circSAMD4A靶向miR-410-3p對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響

劉園園 張培培 陳忠美

缺血性中風(fēng)發(fā)生時(shí)，部分腦部供血減少，導(dǎo)致葡萄糖和氧氣供應(yīng)不足，最終導(dǎo)致腦損傷。重組組織型纖溶酶原激活劑是目前惟一確立的腦卒中治療藥物，但由于時(shí)間窗限制具有較大的局限性[1]。腦損傷相關(guān)神經(jīng)功能障礙影響患者的語言、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類通過特殊的選擇性切割機(jī)制產(chǎn)生的非編碼RNA。circRNA可與特定的微小RNA(miRNA)結(jié)合，阻止miRNA翻譯，并影響細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等生物學(xué)過程，進(jìn)而在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥的病理過程中發(fā)揮作用[2-4]。研究報(bào)道急性心肌梗死大鼠心肌組織和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circRNA SAMD4A(circSAMD4A)抑制水平上調(diào)，circSAMD4A低表達(dá)可降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[5]。靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-410-3p是circSAMD4A的潛在靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，糖氧剝奪的原發(fā)皮層神經(jīng)元中miR-410-3p水平顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-410-3p可增強(qiáng)神經(jīng)元存活，抑制神經(jīng)元凋亡，增加軸突長度，并顯著恢復(fù)缺氧缺血性腦損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能[6]。本研究利用PC-12細(xì)胞建立體外缺氧缺糖細(xì)胞損傷模型模擬缺血性腦損傷過程[7]，研究circSAMD4A靶向miR-410-3p對(duì)缺氧缺糖神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，旨在為缺血性腦損傷治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠PC12細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；EBSS無糖培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；circSAMD4A的小干擾RNA(si-circSAMD4A)、miR-410-3p模擬物(mimics)、miR-410-3p抑制物(anti-miR-410-3p)以及各自陰性對(duì)照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒購自上海生工生物工程公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京Takara生物公司；SYBR green master mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自武漢金開瑞生物公司；兔源Cleaved-caspase3抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國CST公司；TRIzol試劑、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒以及丙二醛(MDA)檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自北京索萊寶生物公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組:PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期PC12細(xì)胞接種到6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁40%時(shí)Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circSAMD4A、miR-NC、miR-410-3p mimics、si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p至PC12細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h的PC12細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[7]方法構(gòu)建缺氧缺糖模型，即將PC12細(xì)胞接種培養(yǎng)板，HANKs液去除懸浮細(xì)胞，用EBSS無糖培養(yǎng)基替代DMEM培養(yǎng)基，放入含5% CO2與95% N2的密閉小室中缺糖缺氧損傷4 h，然后取出培養(yǎng)板置于常規(guī)培養(yǎng)箱中復(fù)氧繼續(xù)培養(yǎng)2 h，記為模型(Model)組。用普通高糖DMEM培養(yǎng)基于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12細(xì)胞記為對(duì)照(Con)組。轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-circSAMD4A、轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-410-3p mimics、轉(zhuǎn)染si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p的PC12細(xì)胞進(jìn)行缺糖缺氧損傷4 h，再復(fù)氧繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別記為Model+si-NC組、Model+si-circSAMD4A組、Model+miR-NC組、Model+miR-410-3p組、Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p組。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測circSAMD4A、miR-410-3p表達(dá):用TRIzol試劑從各組PC12細(xì)胞中提取總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA。利用SYBR green master mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測circSAMD4A、miR-410-3p表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所用引物序列(5’-3’)：circSAMD4A上游ACTGGCAGGACAAAAGCATG，下游CAGGATTTTGGGCAGCAGTT；GAPDH上游CAGGAGGCATTGCTGATGAT，下游GAAGGCTGGGGCTCATTT；miR-410-3p上游AAUAUAACACAGAUGG，下游CCTGGCAGTGATGTTGCGGTCTGCCAGGACAGG；U6上游TGGAGCTGCAGAGGATGATT5，下游CAGGGCCTTGAGCACCAGTT。采用2-ΔΔCt法分析circSAMD4A、miR-410-3p的相對(duì)水平。circSAMD4A水平檢測以GAPDH為內(nèi)參，miR-410-3p水平檢測以U6為內(nèi)參。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力:每組取5×103個(gè)PC12細(xì)胞接種6孔板，用20 μl的MTT工作液孵育細(xì)胞4 h，向各孔內(nèi)加入二甲基亞砜150 μl。低速搖床震蕩10 min，當(dāng)藍(lán)紫色甲贊結(jié)晶溶解后。使用酶標(biāo)儀檢測各組PC12細(xì)胞在490 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率:收集各組PC12細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后重懸于1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞中濃度為1×10個(gè)/ml。按照Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測試劑盒說明書，將5 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI依次加到100 μl細(xì)胞懸液中，避光孵育20 min。補(bǔ)加400 μl的1×結(jié)合緩沖液混勻，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組PC12細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達(dá):BCA試劑盒檢測RIPA裂解法提取的各組PC12細(xì)胞總蛋白濃度。將適量蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混勻，100℃水浴鍋孵育3～5使蛋白變性。30 μg蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓100 V，時(shí)間90 min)分離，經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜儀(20 mA，過夜)轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。膜阻斷后，將膜上的蛋白與1∶1 000的Cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體在4 ℃孵育過夜。第2天與二抗室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)，以Image J軟件測得的Cleaved-caspase3和GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白水平。

1.2.6 試劑盒檢測SOD和CAT活性、MDA含量以及LDH釋放量:收集各組PC12細(xì)胞，離心后取上清置于新的離心管內(nèi)，LDH活性檢測試劑盒分析上清中LDH水平以表示LDH釋放量。向細(xì)胞沉淀中加入提取液，200 W超聲(超聲3 s，間隔10 s，重復(fù) 30 次)于冰上破碎細(xì)胞，8 000 g 4℃離心10 min，取上清置于冰上。SOD、CAT活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒分析細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性以及MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):根據(jù)starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的circSAMD4A和miR-410-3p的結(jié)合位點(diǎn)，將包含miR-410-3p結(jié)合位點(diǎn)的circSAMD4A野生(wt)序列以及不含結(jié)合位點(diǎn)的circSAMD4A突變(mut)序列分別克隆到pmirGLO基本載體，構(gòu)建wt-circSAMD4A、mut-circSAMD4A熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將miR-410-3p mimics、miR-NC分別與wt-circSAMD4A或mut-circSAMD4A共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞中，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測各組PC12細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 干擾circSAMD4A對(duì)缺糖缺氧處理的PC12凋亡的影響 與Con組比較，Model組PC12細(xì)胞活力、miR-410-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平、circSAMD4A表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-circSAMD4A組PC12細(xì)胞活力、miR-410-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平、circSAMD4A表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

蛋白質(zhì)印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

表1 干擾circSAMD4A抑制缺糖缺氧誘導(dǎo)的PC12凋亡

2.2 干擾circSAMD4A對(duì)缺糖缺氧處理的PC12氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，Model組PC12細(xì)胞中SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量顯著增加(P<0.05)；與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-circSAMD4A組PC12細(xì)胞中SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 干擾circSAMD4A減輕缺糖缺氧誘導(dǎo)的PC12氧化應(yīng)激

2.3 circSAMD4A靶向miR-410-3p starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測到circSAMD4A序列中含有miR-410-3p的結(jié)合位點(diǎn)。同與wt-circSAMD4A共轉(zhuǎn)染，與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-410-3p mimics后PC12細(xì)胞對(duì)的相對(duì)熒光素活性顯著降低(P<0.05)；同與mut-circSAMD4A共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-410-3p mimics后PC12細(xì)胞相對(duì)熒光素活性與轉(zhuǎn)染miR-NC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 circSAMD4A和miR-410-3p互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4 抑制miR-410-3p逆轉(zhuǎn)干擾circSAMD4A對(duì)缺糖缺氧處理的PC12凋亡、氧化應(yīng)激的影響 與Model+si-circSAMD4A組比較，Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p組PC12細(xì)胞活力、miR-410-3p表達(dá)水平以及SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平、MDA水平、LDH釋放量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 抑制miR-410-3p可逆轉(zhuǎn)干擾circSAMD4A對(duì)缺糖缺氧誘導(dǎo)的PC12凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 蛋白質(zhì)印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

2.5 miR-410-3p對(duì)缺糖缺氧處理的PC12凋亡氧化應(yīng)激的影響 與Model組、Model+miR-NC組比較，Model+miR-410-3p組PC12細(xì)胞活力、miR-410-3p表達(dá)水平以及SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平、MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表5。

表5 miR-410-3p抑制缺糖缺氧誘導(dǎo)的PC12凋亡和氧化應(yīng)激

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 蛋白質(zhì)印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

3 討論

腦組織circRNA含量豐富，這些circRNA不僅與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和生物學(xué)功能有關(guān)，在腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和病理中發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA 絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動(dòng)樣激酶1(circTLK1)在缺血性腦卒中動(dòng)物模型和患者的腦組織和血漿中水平升高，敲減circTLK1可顯著減少梗死體積，減輕神經(jīng)元損傷，改善隨后的長期神經(jīng)功能缺損[9]。circRNA HECTD1(circHECTD1)通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活加重缺血損傷[10]。此外，circRNA DLGAP4(circDLGAP4)通過靶向miR-143調(diào)節(jié)與血腦屏障完整性相關(guān)的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善缺血性卒中預(yù)后[3]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中circSAMD4A水平增加，提示circSAMD4A表達(dá)改變可能與缺血性腦損傷相關(guān)。功能喪失實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染si-circSAMD4A干擾circSAMD4A表達(dá)顯著減輕缺氧缺糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞活力。干擾circSAMD4A表達(dá)后Cleaved-caspase3表達(dá)下調(diào)，證實(shí)其可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究表明，circSAMD4A在骨肉瘤中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡[11,12]。氧化應(yīng)激在缺氧缺糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著重要作用[13]。本研究顯示，缺氧缺糖誘導(dǎo)細(xì)胞損傷標(biāo)志物L(fēng)DH釋放，增加脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA水平，降低抗氧化酶SOD和CAT活性，而干擾circSAMD4A表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了缺氧缺糖誘導(dǎo)的上述改變。因此，干擾circSAMD4A表達(dá)通過抑制氧化應(yīng)激和凋亡在缺氧缺糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

circRNA可作為miRNA海綿，通過競爭性結(jié)合miRNA間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，參與缺血性腦損傷過程，例如circHECTD1能夠負(fù)向調(diào)控miR-133b表達(dá)加劇大腦中動(dòng)脈閉塞小鼠模型的腦梗死面積和神經(jīng)元凋亡[14]。本研究證實(shí)miR-410-3p受circSAMD4A調(diào)控，是circSAMD4A的直接靶標(biāo)。據(jù)報(bào)道，miR-410-3p在七氟醚麻醉誘導(dǎo)的大鼠和細(xì)胞中下調(diào)，并在七氟醚麻醉誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥中發(fā)揮抑制作用[15]。肝刺激因子通過上調(diào)miR-410-3p等幾種miRNA表達(dá)，抑制周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)水平，抑制肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕肝臟缺血再灌注損傷[16]。本研究表明，缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-410-3p水平降低，過表達(dá)miR-410-3p可提高SOD和CAT活性，降低MDA水平，抑制LDH釋放，改善缺氧缺糖誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激損傷。由于干擾circSAMD4A表達(dá)可增加缺氧缺糖PC12細(xì)胞中miR-410-3p水平，且過表達(dá)miR-410-3p和干擾circSAMD4A的神經(jīng)保護(hù)作用類似，表明可能存在circSAMD4A/miR-410-3p調(diào)控途徑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-410-3p表達(dá)可減弱干擾circSAMD4A對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，這表明circSAMD4A靶向負(fù)調(diào)控miR-410-3p表達(dá)參與調(diào)控缺氧缺糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究首次證實(shí)干擾circSAMD4A通過靶向miR-410-3p可減輕缺糖缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。靶向抑制circSAMD4A/miR-410-3p途徑可能是預(yù)防或治療缺血性腦損傷的有效途徑。