基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 分析加味參芪地黃湯的化學(xué)成分

萬 眾，劉王振祖，談鳴岳，徐東亮，胡 誠，紀(jì)萬里 （. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院泌尿中心, 上海00；. 上海中醫(yī)藥大學(xué)：a.中藥學(xué)院，b. 科技實(shí)驗(yàn)中心, 上海 00；. 上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 上海 08）

參芪地黃湯，源于清代醫(yī)家沈金鰲的《雜病犀 燭》，作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有益氣養(yǎng)陰，滋腎健脾之功效，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療腎病及前列腺疾病[1-2]。加味參芪地黃湯是在由六味地黃湯的基礎(chǔ)上加補(bǔ)氣藥而成[3]，其中，熟地黃具有滋腎的功效，懷山藥和茯苓兼具補(bǔ)肝滲濕之效，溫肝之山茱萸，澤瀉與丹皮具有泄?jié)崆甯蔚淖饔谩４送?，該方在補(bǔ)肝益腎方的基礎(chǔ)上再伍以黨參，黃芪以益氣補(bǔ)脾，實(shí)則擴(kuò)大了六味地黃丸的臨床應(yīng)用范圍。此外，黃芪具有健脾益氣的功效，補(bǔ)腎填精之熟地黃，兩藥具有固護(hù)正氣之功效，共為君藥。臣藥為益氣生津之黨參和補(bǔ)益肝腎并能澀精之山萸肉、補(bǔ)脾陰又能固精之山藥。山萸肉具有補(bǔ)益肝腎和澀精益陰的功效，可平補(bǔ)腎之陰陽，補(bǔ)脾腎陰、固腎亦能除濕之山藥，與熟地黃三藥相配，腎、肝、脾三臟共補(bǔ)，是為“三補(bǔ)”，澤瀉具有利濕泄?jié)岬墓πВ档てで鍩釣a火，茯苓淡滲脾濕，是為“三瀉”。三補(bǔ)三瀉，平補(bǔ)陰陽，可補(bǔ)脾益腎。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，參芪地黃湯可通過減輕蛋白尿癥狀及微炎癥狀態(tài)，從而改善腎功能[4]。參芪地黃湯可降低糖尿病腎病大鼠模型腎組織中的TGF-β1、VEGF 的表達(dá)水平而發(fā)揮抗糖尿病腎病的作用[5]。然而，加味參芪地黃湯由多味藥組成，成分體系復(fù)雜，缺乏其活性成分的系統(tǒng)性研究。因此，明確加味參芪地黃湯中組分對進(jìn)一步研究其藥效作用意義重大。而中藥復(fù)方具有成分體系復(fù)雜，這給分析分離帶來了挑戰(zhàn)。目前，超高效液相色譜技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜（Orbitrap-MS）已廣泛應(yīng)用于中藥分析，Orbitrap-MS 是靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，其分辨率高，能夠提供準(zhǔn)確的分子量[6-8]。因此，本研究利用超高效液相色譜技術(shù)聯(lián)合高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap-MS）建立加味參芪地黃湯化學(xué)成分的鑒定分析方法，依據(jù)對照品、質(zhì)譜碎片信息及文獻(xiàn)報(bào)道，此外，采用軟件Mass Frontier 預(yù)測分析代表性成分的裂解途徑，明確加味參芪地黃湯的化學(xué)成分組成，以期為研究該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LTQ-orbitrap 高分辨質(zhì)譜儀、電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur2.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Ultimate 3 000超高效液相色譜儀（Thermo Fisher 公司）；Eppendorf Centrifuge 5424R 高速離心機(jī)(艾本德中國有限公司)；MS104S 型分析天平(梅特勒公司)。

1.2 試藥

黨參(批號：2021042350，上海上藥華宇藥業(yè)有限公司)；茯苓(批號：2021110104，上藥余天成醫(yī)藥有限公司)；淮山藥(批號：2021090301，上海德華國藥制品有限公司)；熟地黃(批號：210816)、菟絲子(批號：210906)、牡丹皮(批號：210926)均購自上海虹橋中藥飲片有限公司；制首烏(批號：20211112-1)、黃芪(批號：20211024-1)，澤瀉(批號：20210924-2)均購自上海萬仕誠國藥制品有限公司；丹參(批號：2107089，上海雷允上中藥飲片廠有地黃苷D(批 號：J02GB153517)、限 公 司)；山 萸 肉(批 號：21060201，上海德大堂國藥有限公司)；甘草（批號：21072209，上海蔡同德藥業(yè)有限公司）。上述藥材經(jīng)上海虹橋飲片有限公司陳燕軍藥師鑒定，均符合2020 版《中國藥典》規(guī)定。對照品：5-羥甲基糠醛(批號：H12M9Z61023)、黨參炔苷(批號：J30GB153014)、紫丁香苷(批號：Y14N11H131195)、茯苓新酸B(批號：J10GB150678)，槲皮素(批號：C09S8Y43412)均購自上海源葉生物有限公司，對照品純度均＞98%。乙腈和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，購自Thermo Fisher Scientific。

2 方法

2.1 加味參芪地黃湯化合物數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

依據(jù)加味參芪地黃湯各味藥材，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫 (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp search.php)、中科院上海有機(jī)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn)及中醫(yī)藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫HIT(http://lifecenter.sgst.cn/hit/)、中醫(yī)藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫TCMID (www.megabionet.org/tcmid/)中搜索，收集加味參芪地黃湯各味藥材的化合物信息，共建立包含786 種成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

2.2 加味參芪地黃湯的制備

取黨參6 g、黃芪15 g、熟地黃15 g、制首烏15 g、菟絲子15 g、山藥15 g、澤瀉10 g、丹參10 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、山萸肉9 g、炙甘草5 g，加入8 倍量水浸泡2 h，煎煮2 次，每次煎煮30 min，過濾藥渣，濃縮至1 g/ml，精密移取該樣品5.00 ml，加70%甲醇定容至50 ml，搖勻，離心15 min(12 000 r/min)，取上清液，通過0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 混合對照品溶液的配制

分別稱取各個(gè)對照品槲皮素、5-羥甲基糠醛、黨參炔苷、紫丁香苷、地黃苷D、茯苓新酸B 1.0 mg，至5 ml 容量瓶中，加甲醇適量，超聲，溶解，加甲醇定容，作為對照品溶液。

2.4 色譜條件

采用Warters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)，流動相： 0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%B；1～2 min，5%B→40%B；2～7 min，40%B→80%B；7～15.0 min， 80%B→95%B； 15.0～19.5 min，95%B→5%B)，流速0.3 ml/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜的離子源方式為電噴霧，正離子毛細(xì)管噴霧電壓為3.8 kV，負(fù)離子毛細(xì)管噴霧電壓為4.0 kV，離子源溫度為100 ℃，毛細(xì)管溫度為350 ℃，鞘氣流速為45 arb，輔助氣體流速15 arb，掃描分辨率(R)為60 000，質(zhì)譜采集范圍為m/z50～1 000，以動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描作為二級質(zhì)譜掃描模式，其分辨率為15 000，高能碰撞解離模式(high energy collision dissociation，HCD)。

2.6 數(shù)據(jù)處理及分析方法

采用Thermo Xcalibur 2.2 對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。根據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫，采用對照品比對、文獻(xiàn)報(bào)道及Thermo Xcalibur 2.2 workstation 軟件預(yù)測分析相結(jié)合，對峰強(qiáng)度＞10 000 的峰進(jìn)行研究分析，從而鑒定化合物。采用Mass Frontier (Thermo Scientific, Bremen, Germany)用于分析和預(yù)測化合物的碎片信息及裂解規(guī)律。

3 結(jié)果

3.1 色譜峰鑒定分析

采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS 技術(shù)分析加味參芪地黃湯化學(xué)成分，在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)（圖1），通過質(zhì)譜軟件Thermo Xcalibur 2.2 workstation 分析可能的碎片信息，確定每個(gè)離子峰的質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合對照品及文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對分析，從而進(jìn)行化合物的鑒定。本次研究從加味參芪地黃湯共鑒定出62 個(gè)化合物，包括13 個(gè)芳香酸類、9 個(gè)黃酮類、8 個(gè)皂苷類成分、5 個(gè)芳香胺類、3 個(gè)酮酸類、2 個(gè)酚類、1 個(gè)芳香醌類及其他成分，具體結(jié)果見表1。

圖1 加味參芪地黃湯UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 的正(A)、負(fù)(B)離子模式下的總離子流圖

表1 加味參芪地黃湯UPLC-LTQ-Orbitrap MS 成分分析結(jié)果

(續(xù)表1)

3.2 各類化合物鑒定分析

3.2.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物具有抗炎、抗腫瘤活性，研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗糖尿病腎病的作用[9-10]。本次研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap MS 共鑒定出9 個(gè)黃酮類成分。以化合物35 為例分析黃酮類化合物的裂解規(guī)律，化合物35 在正離子模式下，形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z303.042 83，該離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，進(jìn)而色原酮母核發(fā)生i裂解，失去-C7H6O4形成m/z149.06 碎片峰，此外，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z303.042 83 色原酮母核可直接裂解失去-C6H6O2，形成m/z195.03 碎片峰，進(jìn)而失去-CO，形成m/z167.07 碎片峰，結(jié)合對照品比對，化合物35 鑒定為槲皮素，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖2 槲皮素的質(zhì)譜裂解途徑推斷

3.2.2 炔類化合物

炔類化合物是黨參中重要的活性成分，本次鑒定出黨參中黨參炔苷這一化合物，文獻(xiàn)報(bào)道顯示其具有抗炎、抗氧化的活性[11]。根據(jù)多級碎片信息，為其他炔類的裂解規(guī)律提供依據(jù)。31 號峰在HCD 碰撞模式下，形成準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z395.092 72，該離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，失去側(cè)鏈的炔基-C7H6，形成碎片峰m/z305.10，有碎片離子m/z215.12，與準(zhǔn)分子離子峰分子量相差179 Da，推測可能丟失1 個(gè)葡萄糖基，失去-C6H11O6，形成碎片峰m/z215.12，進(jìn)一步失去側(cè)鏈的CH2O、C2H4形成碎片峰m/z185.09 和m/z159.09，結(jié)合對照品比對，化合物31 鑒定為黨參炔苷，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖3 黨參炔苷的質(zhì)譜裂解途徑推斷

3.2.3 糠醛類化合物

糠醛類化合物具有抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶、抗過敏、抗炎癥反應(yīng)等作用[12]。17 號峰在HCD碰撞模式下，形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z127.035 32該離子峰，進(jìn)而進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，失去側(cè)鏈的-H2O，形成m/z109.03 碎片峰，進(jìn)一步失去側(cè)鏈-CO，最終保留呋喃母核結(jié)構(gòu)，形成碎m/z81.03 片峰，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13]和對照品比對，17 號化合物鑒定為5-羥甲基糠醛，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖4 5-羥甲基糠醛的質(zhì)譜裂解途徑推斷

3.2.4 三萜類化合物

三萜類化合物是茯苓中重要的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其對慢性腎小球腎炎具有保護(hù)作用[14]。本次鑒定出茯苓新酸B 為三萜類化合物，分析其裂解規(guī)律。53 號峰在HCD 碰撞模式下，形成準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z483.321 91，該離子峰進(jìn)一步裂解形成的碎片峰有m/z465.02、m/z409.03、m/z365.03，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級碎片信息，推斷m/z465.02 離子碎片峰是由準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z483.321 91，裂解失去-H2O 所形成，m/z409.03 碎片峰是由準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z483.321 91 失去1 個(gè)側(cè)鏈的丙酸基-C3H6O2所形成的，而m/z365.03 離子碎片峰是由m/z409.03 碎片峰進(jìn)一步失去1 分子CO2所形成。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[15]和對照品比對，化合物53 鑒定為茯苓新酸B，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 茯苓新酸B 的質(zhì)譜裂解途徑推斷

4 討論

加味參芪地黃湯作為經(jīng)典方劑，在臨床廣泛應(yīng)用于治療慢性腎病、腎小球腎炎及前列腺疾病等[16-17]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制炎癥反應(yīng)、抗病毒、抗腫瘤等活性[18-19]，其藥理方面的文獻(xiàn)報(bào)道較多，而藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)在超高效液相色譜分離上，雖然成分色譜峰沒有完全分離開，但借助于LTQ-Orbitrap-MS/MS 的高效分離、高選擇性的特點(diǎn)，其可提供的準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)信息[20]，并結(jié)合特征碎片離子鑒別的分析策略，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用正、負(fù)離子模式，在相對誤差小于10 ppm 的條件下，根據(jù)一級、多級質(zhì)譜碎片及化合物精確質(zhì)量數(shù)信息，ESI 屬于軟電離，碎片較少，依據(jù)MS/MS 圖譜可獲取有效的結(jié)構(gòu)信息[21]，同時(shí)結(jié)合對照品比對及文獻(xiàn)報(bào)道，從而更為準(zhǔn)確地鑒定加味參芪地黃湯中的化學(xué)成分。本次研究從加味參芪地黃湯中共鑒定出62 個(gè)化學(xué)成分，包括13 個(gè)芳香酸類、9 個(gè)黃酮類、8 個(gè)皂苷類成分、5 個(gè)芳香胺類、3 個(gè)酮酸類、2 個(gè)酚類、1 個(gè)芳香醌類及其他成分。對黃酮類、三萜苷類、糖醛類等代表性化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行了研究。黃酮類化合物的裂解方式多以失去側(cè)鏈基團(tuán)，最終形成保留色原酮母核的[M+H]+峰。本研究鑒定分析出5-羥甲基糠醛這一成分，是黨參中重要的活性成分，文獻(xiàn)報(bào)道顯示5-羥甲基糠醛具有抗腫瘤活性，可降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G0/G1 期，激活DNA 損傷介導(dǎo)的P53 磷酸化、AKT 通路和MAPKs 通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[22]。鑒定出黨參標(biāo)志性成分黨參炔苷這一化合物，文獻(xiàn)報(bào)道研究顯示黨參炔苷具有抗腫瘤活性，此外，黨參提取物能提高前列腺素的表達(dá)水平[23]。鑒定出三萜類化合物茯苓新酸B，作為茯苓中重要的活性成分，茯苓酸可減輕微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用，還可抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖[24]。

本研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS 方法鑒定加味參芪地黃湯化學(xué)成分尚屬首次，為后續(xù)的抗慢性腎病、腎小球腎炎及前列腺疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。