白藜蘆醇調(diào)控hsa-miR-4689-3p、hsa-miR-4741-3p保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞

張 銘，于昕新，浦葒秋，田 陽(yáng)，韓鎧禧，趙天月，梁競(jìng)天，楊 果，閔鈺淇，石 艷

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)是DN極其重要的靶細(xì)胞。MicroRNA(miRNA)是人體中普遍存在的重要調(diào)節(jié)因子。研究表明，miRNA對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的肥大具有調(diào)節(jié)作用[1-3]，miRNA可以作為DN早期檢測(cè)和進(jìn)展的生物標(biāo)志物[4]。miRNA通過(guò)靶向其各自的靶標(biāo)來(lái)調(diào)節(jié)與纖維化相關(guān)的基因的表達(dá)，從而影響了DN中腎纖維化的進(jìn)程[5]。白藜蘆醇是天然具有抗氧化作用的多酚類(lèi)物質(zhì)，可抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖[6]，改善腎臟組織當(dāng)中的脂毒性、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激等[7]，具有降血糖作用[8]，但其對(duì)高糖下的MCs中miRNA的影響目前尚不明確。我們前期研究采用miRNA芯片技術(shù)篩選出腎小球系膜細(xì)胞正常組，高糖組和白藜蘆醇藥物干預(yù)組這三組特異性差異表達(dá)的MicroRNA。本研究擬結(jié)合文獻(xiàn)和前期結(jié)果，選擇hsa-miR-4689-3p、hsa-miR-4741-3p作為研究對(duì)象，采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)其在各組腎小球系膜細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因，探討白藜蘆醇對(duì)高糖下腎小球系膜細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))，胎牛血清(天津?yàn)笊镏破酚邢薰?，中?guó))，白藜蘆醇(南京景竹生物科技有限公司，中國(guó))，TransScript 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系One-Step gDNA Removal (北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，通用RNA提取試劑盒(離心柱型)(廣州東盛生物科技有限公司，中國(guó))，hsa-miR-4689(廣州易錦生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，hsa-miR-4741(廣州易錦生物技術(shù)有限公司，中國(guó))。Stratagene實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)安捷倫公司，美國(guó))。

1.2 MCs的復(fù)蘇，培養(yǎng)、傳代及分組水浴融化HMCs細(xì)胞并滴加10 ml的DMEM低糖培養(yǎng)液(10%胎牛血清)。離心，棄上清，10 ml完整營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液吹散細(xì)胞，計(jì)數(shù)、調(diào)整密度后接種于培養(yǎng)瓶中。置于培養(yǎng)箱(37°C，5%CO2)中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每個(gè)培養(yǎng)基補(bǔ)充至8 ml，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將腎小球系膜細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Con)，高糖組(HG)和白藜蘆醇組(Res)。

1.3 real-time PCR檢測(cè)差異表達(dá)的microRNATrizol提取MCs的total RNA。MicroRNA以加尾法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到有更高長(zhǎng)度的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA來(lái)進(jìn)行下一步中PCR擴(kuò)增。按照TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書(shū)操作，用2-△△CT法測(cè)定相對(duì)表達(dá)量。

1.4 靶基因預(yù)測(cè)采用MiRanda與TargetScan兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS19.0 軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用最小顯著差法。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 real-time PCR檢測(cè)差異表達(dá)microRNA與Con組相比，HG組中的hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯降低。與HG組相比，Res組人腎小球系膜細(xì)胞中的hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，其結(jié)果與本研究前期microRNA芯片一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的相對(duì)表達(dá)量

2.2 microRNA的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)合前期microRNA芯片與real-time PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。MiRanda與TargetScan兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)兩個(gè)microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶基因取交集之后，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-4689有OPA3,HCN4,HPSE等75個(gè)靶基因，其中與DN密切相關(guān)的靶基因有FASN、PAX2、PTPN5、ANGPT2等，hsa-miR-4741有CILP2,MMAB,POR等53個(gè)靶基因，其中與DN密切相關(guān)的靶基因有CD4、PLVAP、GAS2L1、SMURF1、KDM4B、SERPINA3、CACNA1C、DDR1等,如表2所示。

表2 hsa-miR-4689-3p和hsa-miR-4741-3p與DN密切相關(guān)靶基因

2.3 GO功能富集分析結(jié)果

對(duì) hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-4689-3p的靶基因與細(xì)胞外基質(zhì)組織功能、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、離子跨膜運(yùn)輸、蛋白質(zhì)結(jié)合、T細(xì)胞激活、脂質(zhì)分解、膜電位調(diào)節(jié)、血管生成、氯離子通道調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能密切相關(guān)；hsa-miR-4741-3p的靶基因與細(xì)胞外基質(zhì)組織功能、酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、響應(yīng)鉀離子等生物學(xué)功能密切相關(guān)。

3 討論

目前已有研究表明白藜蘆醇基于其抗氧化應(yīng)激、抗自噬和抗炎癥等效果對(duì)DN有一定的防治效果，且對(duì)相關(guān)microRNA具有一定的調(diào)節(jié)作用[10-13]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：高糖環(huán)境培養(yǎng)MCs可誘導(dǎo)其異常增殖，白藜蘆醇對(duì)高糖下MCs有顯著的抑制作用，能夠改善高糖引起的MCs過(guò)度增殖。

microRNA的發(fā)現(xiàn)為糖尿病腎病機(jī)制的研究與防治方法的探尋帶來(lái)了新思路。本研究從microRNA表達(dá)水平的角度，探討白藜蘆醇對(duì)MCs的保護(hù)作用的可能機(jī)制，為其更好的用于治療DN提供良好的理論基礎(chǔ)。本研究中，real-time PCR的結(jié)果顯示，經(jīng)白藜蘆醇處理的高糖條件下MCs中hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而兩者在HG組中呈現(xiàn)低表達(dá)。這與我們前期的芯片結(jié)果一致，我們推測(cè)白藜蘆醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的表達(dá)起到對(duì)MCs的保護(hù)作用。

靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-miR-4689有OPA3,HCN4,HPSE等75個(gè)靶基因，hsa-miR-4741有CILP2,MMAB,POR等53個(gè)靶基因，功能涉及范圍十分廣泛，包括細(xì)胞增殖，分化，血管生成，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多方面。其中hsa-miR-4689的靶基因FASN已被驗(yàn)證在DN的小鼠腎臟中異常上調(diào)，并且FASN的高表達(dá)可通過(guò)導(dǎo)致腎小球硬化來(lái)加重糖尿病腎損傷[14]； PTPN5被檢測(cè)到在糖尿病小鼠的腎組織中高表達(dá)，且利用刺參酶解物下調(diào)PTPN5后，顯示出較好的降糖效果[15]；ANGPT2 可在高糖下協(xié)同誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，且通過(guò)抑制miR-33-5p來(lái)啟動(dòng)凋亡程序[16]。hsa-miR-4741的靶基因CD4編碼 T 淋巴細(xì)胞的 CD4 膜糖蛋白，DN下血清中CD4的表達(dá)異常下調(diào)，從而導(dǎo)致DN患者免疫功能低下[17]；PLVAP 是一種完整的跨膜糖蛋白，其在正常小鼠的腎小球中表達(dá)呈陰性，但隨著糖尿病腎小球病變程度的加深，PLVAP的表達(dá)逐漸上調(diào)，表明PLVAP 可作為糖尿病腎小球病變的潛在標(biāo)志物[18]； SMURF1是Smad 泛素化調(diào)節(jié)因子-1，在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)增加，并可通過(guò)抑制Nrf2/ARE 信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)糖尿病腎衰竭的發(fā)生與發(fā)展[19]； DDR1 是一種膠原蛋白受體，可與Ⅳ型膠原蛋白結(jié)合，并且在腎臟中高度表達(dá)，尤其是在腎損傷時(shí),通過(guò)其在膠原蛋白結(jié)合中的作用，DDR1已被建議作為腎臟疾病的可能治療靶點(diǎn)[20]。

綜上所述，本研究表明白藜蘆醇對(duì)高糖下MCs的多種microRNA有調(diào)控作用；每一個(gè)microRNA都對(duì)應(yīng)著多個(gè)靶基因。白藜蘆醇對(duì)高糖下MCs的保護(hù)作用可能部分通過(guò)調(diào)節(jié)hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p實(shí)現(xiàn)。對(duì)于hsa-miR-4689-3p和hsa-miR-4741-3p與DN密切相關(guān)的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路將是我們進(jìn)一步研究的課題。