構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的膽管癌預(yù)后模型

張 琳，石張鎮(zhèn)，白元松

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 血液腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春130033)

膽管癌(CCA)是一種侵襲性膽道上皮細(xì)胞惡性腫瘤，占原發(fā)肝癌的10%-15%[1]。目前，手術(shù)仍是首選治療CCA的方法[2]，然而由于缺乏典型的臨床癥狀，很難在早期診斷CCA，因此只有30%-40%的患者適合手術(shù)治療，且術(shù)后復(fù)發(fā)的概率較高[3]。鐵死亡是一種依賴鐵的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，由脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)度引起，與多種腫瘤的發(fā)生和治療反應(yīng)有關(guān)[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明鐵死亡具有抑制腫瘤的作用，可用于腫瘤的治療[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)是非蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，參與多種復(fù)雜的生物過(guò)程[6]，lncRNAs在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7]。本研究旨在利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中CCA的表達(dá)數(shù)據(jù)篩選出與鐵死亡基因相關(guān)的lncRNAs，然后基于這些lncRNAs構(gòu)建CCA的預(yù)后生存模型。

1 材料與方法

1.1 獲取數(shù)據(jù)集

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://gdc.nci.nih.gov/) 中下載 45 例膽管癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)，基因表達(dá)數(shù)據(jù)與GENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)資料(https://www.gencodegenes.org/hu-man/,gencode.v22)匹配添加注釋信息。從FerDb數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.zhounan.org/ferrdb/)中獲得259個(gè)鐵死亡相關(guān)基因[8]。

1.2 篩選鐵死亡相關(guān)的lncRNAs

用“l(fā)imma”R包識(shí)別腫瘤組織與正常組織間差異表達(dá)的lncRNAs。通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析計(jì)算識(shí)別出與鐵死亡基因表達(dá)量相關(guān)的差異 lncRNAs。

1.3 構(gòu)建預(yù)后模型

1.4 基因功能富集分析

用“l(fā)imma”R包獲得正常組織與腫瘤組織中差異表達(dá)基因，選擇與多因素COX分析篩選出的關(guān)鍵的影響預(yù)后的鐵死亡相關(guān)差異lncRNAs共表達(dá)的差異基因。用“clusterProfiler”R包對(duì)這些差異基因進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，研究這些基因所具有的生物學(xué)功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析在R語(yǔ)言(4.0.4版本)中利用相關(guān)的R包進(jìn)行，認(rèn)為P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理及預(yù)后模型的構(gòu)建

經(jīng)秩和檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)性分析獲得537個(gè)鐵死亡相關(guān)差異lncRNAs。通過(guò)單因素COX分析及多因素COX分析獲得3個(gè)用于構(gòu)建預(yù)后模型的關(guān)鍵的鐵死亡相關(guān)差異lncRNAs，并得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式：RS=3.93X LINC01714表達(dá)量+4.90X LINC02997表達(dá)量+-0.77X LINC01621表達(dá)量。用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式計(jì)算每個(gè)患者的得分，將高于中位得分的患者歸為高風(fēng)險(xiǎn)組，反之為低風(fēng)險(xiǎn)組。生存分析(K-M曲線)結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組總存活率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組(P=0.0012)(圖1)。ROC曲線得到1年，3年及5年的AUC分別為0.81、0.81及0.82，說(shuō)明模型能夠較好的預(yù)測(cè)患者的預(yù)后(圖2)。

圖1 K-M曲線顯示高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的患者預(yù)后

圖2 1年，3年和5年的ROC曲線

2.2 基因功能富集分析

在篩選出的312個(gè)與關(guān)鍵lncRNAs共表達(dá)的蛋白編碼差異基因中，功能富集分析顯示這些差異基因主要富集在酶抑制劑活性、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體活性及鐵離子結(jié)合等。通路主要富集在膽汁分泌、化學(xué)致癌受體活化、PPAR信號(hào)通路及藥物代謝等。

3 討論

膽管癌具有很高的侵襲性，中位生存期小于24個(gè)月，是一種難治性預(yù)后差的惡性腫瘤。近年來(lái)，許多研究探索新的生物標(biāo)志物和基因標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)膽管癌的預(yù)后[9-12]，也有部分研究通過(guò)鐵死亡相關(guān)lncRNAs構(gòu)建模型來(lái)預(yù)測(cè)癌癥患者的預(yù)后[13-17]。提示鐵死亡相關(guān)的lncRNAs在調(diào)控腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，在膽管癌中尚未發(fā)現(xiàn)用鐵死亡相關(guān)的lncRNAs評(píng)價(jià)預(yù)后的研究。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選了在腫瘤組織和正常組中差異表達(dá)的lncRNAs，用相關(guān)性分析獲得了鐵死亡相關(guān)的差異lncRNAs，經(jīng)過(guò)單因素COX分析和多因素COX分析獲得了由“LINC01714”,“LINC02997”,“LINC01621”構(gòu)建的預(yù)后模型，該模型可將CCA患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，隨后用生存分析和ROC曲線證實(shí)了模型有良好的效能。在篩選的3個(gè)關(guān)鍵lncRNAs中，Li H等人通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC01714在CCA的發(fā)生發(fā)展中有重要意義[18]。研究表明，LINC01714與FOXO3蛋白相互作用，抑制其在CCA細(xì)胞中的磷酸化水平。這也為我們的研究結(jié)果提供了佐證，提示LINC01714可作為CCA患者治療的候選藥物。目前，尚沒有關(guān)于其余2個(gè)lncRNAs在腫瘤中的研究，對(duì)于本研究中新發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)預(yù)后lncRNAs標(biāo)志物，尚需臨床和實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究探求其功能和機(jī)制。

本研究存在幾個(gè)局限性：首先，由于CCA的低發(fā)病率，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的樣本較小。其次，研究結(jié)果沒有通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證進(jìn)一步闡明潛在的機(jī)制。盡管如此，本研究仍為膽管癌的個(gè)體化治療提供了有潛力的生物標(biāo)志物，為膽管癌的預(yù)后和治療提供了新線索。