煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型在產(chǎn)后抑郁中的作用機制研究

冀 荔，李月琴，王烈宏

(青海紅十字醫(yī)院婦產(chǎn)科，青海 西寧 810000)

產(chǎn)后抑郁(postpartum depression，PPD)是一種以產(chǎn)褥期持續(xù)抑郁為特征的精神障礙，主要表現(xiàn)為抑郁、失眠、焦慮、悲傷、內(nèi)疚、易怒甚至有自殺傾向[1]。PPD不僅影響產(chǎn)婦的身心健康，而且剝奪了母親對嬰兒的有效照顧，影響婚姻關(guān)系[2]。然而PPD的病理機制尚不清楚。因此探索PPD的病理機制并尋找其發(fā)展的關(guān)鍵靶點具有緊迫性。煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(α7 subtype of nicotinic acetylcholine receptors，α7nAChR)通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的迷走神經(jīng)上調(diào)抗炎通路[3]。激活α7nAChR可能是炎癥相關(guān)精神和神經(jīng)疾病的潛在治療方法[4]。先前研究發(fā)現(xiàn)，α7nAChR的藥理學(xué)激活在暴露于慢性應(yīng)激的小鼠中產(chǎn)生抗抑郁作用[5]。因此有理由推測α7nAChR在PPD中起著關(guān)鍵作用。本研究建立了激素模擬妊娠(hormone-simulated pregnancy，HSP)誘導(dǎo)的PPD小鼠模型，以確定α7nAChR在PPD中的作用，旨在提供一些新的治療PPD的思路。

1 材料與方法

1.1 材料實驗時間2021年1～6月。C57BL/6J小鼠50只(雌性，3個月大)購自上海sipprbk實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為(22±2)℃和12∶12小時光/暗循環(huán)的房間內(nèi)自由獲取食物和水。動物實驗經(jīng)青海紅十字醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(QHLY-2019-011)，并嚴(yán)格遵循實驗動物使用的3R原則。

1.2 PPD小鼠模型建立參照文獻(xiàn)方法[6]將雌性C57BL/6J小鼠制成HSP誘導(dǎo)的PPD模型。在1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉下使用無菌技術(shù)對它們進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，并恢復(fù)7天。將去卵巢的小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(20 μg/kg，溶于芝麻油)和黃體酮(32 mg/kg，溶于芝麻油)，每天1次，連續(xù)16天。然后停用黃體酮并繼續(xù)服用高劑量苯甲酸雌二醇 (400 μg/kg) 7天。對照小鼠進(jìn)行假手術(shù)并僅接受芝麻油。最后一次注射后進(jìn)行為期10天的PNU282987治療，然后進(jìn)行行為評估。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，然后快速頸椎脫位處死。

1.3 分組處理將50只小鼠分為2個獨立的實驗組。

1.3.1實驗組1 考察PNU282987(α7nAChR激動劑)對HSP誘導(dǎo)的PPD模型小鼠抑郁樣行為以及α7nAChR表達(dá)、NLRP3炎癥小體激活影響。將C57BL/6J小鼠隨機分為3組各10只，對照組：假手術(shù)加腹腔注射生理鹽水治療； PPD組：PPD加生理鹽水腹腔注射； PNU282987組：PPD加腹腔注射PNU282987，1 mg/(kg·d)，持續(xù)10 d，購自英國Abcam公司。

1.3.2實驗組2 為確認(rèn)α7nAChR在PPD小鼠中的神經(jīng)保護(hù)作用，研究采用α7nAChR inhibitor抑制小鼠海馬組織中α7nAChR表達(dá)。將C57BL/6J小鼠隨機分為2組各10只，①PNU282987組：PPD加腹腔注射PNU282987，1 mg/(kg·d)；②PNU282987+α7nAChR inhibitor組：PPD加腹腔注射PNU282987 1 mg/(kg·d)，α7nAChR inhibitor 5 mg/(kg·d)，持續(xù)10 d，購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.4 行為評估

1.4.1尾懸試驗(TST)[7]小鼠的尾巴用膠帶纏住，倒扣在鉤子上。記錄每只小鼠的不動時間6分鐘。只有當(dāng)小鼠被動地懸掛并且完全靜止時，它們才被認(rèn)為是不動的。最后4分鐘的不動時間用TailSuspScan(美國Clever Sys公司)測量。

1.4.2強制游泳測試(FST)[7]迫使小鼠在室溫下[約(22±1)℃]充滿水的開口圓柱形容器(高25 cm，直徑10 cm)中游泳6 分鐘，深度為14 cm。當(dāng)小鼠以直立姿勢漂浮時，不動被定義為僅進(jìn)行很小的運動以將其頭部保持在水面之上以滿足呼吸的需要。在最后4分鐘內(nèi)采用TailSuspScan(Clever Sys)記錄了不動的持續(xù)時間。

1.5 Nissl染色實驗結(jié)束時用戊巴比妥鈉麻醉。將生理鹽水注入左心室，然后灌入PBS和4%多聚甲醛。收集腦組織固定在OCT包埋劑(德國Leica公司)并冷凍。每個大鼠腦切片的厚度為30 μm，并用Nissl染色液染色。在400倍BX 41型號光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察海馬CA1區(qū)Nissl染色切片。

1.6 免疫熒光嵌入的腦組織通過冷凍切片機切片。腦切片的厚度為10 μm。根據(jù)實驗程序，首先使用山羊血清進(jìn)行阻斷。然后將抗體α7nAChR(1∶200，美國Cell Signaling公司)在4 ℃下孵育過夜。次日，將切片與熒光抗體在室溫下孵育1 h，并在熒光顯微鏡(日本Nikon公司)下拍照，觀察海馬CA1區(qū)免疫熒光染色。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析使用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液(美國Thermo Scientific公司)從海馬組織中提取蛋白質(zhì)。在4 ℃下以12000 × g離心20分鐘后收集上清液。將提取的蛋白質(zhì)加入5 ×體積的上樣緩沖液中，95 ℃變性5分鐘。在SDS-PAGE凝膠上分離等量的每種蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用含0.1% Tween-20/Tris緩沖鹽水(TBS-T)的5%脫脂牛奶封閉1 h。然后，將膜與α7nAChR (1∶1000)、NLRP3 (1∶500)、NF-κB p65 (1∶500)、NF-κB p-p65 (1∶500)、pro-IL-1β (1∶1000)、IL-1β (1∶1000)、pro-cleaved-caspase 1 (1∶500)、cleaved-caspase 1(1∶500)、或甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1∶1000)抗體(均購自美國Cell Signaling公司)在4 ℃下孵育過夜。在室溫下將辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗孵育1小時后，使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑(美國Millipore公司)通過化學(xué)發(fā)光檢測觀察蛋白質(zhì)條帶。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)使用t檢驗或單向方差分析，然后通過Tukey進(jìn)行多重比較檢驗。數(shù)據(jù)表示為至少3個獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSP誘導(dǎo)的PPD模型小鼠抑郁樣行為評估與對照組及PNU282987組相比，PPD組小鼠在尾懸測試和強迫游泳測試中的不動時間顯著增加(P<0.001)。Nissl染色結(jié)果顯示，PPD組海馬CA1區(qū)Nissl染色的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較對照組及PNU282987組顯著減少(P<0.001)。見表1。

表1 PPD模型小鼠的行為評估

2.2 PPD小鼠海馬組織中α7nAChR表達(dá)情況比較與對照小鼠相比，PPD組小鼠海馬組織α7nAChR的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低(1.00±0.04 vs 0.32±0.04，P<0.001)(圖1)。雙重免疫熒光結(jié)果顯示，PPD組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中α7nAChR染色顯著降低(25.16±3.03 vs 8.21±1.65，P<0.001)。PNU282987治療顯著增加了PPD小鼠海馬組織中α7nAChR表達(dá)(蛋白質(zhì)水平：0.73±0.08 vs 0.32±0.04；α7nAChR陽性表達(dá)面積：16.35±2.01 vs 8.21±1.65，P<0.01)。

圖1 PPD小鼠海馬組織中α7nAChR的表達(dá)情況

2.3 PNU282987在體內(nèi)抑制NLRP3炎癥小體激活情況比較與對照組及PNV282987組相比，PPD小鼠海馬組織中NLRP3、NLRP3炎癥小體相關(guān)啟動效應(yīng)子NF-κB、激活效應(yīng)子pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。PNU282987治療顯著降低了PPD小鼠海馬組織中NLRP3、NF-κB、pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β表達(dá)(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 小鼠海馬組織中NLRP3炎性體信號的免疫印跡分析 (n=4)。

表2 光密度分析定量NLRP3、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB、cleaved-caspase 1、IL-1β的相對表達(dá)

2.4 抑制α7nAChR表達(dá)對PNU282987的神經(jīng)保護(hù)作用影響為了進(jìn)一步確認(rèn)α7nAChR在PPD小鼠中的神經(jīng)保護(hù)作用，采用α7nAChR inhibitor抑制小鼠海馬組織中α7nAChR表達(dá)，并通過免疫印跡證實小鼠海馬組織中α7nAChR表達(dá)顯著降低(1.00±0.04 vs 0.22±0.03，P<0.001)(圖3a)。與PNU282987組小鼠相比，PNU282987+α7nAChR inhibitor組小鼠在尾懸測試(86.07±2.64 vs 148.92±3.73，P<0.01)和強迫游泳測試(65.37±2.33 vs 127.53±4.45，P<0.001)中的不動時間顯著增加，且海馬CA1區(qū)Nissl染色的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著降低(303.42±6.53 vs 247.82±5.19，P<0.05)。此外，α7nAChR inhibitor逆轉(zhuǎn)了PNU282987對PPD小鼠海馬組織中NLRP3、NF-κB、pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β表達(dá)的抑制作用(P<0.05)。見表3、圖3b。

表3 光密度分析定量NLRP3、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB、cleaved-caspase 1、IL-1β的相對表達(dá)

圖3 抑制α7nAChR表達(dá)對PNU282987的神經(jīng)保護(hù)作用 a：PNU282987組和PNU282987+α7nAChR inhibitor組小鼠海馬組織中α7nAChR蛋白表達(dá)；b：小鼠海馬組織中NLRP3炎性體信號的免疫印跡分析

3 討論

現(xiàn)代女性工作和生活壓力很大，PPD的發(fā)病率也呈上升趨勢[8]。PPD不僅嚴(yán)重?fù)p害女性的身心健康，而且對嬰兒的健康成長、家庭和睦、社會穩(wěn)定也帶來有害影響[9]。PPD的病理機制尚未完全闡明，研究報道通常涉及單胺遞質(zhì)缺乏、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂、神經(jīng)營養(yǎng)因子內(nèi)分泌減少、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥假說等[10]。在本研究中，PPD誘導(dǎo)α7nAChR表達(dá)降低，進(jìn)而激活NLRP3炎性體，導(dǎo)致海馬區(qū)Nissl染色的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，出現(xiàn)抑郁樣行為。

α7nAChR是大腦中的主要nAChR亞型，對鈣具有較高的相對滲透性。α7nAChR的位置及其鈣滲透性使受體能夠調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放和突觸可塑性[11]。α7nAChR激動劑DMXBA顯著改善了慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為[5]，表明α7nAChR可能是治療抑郁樣癥狀的靶點。在戒斷尼古丁的小鼠中，PNU282987可以以劑量相關(guān)的方式減少焦慮樣行為[12]。α7nAChR在與抑郁癥有關(guān)的炎癥中起著重要的抗炎作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Chrna7 KO小鼠通過全身炎癥表現(xiàn)出抑郁樣表型[14]。α7nAChR的藥理學(xué)激活在炎癥呈遞小鼠中產(chǎn)生了類似抗抑郁藥的作用[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過向PPD小鼠注射選擇性α7nAChR激動劑PNU282987能夠減輕小鼠抑郁樣行為，增加了海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。進(jìn)一步研究顯示，α7nAChR上調(diào)抑制了PPD誘導(dǎo)的NLRP3炎性體激活，表明α7nAChR可能通過減少NLRP3炎性體激活對PPD神經(jīng)炎癥中發(fā)揮抗炎作用。

越來越多的證據(jù)表明炎癥小體誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是PPD發(fā)病機制的重要組成部分[7]。NLRP3炎癥小體是研究最多的炎癥小體。為了成功激活NLRP3炎癥小體，提出了兩個信號：①信號1(啟動)。NLRP3和pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄需要啟動信號。②信號2(激活)。激活信號負(fù)責(zé)NLRP3炎癥小體的組裝和激活[17]。最近的一項研究報告，在HSP誘導(dǎo)的小鼠PPD模型中發(fā)現(xiàn)海馬組織中NLRP3炎癥小體激活[18]。與該結(jié)果類似，我們的研究表明，PPD小鼠海馬組織中NLRP3炎性體激活和IL-1β的水平顯著增加。為了進(jìn)一步確認(rèn)α7nAChR對PPD小鼠中的神經(jīng)保護(hù)作用是否與減少NLRP3炎性體激活有關(guān)，研究采用α7nAChR inhibitor抑制小鼠海馬組織中α7nAChR表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)PNU282987對PPD小鼠抑郁樣行為的改善作用被顯著逆轉(zhuǎn)，并且NLRP3炎性體激活。這些發(fā)現(xiàn)證明了α7nAChR抑制NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的PPD神經(jīng)炎癥。