基于T 淋巴細(xì)胞PPAR-γ-核因子-κB 通路探討平喘固本膏對(duì)支氣管哮喘緩解期患者的作用機(jī)制*

于 鴻，計(jì)忠宇，趙 輝，盧麗艷，代良田

河北醫(yī)科大學(xué)滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院，河北 滄州 061001

目前，全球哮喘患者人數(shù)約3億，國(guó)內(nèi)約有3000萬(wàn)，雖然治療策略有所改進(jìn)，但死亡率并未降低［1］。另外，在治療過(guò)程中支氣管哮喘緩解期極易被忽視，易致癥狀反復(fù)發(fā)作，加重病情，嚴(yán)重時(shí)可對(duì)患者生命造成威脅［2］。因此，支氣管哮喘緩解期應(yīng)給予及時(shí)有效的治療和控制，防止病情加重、改善患者預(yù)后水平對(duì)臨床具有重要意義。目前，西醫(yī)常采用緩解支氣管痙攣、控制氣道炎癥反應(yīng)等治療支氣管哮喘緩解期，但部分患者易出現(xiàn)不良反應(yīng)，影響其治療依從性［3］。中醫(yī)根據(jù)支氣管哮喘患者具體病情對(duì)癥治療取得了滿意療效［4］。哮喘的發(fā)病與T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)，而支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)理與多種包含核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）結(jié)合的κB 位點(diǎn)基因的持續(xù)表達(dá)相關(guān)［5］。因此，本研究基于T淋巴細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖活化受體-γ（PPAR-γ）-NF-κB 通路探討平喘固本膏對(duì)支氣管哮喘緩解期患者的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料將2017 年11 月至2019 年12 月于河北醫(yī)科大學(xué)滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院診治的100 例支氣管哮喘緩解期患者采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和治療組各50 例，均為男性。治療組患者年齡31～51 歲，平均（45.09±10.21）歲；病程1～7 年，平均（3.43±0.96）個(gè)月；哮喘控制測(cè)試（asthma control test，ACT）評(píng)分20～22分，平均（20.31±1.96）分。對(duì)照組患者年齡29～47歲，平均（39.69±8.99）歲；病程1～5 個(gè)月，平均（3.23±1.01）個(gè)月；哮喘控制測(cè)試（ACT）評(píng)分20～22 分，平均（20.27±1.89）分。兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究方案符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《支氣管哮喘防治指南（2020年版）》［6］制定。緩解期是指癥狀發(fā)作后，經(jīng)治療或未予治療，下述癥狀、體征消失，癥狀及肺功能恢復(fù)到急性發(fā)作前水平，且持續(xù)3個(gè)月以上。1）以反復(fù)發(fā)作性氣喘、胸悶等為主要臨床癥狀，臨床癥狀凌晨及夜晚尤為明顯；可聞及雙肺哮鳴音（其特點(diǎn)為呼氣相，彌散性或散在）；自行緩解或經(jīng)治療緩解。2）若缺乏典型臨床癥狀，則需具備下述任意試驗(yàn)中1項(xiàng)為陽(yáng)性，a：支氣管舒張?jiān)囼?yàn)、激發(fā)試驗(yàn)均為陽(yáng)性；b：呼氣流量峰值平均每日晝夜變異率超過(guò)10%或平均每周變異率超過(guò)20%；3）第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1）增加超過(guò)200 mL，且FEV1增加超過(guò)12%。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《支氣管哮喘中醫(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)（2012）》［7］中肺腎兩虛證標(biāo)準(zhǔn)。主證：胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言；次證：不耐勞累、腦轉(zhuǎn)耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟；舌脈：舌淡苔白，脈沉細(xì)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；2）對(duì)本研究藥物不過(guò)敏者；3）1個(gè)月內(nèi)未參加其他藥物研究者；4）心肝腎等重要臟器功能正常者；5）知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)1）其他特殊類(lèi)型哮喘；2）依從性差及無(wú)法正常溝通者；3）存在嚴(yán)重循環(huán)及消化系統(tǒng)疾??；4）合并其他肺部特殊性病理表現(xiàn)者。

1.5 治療方法

1.5.1 對(duì)照組吸入沙美特羅替卡松粉吸入劑（舒利迭，葛蘭素史克公司，批號(hào)：H20121106，規(guī)格：50 μg/250 μg×60泡）每日2次，連續(xù)治療1個(gè)月。

1.5.2 治療組在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上予平喘固本膏。藥物組成：黃精300 g，黃芪300 g，枸杞子200 g，女貞子200 g，補(bǔ)骨脂200 g，太子參200 g，白術(shù)200 g，地龍200 g，浙貝母200 g，五味子200 g，山藥200 g，牡蠣200 g，玉竹200 g，蘇子200 g，杏仁200 g，瓜蔞200 g，桑白皮200 g，厚樸200 g，陳皮200 g，款冬花200 g，紫菀200 g，防風(fēng)200 g，黨參200 g，半夏100 g，甘草300 g，將上述藥物煎煮濃縮，再進(jìn)行辨證論治后加鹿角膠、龜板膠、鱉甲膠、阿膠，并采用蜂蜜、飴糖或木糖醇收膏而成。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 臨床療效根據(jù)《支氣管哮喘中醫(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)（2012）》［7］制定。治愈：氣息短促、動(dòng)則氣促、胸悶等臨床癥狀及體征均消失，ACT 評(píng)分≥24分，中醫(yī)證候積分減少≥95%；有效：氣息短促、動(dòng)則氣促、胸悶等臨床癥狀及體征明顯減輕，ACT 評(píng)分22～24 分，中醫(yī)證候積分減少75%～94%；好轉(zhuǎn)：氣息短促、動(dòng)則氣促、胸悶等臨床癥狀及體征均好轉(zhuǎn)，ACT 評(píng)分20～22 分，中醫(yī)證候積分減少35%～74%；無(wú)效：上述癥狀均無(wú)明顯變化或加重。

1.6.2 中醫(yī)證候積分根據(jù)《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》［7］制定。根據(jù)胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言的嚴(yán)重程度將其分為無(wú)、輕度、中度、重度，評(píng)分0～6 分；根據(jù)不耐勞累、腦轉(zhuǎn)耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟的嚴(yán)重程度將其分為無(wú)、輕度、中度、重度，評(píng)分0～3分，得分越高癥狀越明顯。

1.6.3 HMGB1、cAMP、LTD4分別在治療前后抽取患者靜脈血5 mL，離心后分2 份于-35℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。? 份血清采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）及白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）水平。

1.6.4 免疫功能取另外1 份血清采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）及免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）。

1.6.5 IL-10 及T 淋巴細(xì)胞NF-κB 活化率治療前后抽取患者外周靜脈血，肝素抗凝，采用密度梯度高心法將外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monoculear cell，PBMC）分離，細(xì)胞懸于RPMI-1649 培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度設(shè)置為1×106/mL，在培養(yǎng)箱中加入PBMC懸液，培養(yǎng)2 h，淋巴細(xì)胞濃度設(shè)置為1×106mmol/mL，加入50 μg/mL 植物血凝素，接種到培養(yǎng)板中，單純培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后取細(xì)胞懸液離心5 min，提取T 淋巴細(xì)胞上清液，封口，保存于-20℃冰箱內(nèi)，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)水平。用T淋巴細(xì)胞沉淀涂片對(duì)NF-κ活性進(jìn)行免疫化學(xué)染色，胞核染色呈棕黃色為陽(yáng)性，NF-κ活化率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，在100 倍油鏡下觀察，每張片計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證候積分治療后兩組患者胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言、不耐勞累、腦轉(zhuǎn)耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟評(píng)分均較治療前降低，治療組降低更明顯（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較（±s） 分

表1 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較（±s） 分

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對(duì)照組例數(shù)50 50時(shí)間治療前治療后治療前治療后胸悶喘息4.87±0.37 0.46±0.12*#4.81±0.32 0.97±0.11*氣息短促4.78±0.34 0.41±0.09*#4.78±0.29 0.93±0.10*肢體欠溫4.72±0.32 0.39±0.11*#4.68±0.33 0.92±0.12*神疲懶言4.68±0.29 0.43±0.13*#4.62±0.31 0.91±0.14*不耐勞累2.12±0.21 0.38±0.11*#2.09±0.19 0.65±0.14*腦轉(zhuǎn)耳鳴2.10±0.19 0.35±0.09*#2.07±0.17 0.63±0.12*夜尿頻多2.11±0.15 0.36±0.13*#2.02±0.14 0.66±0.13*腰膝酸軟2.08±0.14 0.32±0.12*#2.05±0.12 0.67±0.12*

2.2 臨床療效治療組總有效率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者臨床療效比較

2.3 HMGB1、cAMP 及LTD4 水平治療后兩組患者HMGB1 及LTD4 水平均較治療前降低，cAMP 水平升高，與對(duì)照組相比，治療組HMGB1 及LTD4 水平更低，cAMP水平更高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療前后HMGB1、cAMP及LTD4水平比較（±s）

表3 兩組患者治療前后HMGB1、cAMP及LTD4水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對(duì)照組例數(shù)50 50時(shí)間治療前治療后治療前治療后HMGB1（ng/mL）8.12±1.02 4.12±1.01*#8.07±1.04 6.23±1.06*cAMP（μmol/L）11.89±1.23 28.03±1.32*#11.76±1.28 20.18±1.37*LTD4（mg/L）128.98±5.93 52.19±5.88*#127.99±6.01 82.19±6.09*

2.4 免疫功能治療后兩組患者IgE 水平均較治療前降低，治療組降低更明顯（P＜0.05）；IgM、IgG、IgA 水平均較治療前升高，治療組升高更明顯（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組患者治療前后免疫功能比較（±s） g/L

表4 兩組患者治療前后免疫功能比較（±s） g/L

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對(duì)照組例數(shù)50 50時(shí)間治療前治療后治療前治療后IgE 80.24±3.29 49.87±3.32*#80.01±3.32 59.87±3.42*IgM 1.42±0.32 2.51±0.29*#1.46±0.35 2.03±0.31*IgG 6.47±0.67 8.36±0.72*#6.52±0.71 7.81±0.73*IgA 1.52±0.43 2.73±0.51*#1.54±0.45 2.11±0.48*

2.5 IL-10 及T 淋巴細(xì)胞NF-κB 活化率治療后兩組IL-10 水平較治療前升高，T 淋巴細(xì)胞NF-κB活化率較治療前降低，與對(duì)照組相比，治療組IL-10水平更高，T淋巴細(xì)胞NF-κB活化率更低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 兩組患者治療前后IL-10及T淋巴細(xì)胞NF-κB活化率比較（±s）

表5 兩組患者治療前后IL-10及T淋巴細(xì)胞NF-κB活化率比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對(duì)照組例數(shù)50 50時(shí)間治療前治療后治療前治療后IL-10（pg/mL）6.09±0.43 9.69±0.36*#6.04±0.41 8.21±0.32*T淋巴細(xì)胞NF-κB活化率（%）54.89±7.63 27.98±7.21*#54.79±7.59 39.98±7.43*

3 討論

支氣管哮喘是由氣道上皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等參與的氣道炎癥性疾病，其主要特點(diǎn)為氣道高反應(yīng)性、痰液分泌增加及氣道炎癥反應(yīng)，可誘發(fā)呼吸困難、胸悶、喘息、咳嗽等癥狀，且上述癥狀呈反復(fù)性發(fā)作。該病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與霧霾、氣道高反應(yīng)性、神經(jīng)機(jī)制及免疫-炎癥反應(yīng)等相互作用有關(guān)［8］。根據(jù)該病的發(fā)作程度可分為緩解期、慢性持續(xù)期及急性期，其中支氣管哮喘緩解期是支氣管哮喘治療的關(guān)鍵期，其對(duì)該病的演變及預(yù)后造成不同程度影響。若未得到及時(shí)有效治療，會(huì)延長(zhǎng)支氣管哮喘病程，致使氣道產(chǎn)生不可逆性縮窄、重塑［9］。目前，臨床以對(duì)癥治療為主，包括受體激動(dòng)劑、茶堿類(lèi)、糖皮質(zhì)激素類(lèi)等，但可能會(huì)引發(fā)心律失常等不良反應(yīng)。因此，探索有效方法治療支氣管哮喘緩解期是臨床醫(yī)師研究的熱點(diǎn)。

支氣管哮喘緩解期屬中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇，以痰、瘀、虛為主要病理因素，主要涉及肺脾腎3 臟，其中肺腎發(fā)病最為嚴(yán)重，主要病機(jī)為肺腎兩虛，痰瘀阻肺結(jié)為窠臼。由于體內(nèi)停積之痰，外感寒邪，致使氣機(jī)紊亂，影響肺的宣發(fā)、肅降功能，與“伏痰”相互搏結(jié)，阻塞氣道，誘發(fā)氣急、喘息、哮喘等癥狀；肺病日久，耗傷肺氣，影響肺的生理功能，造成機(jī)體內(nèi)津液輸布代謝異常，形成痰；肺氣不足，則降低機(jī)體抵御功能，誘發(fā)疾??；肺氣不足會(huì)耗傷他臟，導(dǎo)致腎氣虧虛。因肺主呼氣，腎主納氣，肺腎兩虛可誘發(fā)氣急、喘息等癥狀。肺為金，腎為水，金生水。根據(jù)“金水相生”“久病及腎”“久病必虛必瘀”理論，在養(yǎng)肺補(bǔ)腎健脾的同時(shí)，需祛痰活血化瘀［3］。平喘固本膏中君藥黨參補(bǔ)中益氣，黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰健脾、潤(rùn)肺益腎，黃芪益衛(wèi)固表、補(bǔ)益肺氣，3藥合用益肺納腎健脾，補(bǔ)3臟之不足；臣為女貞子、補(bǔ)骨脂、太子參、白術(shù)、地龍、浙貝母、五味子、山藥、牡蠣、款冬花、桑白皮、枸杞子，可輔助君藥增加補(bǔ)益之功，共湊調(diào)和陰陽(yáng)、養(yǎng)肺滋陰、行氣化痰止咳之功。佐藥玉竹、蘇子、杏仁、瓜蔞、厚樸、陳皮、紫苑、防風(fēng)、黨參、半夏化痰止咳，降逆平喘；使藥甘草止咳平喘、調(diào)和諸藥。李鞍英［10］研究指出，補(bǔ)肺固元膏可有效緩解支氣管哮喘緩解期患者臨床癥狀，降低炎癥因子水平。本研究結(jié)果顯示，治療后治療組患者胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言、不耐勞累、腦轉(zhuǎn)耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟評(píng)分低于對(duì)照組，療效優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），提示平喘固本膏可改善支氣管哮喘緩解期患者臨床癥狀。

HMGB1 屬非組蛋白核蛋白之一，在炎癥因子作用下可分泌止細(xì)胞，與機(jī)體炎癥性疾病密切相關(guān)［10］。cAMP 可間接反映β2受體功能，而哮喘患者機(jī)體內(nèi)外周血淋巴細(xì)胞β2受體呈降低趨勢(shì)［11］。LTD4 屬?gòu)?qiáng)效炎癥介質(zhì)之一，與支氣管哮喘發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，可促進(jìn)支氣管平滑肌收縮，增加氣道黏液分泌，促使肺血管通透性增加［11］。本研究結(jié)果顯示，治療后治療組HMGB1 及LTD4 水平較低，cAMP 水平更高（P＜0.05），提示平喘固本膏可降低支氣管哮喘緩解期患者HMGB1 及LTD4 水平，提高cAMP 水平，促使β2受體功能恢復(fù)，抑制炎癥反應(yīng)。機(jī)體內(nèi)體液免疫的重要因子包括免疫球蛋白IgE、IgM、IgG、IgA，支氣管哮喘患者機(jī)體內(nèi)免疫功能紊亂，血清IgE 水平升高，IgM、IgG、IgA水平降低［12］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，治療后治療組IgE水平較低，IgM、IgG、IgA水平更高（P＜0.05），提示平喘固本膏可調(diào)節(jié)支氣管哮喘患者免疫功能。

多種細(xì)胞因子參與支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程，PPAR-γ屬配體激動(dòng)的核轉(zhuǎn)錄因子中的一種，其可調(diào)控細(xì)胞炎癥。NF-κB 可調(diào)控多種基因的表達(dá)及炎癥因子水平，NF-κB 在哮喘患者中活化率較高［13］。以往研究指出，NF-κB 在重度哮喘狀態(tài)下活化率極高，NF-κB 參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，IL-10對(duì)NF-κB的活性具有抑制作用，可抑制哮喘氣道炎癥中的炎癥因子［13］。通過(guò)升高IL-10 水平可降低NF-κB 活性［14-15］。目前，臨床關(guān)于PPAR-γ-NF-κB 通路探討平喘固本膏對(duì)支氣管哮喘緩解期患者的作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，治療后，與對(duì)照組相比，治療組IL-10 水平更高，T淋巴細(xì)胞NF-κB活化率更低（P＜0.05），提示平喘固本膏可通過(guò)升高支氣管哮喘患者T 淋巴細(xì)胞源性IL-10 水平從而抑制支氣管哮喘患者T 淋巴細(xì)胞NF-κB 的活性，是抑制PPAR-γ-NF-κB 通路的機(jī)制之一，對(duì)改善支氣管哮喘具有重要意義。黃精中的有效成分黃精多糖具有抗炎、增強(qiáng)免疫、抗病毒等作用［16］；黃芪的有效成分黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪多糖類(lèi)等均具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎活性等作用，且可抗氧化，改善氣道結(jié)構(gòu)重塑等，能重塑機(jī)體致炎/抑炎平衡調(diào)控機(jī)制［17］；枸杞子中的枸杞多糖可調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞失衡，發(fā)揮調(diào)節(jié)哮喘小鼠氣道炎癥作用［18］；補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂總香豆素具有平喘作用［19］；地龍中的含氮成分黃嘌呤具有抑制支氣管收縮，增加血管通透性，發(fā)揮平喘作用［20］。

綜上所述，平喘固本膏可改善支氣管哮喘患者臨床癥狀，降低HMGB1及LTD4水平，升高cAMP水平，促使β2受體功能恢復(fù)，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能，可抑制支氣管哮喘患者T淋巴細(xì)胞NF-κB活性是平喘固本膏升高支氣管哮喘患者T 淋巴細(xì)胞源性IL-10 水平，抑制PPAR-γ-NF-κB 通路的機(jī)制之一。