的趨勢，最高含量均出現(xiàn)在48 h，這可能與消化腺不直接與水體接觸和其解毒作用有關(guān)。而1.0 mg·L和2.0 mg·LCu 暴露組Cu 含量相較于其他暴露組顯著增加，并且是除外套膜以外Cu含量最高的組織，這說明消化腺是Cu 積累的重要器官。井維鑫在以Cd 暴露背角無齒蚌的研究中發(fā)現(xiàn)，消化腺是除腎臟外Cd 含量最高的組織之一。相似的結(jié)果也在南極扇貝（）中發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，48～72 h，消化腺Cu含量急劇升高，72 h時的Cu含量約是48 h時的18倍，推測這可能與暴露期間不投喂飼料，Cu 只能通過血液循環(huán)進(jìn)入消化腺組織有關(guān)，所以前期增長緩慢，后隨暴露時間的延長，Cu 從其他組織隨血液循環(huán)被轉(zhuǎn)運(yùn)到消化腺中，誘導(dǎo)消化腺金屬硫蛋白表達(dá)量增加，Cu 與金屬硫蛋白結(jié)合并蓄積在消化腺中導(dǎo)致組織Cu含量顯著升高。

4 結(jié)論

（1）背角無齒蚌幼蚌對水體Cu具有高積累性，其中鰓對Cu積累的反應(yīng)最為靈敏，而外套膜對Cu的積累量最高，表明鰓和外套膜是水體Cu積累的潛在靶組織。

（2）利用背角無齒蚌作為指示生物監(jiān)測水體Cu污染，建議優(yōu)先選擇鰓和外套膜進(jìn)行分析，以便更為靈敏、高效地評價水環(huán)境Cu污染的時空動態(tài)。