早期宮頸癌(Ⅰa1～Ⅱa2)術(shù)后TLR4、HMGB1和RAGE水平對(duì)24個(gè)月腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

蔡玉茹 郭婧 楊紅玉 李楠 孫亞楠

宮頸癌是婦科第二大惡性腫瘤，是發(fā)展中國(guó)家女性癌癥死亡的主要原因，每年約30萬(wàn)女性死于該病，且近年來(lái)發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[1,2]。隨著女性保健意識(shí)的提高及早期篩查手段的普及，早期宮頸癌確診比例逐年上升。早期宮頸癌患者宮旁浸潤(rùn)(parametrial involvement，PI)的發(fā)生率較低，以宮頸錐切術(shù)和宮頸根治術(shù)為主的綜合治療是主要針對(duì)性治療方案，其具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快且并發(fā)癥相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn)[3]，但術(shù)后復(fù)發(fā)仍就對(duì)患者生存率和生存質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。本次研究基于“腫瘤局部免疫狀態(tài)對(duì)其進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后均有著一定的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值”的理論，共納入血清、腫瘤組織功能性蛋白三類，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box ehromosomal-protein-1，HMGB1)屬于非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，位于核小體內(nèi)；現(xiàn)已被證實(shí)具有一定的警報(bào)素功能，即由壞死、損傷細(xì)胞釋放入細(xì)胞外，可起到內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào)活化天然免疫細(xì)胞的作用[4]。HMGB1被釋放入細(xì)胞外以后，對(duì)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)具有一定的募集與活化作用，募集作用主要依靠晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)，活化作用則依賴toll樣受體4(toll-like receptor-4,TLR4)介導(dǎo)，進(jìn)而激活NF-kB通路、PI3K/AKT通路等多種途徑。本次研究由腫瘤組織及術(shù)后血清中功能性蛋白HMGB1、RAGE和TLR4水平出發(fā)，前瞻性評(píng)估研究指標(biāo)對(duì)早期宮頸癌宮頸錐切術(shù)后24個(gè)月腫瘤復(fù)發(fā)的量化預(yù)測(cè)價(jià)值，分析其影響因素，為精準(zhǔn)干預(yù)提供更多的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 分析2016年3月至2019年6月于石家莊市人民醫(yī)院確診的早期宮頸癌患者175例，年齡26～56歲，平均年齡(49.26±5.75)歲；孕產(chǎn)數(shù)0～5胎；其中腺癌47例，鱗癌128例；樣本術(shù)后病理FIGO分期為Ⅰa期112例(Ⅰa1期33例，Ⅰa2期89例)，Ⅰb期35例(Ⅰb1期18例，Ⅰb1期8例，Ⅰb2期9例)，Ⅱa期28例(Ⅱa1期19例，Ⅱa2期9例)；行宮頸錐切術(shù)85例(其中3例術(shù)前病理CIN3患者術(shù)后確診為Ⅰb1期，追加廣泛全子宮+盆腔淋巴結(jié)切除術(shù))，腹腔鏡輔助宮頸根治術(shù)90例。隨訪期限24月，隨訪截止期為2021年6月。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①樣本均符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)宮頸癌臨床分期及診斷相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(2018)[5]；②病理確診為鱗癌、腺癌；③FIGO分期為1期④研究對(duì)象知情同意，自愿參加。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他重大器官、系統(tǒng)疾病的樣本；②合并宮腔疾病(宮腔或?qū)m旁占位等)可能對(duì)本次研究結(jié)果造成影響的樣本；③排除鱗癌、腺癌、腺鱗癌以外的特殊病理類型；④凝血功能障礙；⑤非知情同意，依從性較差隨訪困難的樣本。

1.3 方法

1.3.1 宮頸錐切術(shù)：①常規(guī)消毒鋪巾，患者截石位充分暴露宮頸；②患者全身麻醉；③陰道鏡探查確定病變范圍；選擇合適規(guī)格的環(huán)形電刀(50 W)；④環(huán)形電極由內(nèi)向外順時(shí)針切除病變組織，切除范圍>病變范圍5 mm；⑤電極移動(dòng)均勻緩慢，殘端宮頸進(jìn)行1 cm預(yù)防性解除，球形電極電凝止血。

1.3.2 根治性宮頸切除術(shù)：①常規(guī)消毒鋪巾，插管全身麻醉，患者取截石位；②人工氣腹形成及穿刺管置入；③探查子宮與周圍組織毗鄰情況；連續(xù)切斷雙側(cè)卵巢盆腔漏斗韌帶(結(jié)扎法)；④盆腔淋巴清掃；⑤子宮切口，膀胱反折、下推至宮頸外口下3 cm；⑤鈍性分離宮旁結(jié)締組織；⑥游離子宮動(dòng)脈，結(jié)扎下行支；⑦依次打開膀胱、宮頸韌帶等，直至切開陰道壁并切下宮頸(宮頸外口下2 cm處)；⑧術(shù)中冰凍活檢病理陰性患者，可于縫合前置入T型宮內(nèi)節(jié)育器，陰道殘端縫合。

1.4 觀察指標(biāo) 輔助檢查資料包括術(shù)后血清及腫瘤組織中HMGB1、RAGE和TLR4水平，臨床、病理資料包括：腫瘤類型、腫瘤大小、切緣情況、間質(zhì)浸潤(rùn)情況、淋巴轉(zhuǎn)移情況、FIGO分期。刪失數(shù)據(jù)(censoring data)生存分析研究結(jié)束期，樣本發(fā)生研究之外的其他事件或生存結(jié)局，因此無(wú)法對(duì)研究結(jié)局事件進(jìn)行觀察與記錄。刪失原因包括失訪、研究對(duì)象不配合或研究對(duì)象出現(xiàn)研究以外因素的死亡等。診斷臨界值為曲線中約登指數(shù)最大的界點(diǎn)，約登指數(shù)=(靈敏度+特異度-1)。

1.4.1 儀器與試劑

1.4.1.1 儀器：①酶聯(lián)免疫分析儀(JD-SY96A，山東競(jìng)道光電科技有限公司)；②光學(xué)顯微鏡(CX23，奧林巴斯)；③旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(CUT4062，德國(guó)SLEE)；④病理石蠟包埋冷臺(tái)機(jī)(LS-101，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)⑤電熱恒溫干燥箱(昆山海達(dá)精密儀器有限公司)等。

1.4.1.2 試劑：一抗兔抗人HMGB1、RAGE和TLR4多克隆抗體(美國(guó) Abcam 公司)，辣根過(guò)氧化物酶、蘇木紫染色劑、乙醇、檸檬酸緩沖液等。

1.4.2 腫瘤組織HMGB1、RAGE和TLR4水平檢測(cè)：①標(biāo)本由4%甲醛液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、12點(diǎn)連續(xù)切片(厚度4 μm)；②按步驟及要求時(shí)限進(jìn)行相應(yīng)的脫蠟、浸洗、PBS清洗以及孵育過(guò)程，最終染色封片；③上光學(xué)顯微鏡，每張切片隨機(jī)選取15個(gè)視野取均值。④結(jié)果判定：按照染色強(qiáng)度及細(xì)胞陽(yáng)性率，對(duì)結(jié)果進(jìn)行0～6評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成比<10%、10%～40%、40%～70%以及>70%賦值0、1、2和3分；染色強(qiáng)度以“無(wú)染色”、“高倍鏡下陽(yáng)性而低倍鏡下陰性”、“低倍鏡下陽(yáng)性”和“低倍鏡下強(qiáng)陽(yáng)”性依次賦值0、1、2和3分。以15個(gè)視野兩項(xiàng)評(píng)分乘積均值作為最終評(píng)估依據(jù)，<3分、4～5分、6～8分和9分依次判定為不表達(dá)、低表達(dá)、中表達(dá)和高表達(dá)[6,7]。

1.4.3 血清HMGB1、RAGE和TLR4水平檢測(cè)：取術(shù)后第2天晨起空腹靜脈血4 ml，肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min；取上清如低溫冰箱保存(-80℃)，避免樣本反復(fù)凍融。上酶聯(lián)免疫分析儀以酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)樣本術(shù)后血清中TLR4、HMGB1和RAGE水平。

1.4.4 隨訪：12個(gè)月隨訪期限內(nèi)每3個(gè)月行相關(guān)復(fù)查；連續(xù)復(fù)查4次皆為陰性的患者可改為6個(gè)月復(fù)查1次，隨訪截止期為2021年6月。

2 結(jié)果

2.1 2組術(shù)后血清HMGB1、RAGE和TLR4 水平比較 24個(gè)月隨訪時(shí)限結(jié)束，得到復(fù)發(fā)樣本37例，非復(fù)發(fā)樣本134例(失訪4例)，術(shù)后樣本血清HMGB1水平為正態(tài)性計(jì)量資料(Kolmogorov-SmirnovZ=0.761,P=0.609)、RAGE(Kolmogorov-SmirnovZ=0.904,P=0.387)和TLR4(Kolmogorov-SmirnovZ=1.371,P=0.047) 水平為非正態(tài)性計(jì)量資料，以復(fù)發(fā)情況進(jìn)行分組，組間術(shù)后血清功能性蛋白水平比較，得到HMGB1、RAGE和TLR4 水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組術(shù)后血清HMGB1、RAGE和TLR4 水平比較 n=114

2.2 ROC曲線分析

2.2.1 血清HMGB1、RAGE和TLR4曲線下面積分別為0.813、0.802和0.865，預(yù)測(cè)診斷臨界值分別為0.822、0.751和0.861。見表2，圖1。

表2 術(shù)后血清多種功能蛋白水平對(duì)宮頸癌術(shù)后24個(gè)月復(fù)發(fā)情況量化性預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線分析

圖1 術(shù)后血清HMGB1、RAGE和TLR4 水平對(duì)24個(gè)月期宮頸癌復(fù)發(fā)的量化預(yù)測(cè)診斷價(jià)值

2.2.2 進(jìn)一步計(jì)算預(yù)測(cè)診斷臨界值，血清HMGB1、RAGE和TLR4診斷臨界值分別為0.73 ng/ml、188 pg/ml和24.88 pg/ml。其中血清RAGE診斷臨界值的特異度偏低(49.50)。見表3。

表3 血清HMGB1、RAGE和TLR4診斷臨界值

2.2.3 因曲線個(gè)別部位存在交叉，進(jìn)一步兩兩比較得到，血清RAGE和TLR4的ROC曲線診斷價(jià)值存在差異(P<0.05)。見表4。

表4 血清HMGB1、RAGE和TLR4曲線診斷價(jià)值比較

2.3 生存分析

2.3.1 結(jié)合前瞻性隨訪復(fù)查評(píng)估腫瘤組織功能性蛋白表達(dá)對(duì)早期宮頸癌(Ⅰa1～Ⅱa2)術(shù)后“非復(fù)發(fā)狀態(tài)”時(shí)間分布的擬合能力：按照術(shù)后組織相關(guān)研究功能蛋白細(xì)胞表達(dá)水平，將樣本分成2組，無(wú)表達(dá)與低表達(dá)樣本合并組成“陰性組”，中表達(dá)與高表達(dá)樣本合并組成“陽(yáng)性組”。見表5。

表5 樣本研究時(shí)限內(nèi)宮頸癌復(fù)發(fā)、刪失率 n=175，例(%)

2.3.2 Kaplan-Meier生存分析法評(píng)估體重控制對(duì)妊娠期糖尿病干預(yù)效果的分析：Kaplan-Meier生存分析，以Log Rank test得到，以不同組織功能性蛋白分組后，陰性組“非復(fù)發(fā)狀態(tài)”持續(xù)的時(shí)間均長(zhǎng)于陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于樣本宮頸癌復(fù)發(fā)率低于50%，故研究結(jié)果不涉及生存表中位數(shù)分析。見表6，圖2～4。

表6 Kaplan-Meier生存分析法評(píng)估體重控制對(duì)妊娠期糖尿病干預(yù)效果的分析

圖2 Kaplan-Meier生存分析法評(píng)估腫瘤組織HMGB1水平對(duì)宮頸癌復(fù)發(fā)的時(shí)間分布擬合效能 圖3 Kaplan-Meier生存分析法評(píng)估腫瘤組織RAGE水平對(duì)宮頸癌復(fù)發(fā)的時(shí)間分布擬合效能 圖4 Kaplan-Meier生存分析法評(píng)估腫瘤組織TLR4水平對(duì)宮頸癌復(fù)發(fā)的時(shí)間分布擬合效能

2.4 早期宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析

2.4.1 模型變量賦值：根據(jù)單因素KM分析結(jié)果，將上述3種組織功能性蛋白均帶入多因素COX分析中，參考相關(guān)文獻(xiàn)[8,9]，另外加入腫瘤類型、腫瘤大小、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和深層間質(zhì)浸潤(rùn)、切緣狀態(tài)6項(xiàng)，共9項(xiàng)協(xié)變量進(jìn)入 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。見表7、8。

表7 COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型因素分類變量賦值(1)

表8 COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型因素賦值(2)

2.4.2 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析：協(xié)變量分別為TLR4、術(shù)后FIGO病理分期、切緣狀態(tài)、淋巴轉(zhuǎn)移以及深層間質(zhì)浸潤(rùn)，偏回歸系數(shù)(β)分別為1.812、2.982、1.963、1.919、1.209。見表9，圖5。

表9 早期宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析

圖5 協(xié)變量均值處的“非復(fù)發(fā)”生存函數(shù)

3 討論

HMGB1作為重要的晚期炎性因子，對(duì)炎癥的維持與放大具有重要作用[10-13]。RAGE屬于多配體的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，相關(guān)研究顯示，其與炎性反應(yīng)、腫瘤侵襲力、神經(jīng)血管再生等均存在關(guān)聯(lián)[14,15]。TLR4屬于TLRs家族跨膜非催化性蛋白質(zhì)，參與非特異性免疫，于髓源性細(xì)胞上表達(dá)，可識(shí)別革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)、宿主壞死細(xì)胞釋放產(chǎn)生的休克蛋白等，還可被局部?jī)?nèi)源性酶級(jí)聯(lián)活化反應(yīng)等激活[16]。TLR4過(guò)表達(dá)，可激活形成TLR4-MD2-LPS二聚體復(fù)合物，啟動(dòng)相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和miRNA的下游信號(hào)途徑。因此，越來(lái)越多的研究顯示，TLR4的炎性表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤周圍的炎性環(huán)境和腫瘤進(jìn)展有著不可忽視的作用[17,18]。本次研究選取宮頸癌早期(Ⅰa1～Ⅱa2)患者為研究樣本，樣本均行宮頸錐切術(shù)或根治術(shù)治療，以血清及腫瘤組織中HMGB1、RAGE和TLR4為主要評(píng)估指標(biāo)；根據(jù)以往文獻(xiàn)研究結(jié)果得到，宮頸癌高復(fù)發(fā)期為1～2年[19]，故本次研究跟蹤隨訪期定為24個(gè)月。ROC曲線分析結(jié)果顯示，術(shù)后血清中HMGB和TLR4對(duì)24個(gè)月期宮頸癌復(fù)發(fā)具有一定的量化預(yù)測(cè)診斷價(jià)值，曲線下面積分別達(dá)到0.824和0.860；RAGE的ROC曲線較TLR4診斷價(jià)值偏低。血清HMGB和TLR4診斷臨界值分別為0.73 ng/ml和24.88 pg/ml，且靈敏度、特異度均達(dá)到70%以上，其中TLR4診斷臨界值靈敏度為86.49%，對(duì)早期篩查意義較高；而RAGE診斷臨界值為188 pg/ml，靈敏度為91.89%，雖然特異度僅為49.50%，但對(duì)于早期篩查對(duì)于敏感性的較高要求，其血清水平仍舊具有一定的意義?？山Y(jié)合相應(yīng)的預(yù)測(cè)診斷臨界值，進(jìn)行早期重點(diǎn)干預(yù)。

Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型屬于半?yún)?shù)回歸模型，用以描述不隨時(shí)間變化的多個(gè)因素對(duì)某一時(shí)間某事件發(fā)生率的影響[20]。本次研究將腫瘤組織HMGB1、RAGE和TLR4的表達(dá)水平連同其他熱點(diǎn)研究因素共9項(xiàng)，作為協(xié)變量進(jìn)入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)合時(shí)間因素，得到影響宮頸癌復(fù)發(fā)的協(xié)變量分別為TLR4、術(shù)后FIGO病理分期、切緣狀態(tài)、淋巴轉(zhuǎn)移以及深層間質(zhì)浸潤(rùn)。HMGB1和RAGE由于與TLR4激活炎性反應(yīng)通路作用上具有交互性，在多因素分析中并沒(méi)有表現(xiàn)出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外FIGO病理分期較高、切緣陽(yáng)性、存在淋巴轉(zhuǎn)移及深層間質(zhì)浸潤(rùn)的患者，其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。

因此可得，早期宮頸癌(Ⅰa1～Ⅱa2)患者術(shù)后血清及腫瘤組織中HMGB1、RAGE和TLR4水平對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)時(shí)限等均具有一定的定性及定量診斷價(jià)值，可結(jié)合臨床、病理表現(xiàn)，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)樣本進(jìn)行重點(diǎn)檢測(cè)干預(yù)；對(duì)宮頸癌宮頸錐切術(shù)及根治術(shù)術(shù)后判斷預(yù)后，具有一定的意義。