復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達(dá)與細(xì)胞增殖侵襲惡性行為的關(guān)系及預(yù)測預(yù)后的效能

胡杜鵑 任娟

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率達(dá)全部顱內(nèi)腫瘤的50%以上[1]。目前手術(shù)聯(lián)合放化療是臨床治療腦膠質(zhì)瘤主要手段，但此疾病惡性程度高，且呈彌漫性浸潤，治療難度大，術(shù)后易復(fù)發(fā)，患者預(yù)后差。因此，如何能有效評估患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸以積極完善治療方案對確保此類患者預(yù)后尤為重要。四跨膜超家族成員1蛋白(TM4SF1)是一種腫瘤相關(guān)抗原，最早被發(fā)現(xiàn)于人上皮來源的惡性腫瘤內(nèi)。研究顯示，TM4SF1 mRNA在肝癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，可促進(jìn)惡性細(xì)胞侵襲、遷移[2]。miR-542-3p是miRNA家族成員，岑小寧等[3]指出，其在腸癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)可降低惡性細(xì)胞遷移能力，并提出miR-542-3p表達(dá)可能與惡性細(xì)胞遷移行為有關(guān)。鋅是細(xì)胞生長、分化、發(fā)育所必需的微量元素。有研究表明，腫瘤內(nèi)常出現(xiàn)鋅離子水平異常情況，且此特征與鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體1(ZnT1)活性關(guān)系密切[4]。本研究探討復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達(dá)與細(xì)胞增殖侵襲惡性行為的關(guān)系及預(yù)測治療反應(yīng)性的效能，為臨床完善相關(guān)診療機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2020年3月我院收治的169例復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者，根據(jù)6個月預(yù)后情況分為死亡組、生存組。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診經(jīng)病理診斷確診腦膠質(zhì)瘤[5]，術(shù)后治療首次復(fù)發(fā)；②滿足二次手術(shù)指征；③卡氏(KPS)功能狀態(tài)評分≥60分；④患者、家屬知情理解簽署同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴肝腎心等主要臟器嚴(yán)重疾病者；②有腦梗死、腦膜炎等其他腦部疾病者；③有精神疾病及認(rèn)知障礙者；④伴其他惡性腫瘤疾病者。

1.3 方法 術(shù)中留取腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，取50 g標(biāo)本加入自動勻漿器勻漿，孵育5 min(15～30℃)，待完全裂解，離心(10 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，半徑10 cm)提取RNA，純化，反轉(zhuǎn)錄，孵育(37℃)50 min，保溫(70℃)10 min，反應(yīng)結(jié)束將cDNA置-20℃保存。采用賽默飛世爾中國熒光定量PCR儀(7500型)測TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p。擴(kuò)增程序95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，45個循環(huán)。TM4SF1引物設(shè)計：上游引物5’-TCGGCCAGTGGAACTACACCTTT-3’，下游引物5’-TCCACCAAGAGCCAAGAGGATAGA-3’；ZnT1 引物設(shè)計：上游引物5’-TGATGGCTATTATGGACGAG-3’，下游引物5’-GGAGCGTTTCCCAAGC-3’；miR-542-3p引物設(shè)計：上游引物5’-GGCGGTGTGACAGATTGATAA-3’，下游引物5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTCAG A-3’。

1.4 觀察指標(biāo) (1)比較2組基線資料、組織各指標(biāo)。(2)比較組織各指標(biāo)不同表達(dá)水平對細(xì)胞增殖侵襲惡性行為的影響。細(xì)胞增殖侵襲惡性行為采用2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行評價。(3)分析預(yù)后影響因素及組織各指標(biāo)預(yù)測預(yù)后的效能。(4)對比各指標(biāo)不同表達(dá)水平患者生存率。

2 結(jié)果

2.1 2組基線資料、組織各指標(biāo)比較 169例復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者，隨訪6個月，失訪2例，167例獲訪患者中，死亡25例，生存142例。2組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、KPS評分、合并疾病、腫瘤位置、術(shù)后輔助治療比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；死亡組距離首次手術(shù)時間、腦膠質(zhì)瘤WHO分級、腫瘤切除程度、TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達(dá)與生存組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組基線資料、組織各指標(biāo)比較

2.2 各指標(biāo)不同表達(dá)水平對細(xì)胞增殖侵襲惡性行為影響 以2組TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達(dá)均值為分界進(jìn)行分層，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p高表達(dá)與低表達(dá)患者WHO分級比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析 以預(yù)后情況作為因變量(0=生存，1=死亡)，以2組比較篩查出的有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)：TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p作為自變量(低表達(dá)賦值1，高表達(dá)賦值為2)，建立Cox比例風(fēng)險回歸模型，結(jié)果顯示，將距離首次手術(shù)時間、腦膠質(zhì)瘤WHO分級、腫瘤切除程度控制后，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p仍與患者預(yù)后相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

2.4 各指標(biāo)預(yù)測預(yù)后的效能 以死亡組為陽性樣本，以存活組為陰性樣本，繪制各指標(biāo)預(yù)測預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p預(yù)測預(yù)后的AUC分別為0.829、0.798、0.759(P<0.05)；采用聯(lián)合應(yīng)用ROC理論模式，對各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)進(jìn)行綜合回歸，建立Logistic預(yù)測評估模型，結(jié)果顯示，TM4SF1 mRNA+ZnT1 mRNA+miR-542-3p預(yù)測預(yù)后的AUC為0.938(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 ROC分析結(jié)果

圖1 組織各指標(biāo)預(yù)測預(yù)后的效能

2.5 各指標(biāo)不同表達(dá)水平患者生存率比較 根據(jù)ROC分析cut-off值，將患者分為TM4SF1 mRNA高危(>2.07)與低危(≤2.07)、ZnT1 mRNA高危(>0.76)與低危(≤0.76)、miR-542-3p高危(≤0.74)與低危(>0.74)患者生存率，應(yīng)用K-M生存曲線分析，結(jié)果顯示，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p高?；颊呱媛逝c低?；颊弑容^，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.377、6.789、14.869，P=0.002、0.009、<0.001)。見圖2～4。

圖2 不同TM4SF1 mRNA表達(dá)者生存率比較 圖3 不同ZnT1 mRNA表達(dá)者生存率比較 圖4 不同miR-542-3p表達(dá)者生存率比較

3 討論

腦膠質(zhì)瘤常呈浸潤性生長，無顯著界限，具高復(fù)發(fā)率、病死率，低治愈率等特征[7]。有研究顯示，腦膠質(zhì)瘤3年生存率不足9%[8]。本研究對復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者再手術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，6個月病死率即達(dá)14.97%。上述研究均提示臨床急需加強(qiáng)對腦膠質(zhì)瘤惡性行為相關(guān)研究并有效指導(dǎo)臨床完善此疾病診療機(jī)制，以提升患者生存率。

TM4SF1 mRNA定位在人3號染色體上，可編碼TM4SF1低分子糖蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn)，TM4SF1在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，如：TM4SF1被募集到TERM區(qū)及相關(guān)泛素化修飾后可刺激惡性細(xì)胞發(fā)生遷移，但其與復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤惡性行為間關(guān)系如何，尚無定論[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨TM4SF1 mRNA表達(dá)升高，腦膠質(zhì)瘤WHO分級呈升高趨勢，且生存與死亡患者間復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)TM4SF1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示TM4SF1 mRNA過表達(dá)可能與腦膠質(zhì)瘤惡性行為有關(guān)。分析主要是因TM4SF1 mRNA高表達(dá)可顯著增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，同時其在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦呈高表達(dá)狀態(tài)可促進(jìn)血管新生，而腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中，病理性血管新生及惡性細(xì)胞侵襲性均起到關(guān)鍵性作用[10]。因此，腦膠質(zhì)瘤組織TM4SF1 mRNA高表達(dá)時可能通過促進(jìn)惡性細(xì)胞侵襲及病理性血管生成兩個層面而增加復(fù)發(fā)風(fēng)險，或可為臨床完善此疾病診療機(jī)制提供參考。

ZnT1與腦中鋅離子代謝關(guān)系密切，是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體家族主要成員。目前ZnT1已得到廣泛證實，可通過調(diào)節(jié)CDK2活性而影響G1/S期轉(zhuǎn)化，同時能通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶活性而調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲能力[11,12]。本研究對不同預(yù)后的腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，死亡組ZnT1 mRNA表達(dá)高于生存組(P<0.05)，初見此結(jié)果與鋅元素有助于維持細(xì)胞正常生理功能的特性相悖，但結(jié)合現(xiàn)有研究[13,14]不難分析，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在快速增殖及發(fā)生侵襲行為的同時，機(jī)體通過一系列生理功能對抗腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，故腦膠質(zhì)瘤惡性程度越高，ZnT1 mRNA表達(dá)隨之越高，但此疾病發(fā)生發(fā)展是多因素、多過程作用的結(jié)果，單純ZnT1 mRNA高表達(dá)難以阻止其惡性行為。

此外，miR-542-3p是一種新發(fā)現(xiàn)微小mRNA，通過研究其生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，miR-542-3p可與凋亡抑制基因Survivin所編碼mRNA 3’端非編碼區(qū)選擇性結(jié)合，繼而抑制Survivin蛋白生成。有研究顯示，腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)miR-542-3p表達(dá)顯著降低，miR-542-3p表達(dá)降低程度與預(yù)后不良有關(guān)[15]。本研究亦發(fā)現(xiàn)miR-542-3p低表達(dá)時腦膠質(zhì)瘤WHO分級偏高，說明miR-542-3p可能具有抑癌基因作用，其表達(dá)降低時可致機(jī)體抗腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展能力減弱，此結(jié)論同樣可部分解釋ZnT1 mRNA高表達(dá)時，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性行為活躍的原因。結(jié)合以上TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達(dá)在復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織中的生物學(xué)特征，或可應(yīng)用于預(yù)后評估。但還有研究顯示，腫瘤切除程度、腦膠質(zhì)瘤WHO分級等均與復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有關(guān)，腫瘤切除程度越高越利于控制病情[16]。Cox比例風(fēng)險回歸模型校正距離首次手術(shù)時間、腦膠質(zhì)瘤WHO分級、腫瘤切除程度后，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p仍與患者預(yù)后相關(guān)，且聯(lián)合預(yù)測預(yù)后的AUC為0.938，大于單一指標(biāo)預(yù)測(P<0.05)，提示TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p與預(yù)后有關(guān)，聯(lián)合檢測可為臨床評估預(yù)后提供客觀依據(jù)，因此，針對TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA升高，miR-542-3p降低的高?；颊?，需積極完善治療方案以確?；颊吣塬@益最大化。

綜上可知，腦膠質(zhì)瘤組織TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達(dá)與細(xì)胞增殖侵襲惡性行為關(guān)系密切，是預(yù)后的主要影響因素，三者聯(lián)合可為臨床預(yù)測預(yù)后提供參考依據(jù)。