羥基紅花黃色素A 生物合成途徑短鏈還原酶基因的特征及功能研究

王璐暖，吳建輝，何貝軒，張彥潔，郭美麗 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室, 上海 200433）

中藥紅花（Carthami Flos）是菊科植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥花，傳統(tǒng)本草學(xué)著作《本草綱目》記載，紅花具有活血散瘀，通經(jīng)止痛的功效[1]，其藥材和制劑在臨床上被廣泛用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，其主要藥效物質(zhì)是以羥基紅花黃色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）為代表的查爾酮類化合物和以菸花苷為代表的黃酮醇類化合物，這些化合物均具有良好的心腦血管損傷保護(hù)活性[2-3]。紅花藥材的產(chǎn)量偏低，每平方千米產(chǎn)量僅為18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、紅花紅色素等查爾酮類成分在不同品種間差異較大[6]。由于紅花中的查爾酮類成分僅特異性地存在于花冠中[7]，加之體外組織培養(yǎng)再生率低[8]等原因，對其功能基因的研究工作一直進(jìn)展緩慢。特別是對于HSYA 等紅花特有的有效成分，其生物合成相關(guān)的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段以提高藥效物質(zhì)的含量，是提高紅花品質(zhì)，節(jié)約土地資源、降低制藥成本的一條新途徑。

短鏈脫氫酶/還原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代謝物的生物合成中廣泛參與各類碳-氧雙鍵，碳-碳雙鍵以及烯酮鍵的氧化還原催化反應(yīng)。根據(jù)SDRs 基因序列的特征結(jié)構(gòu)，SDRs 超家族可以被分為5 個亞家族[10-14]。最早發(fā)現(xiàn)并且進(jìn)行鑒定的兩類主要短鏈還原酶命名為classical 和extend，classical 類的SDRs 基因擁有長度約為250 個氨基酸殘基，被稱為Extended類的SDRs 基因在碳基末端因其含有多余的約100 個氨基酸殘基而得名。另外3 種類型SDRs 基因分別被命名為intermediate、complex 和divergent。這些類型的SDRs 基因基于其結(jié)合輔酶類型和結(jié)合催化位點的不同進(jìn)行命名分類。此外，SDRs 存在與傳統(tǒng)類型不同的含有“rossmann-fold”保守結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶結(jié)構(gòu)[15-18]。

黃酮類化合物起源于莽草酸途徑和苯丙素生物合成途徑，1 個香豆酰輔酶A（coumaroyl CoA）和3 個丙二酰輔酶A（malonyl CoA）在查爾酮合酶的作用下生成二氫查爾酮，然后經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶催化為二氫黃酮，進(jìn)一步在各類還原酶，聚合酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，生成終端次生代謝產(chǎn)物組合[19-21]。紅花中所含的主要有效成分HSYA 具有查爾酮式結(jié)構(gòu)，本課題組前期研究認(rèn)為：HSYA 從前體物質(zhì)到合成，中間存在必不可少的氧化還原過程。短鏈脫氫還原酶家族廣泛參與植物體內(nèi)次生代謝，這一類還原酶都帶有相似的折疊結(jié)構(gòu)以及催化位點，已有研究表明，其對苯丙烷代謝途徑起重要作用[22-23]，但有關(guān)紅花中還原酶基因相關(guān)報道較少[24]。故筆者通過對紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫、基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫以及代謝組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，篩選在HSYA 生物合成途徑的關(guān)鍵還原酶基因，并進(jìn)行功能驗證，以期揭示紅花次生代謝成分生物合成途徑，為定向調(diào)控紅花的品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

云南巍山紅花品系（ZHH0119），采自海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系溫室，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)郭美麗教授鑒定為菊科植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）。紅花種植條件：溫度恒定25 ℃，16 h 光照，8 h 黑暗。采集相關(guān)花與組織后迅速存放于液氮或者-80 ℃冰箱中冷凍。

1.2 RNA 提取及cDNA 第一鏈合成

按照Trans ZOL Plant 植物總RNA 提取試劑盒（北京全式金公司，中國）說明書方法提取紅花花冠總RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金公司，中國）說明書方法進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成。cDNA 于-20 ℃保存。

1.3 基因篩選

基于數(shù)據(jù)庫中的基因注釋以“黃酮還原酶”和“黃酮類化合物生物合成”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選出其中可能與HSYA 生物合成相關(guān)的還原酶基因，將篩選基因不同花期時間的表達(dá)量，將其與紅花代謝組數(shù)據(jù)庫中同花期的蘆?。╮utin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黃芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（Dphenylalanine） 12 個主要成分的含量[12,25]進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析。

1.4 全長克隆及生物信息學(xué)分析

基于紅花花冠EST 轉(zhuǎn)錄組文庫，結(jié)合第三代測序技術(shù)[26-29]紅花花冠全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選得到目的基因序列。在其5'端、3'端分別設(shè)計特異性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京諾唯贊公司，中國）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)EasyPure Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒（北京全式金公司，中國）說明書操作回收后，連接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中國）載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T1 感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金公司，中國）后，涂布在LBA 平板上，恒溫培養(yǎng)37 ℃過夜，挑取陽性單克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行菌液測序。

用ExPASyProtParam 工具（http://web.expasy.org/compute/）對目的基因的理論等電點（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式進(jìn)行預(yù)測。通過Simple Molecule Architecture Research Tool 工 具（http://smart.embl-heidelberg.de/）對目的基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質(zhì)的親/疏水性和跨膜區(qū)域做出預(yù)測。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測目的蛋白是否含有信號肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對篩選出的SDRs 基因進(jìn)行BLAST 序列比對。通過Neighbor-Joining 相鄰節(jié)點法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，自展分析法進(jìn)行1 000次重復(fù)[32-34]。使用PBILYON-GRLAND 數(shù)據(jù)庫預(yù)測構(gòu)建蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)模型。蛋白三級結(jié)構(gòu)由Protein Homology/analogy Recognition Engine 預(yù)測。用WOLFPSORT 軟件（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.5 目的基因表達(dá)模式分析

取盛花期新鮮紅花根、莖、葉、花冠4 個部位的新鮮組織和花期Ⅰ（開花前3 d）、花期Ⅱ（開花當(dāng)天）、花期Ⅲ（開花后1 d）、花期Ⅳ（開花后3 d）4 個花期的新鮮花冠，提取總RNA，合成cDNA 第一鏈后，在靠近5'端處對各個基因設(shè)計引物，依據(jù)Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中國）試劑盒推薦體系，以Ct60s（KJ634810）作為內(nèi)參標(biāo)記基因，進(jìn)行qRT-PCR 實驗，結(jié)果使用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計算分析[35]。

1.6 植物表達(dá)載體構(gòu)建及紅花體內(nèi)功能初步驗證

根據(jù)CtSDR3的開放閱讀框和植物真核表達(dá)載體pMT-39 序列信息，設(shè)計無縫克隆引物。以紅花cDNA 做模板，使用高保真酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)膠回收后依無縫克隆試劑盒說明書與經(jīng)NcoI 酶切線性化的pMT-39 載體進(jìn)行重組連接。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，提取的pMT39-CtSDR3質(zhì)粒用冷凍法轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101 中。LBK+Rif 平板篩選陽性克隆后，取1ml OD600 =0.8 的菌液經(jīng)6 000 r/min，離心3 min 后用1 ml 5%蔗糖溶液重懸，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于紅花花柱，套袋避光[35]。

在pMT-39 的35 s 啟動子區(qū)域設(shè)計5'端特異性引物，在目的基因CtSDR3 中設(shè)計3'端引物。取T2代新鮮葉cDNA 第一鏈作為模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中國）推薦體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)，確定是否存在目的條帶。采集CtSDR3陽性植株花冠以及pMT-39 空載體對照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR 反應(yīng)體系評價CtSDR3基因的過表達(dá)水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 檢測CtSDR3過表達(dá)組和空載體對照組的黃酮代謝物含量，選擇以HSYA 為代表性成分的8 個黃酮類化合物作為檢測對象。

1.7 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)

根據(jù)CtSDR3的開放閱讀框及蛋白表達(dá)載體pGEX-6p-1 以及pET-28a 序列信息，設(shè)計同源重組克隆引物[34]。以紅花花冠cDNA 為模板，使用高保真酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后依無縫克隆試劑盒說明書與經(jīng)XhoI、BamHI 酶切線性化的載體pGEX-6p-1 以及pET-28a 進(jìn)行重組連接。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌株克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，提取的重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)至大腸桿菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中國）中。

在20 ml LBA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6 左右，分2 份10 ml 菌液各加入終濃度為0.3 mmol/L 的IPTG 和生理鹽水。恒溫培養(yǎng)箱中16 ℃，100 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)16 h[35-36]。菌液離心棄上清液，用1×PBS 緩沖液洗滌兩次后重懸。超聲破碎儀中40 kW，工作時間5 s，循環(huán)間隔時間25 s，共15 個循環(huán)進(jìn)行破碎[16]，裂解完成后取上清與沉淀15 μl，上樣檢測。

2 結(jié)果

2.1 基因篩選

通過分析，得到contig325、contig483、contig2863共3 個與HSYA 具有強(qiáng)相關(guān)性的基因（r＞0.85），見圖1。

圖1 不同花期紅花還原酶基因表達(dá)量與黃酮類化合物積累量相關(guān)性分析熱圖

2.2 全長克隆和生物信息學(xué)分析

3 個目的基因序列信息經(jīng)測序驗證結(jié)果如下：contig325 全長共1 523 bp，開放閱讀框1341bp，編碼446 個氨基酸；contig483 全長1 393 bp，開放閱讀框792 bp，編碼263 個氨基酸；contig2863 全長序列1 527 bp，開放閱讀框1 023 bp，編碼340 個氨基酸。PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2 所示。

圖2 PCR 產(chǎn)物電泳圖

contig325 基因編碼446 個氨基酸，命名為CtSDR1（GenBank 登錄號：MW792035）；Contig483基因編碼263 個氨基酸，命名為CtSDR2（GenBank登錄號：MW792036）；Contig2863 基因編碼339 個氨基酸，命名為CtSDR3（GenBank 登錄號：MW792037）。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明CtSDR1 與薊Cirsium japonicum(Q QH14901.1)同源性最高；CtSDR2 與小蓬草Erigeron canadensis(XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3與小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus(KVI09 206.1)同源性最高。Prot-param 分析CtSDR1基因所編碼的蛋白質(zhì)分子式C2230H3346N606O639S7，相對分子量為49.2×103，理論等電點pI=9.61；CtSDR2基因所編碼的蛋白質(zhì)分子式C1289H2072N360O379S13，相對分子量為29×103，理論等電點pI=8.63；CtSDR1基因所編碼的蛋白質(zhì)分子式C1691H2614N442O481S9，相對分子量為37.1×103，理論等電點pI=6.80。Prot Scale分析預(yù)測CtSDR1、CtSDR2 和CtSDR3 蛋白為親水性蛋白，無信號肽屬非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析顯示CtSDR1、CtSDR2 和CtSDR3 不含有跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白。對CtSDR1、CtSDR2 和CtSDR3蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測顯示均屬于不規(guī)則結(jié)構(gòu)。對CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖3 所示。系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4 所示。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖3 CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 CtSDR 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 目的基因表達(dá)模式分析

取紅花花期的Ⅳ期的紅花各個部位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紅花花冠內(nèi)的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表達(dá)量從高到低依次均為花冠＞葉＞莖＞根。其中CtSDR1在花冠中的相對表達(dá)量約為根中的3 倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相對表達(dá)量約為根中的4 倍。將4 個花期的紅花花冠進(jìn)行qRT-PCR 分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表達(dá)量均隨著花冠發(fā)育逐漸升高，特別是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠對比Ⅲ期花冠的表達(dá)量分別提高了7.2 倍、2.7 倍、2.3 倍（圖5）。

圖5 目的基因在不同部位(A)和不同花期(B)的表達(dá)水平

2.4 CtSDR3 植物表達(dá)載體構(gòu)建及紅花體內(nèi)功能初步驗證

構(gòu)建真和表達(dá)載體并通過PCR 鑒定后，我們從19 株農(nóng)桿菌浸染的子代植株中得到5 株pMT39-CtSDR3陽性紅花植株（圖6）。通過qPCR 對其CtSDR3基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性紅花植株中CtSDR3基因的轉(zhuǎn)錄水平得到顯著增加，約為空白組株系的2～3 倍，CtSDR3的在花冠部位的高表達(dá)也證明了研究成功獲取CtSDR3過表達(dá)紅花植株（圖7）。通過UPLC-QTOF/MS 技術(shù)測定陽性轉(zhuǎn)基因紅花株系組和空白對照組的目標(biāo)化合物含量，包括7 個紅花花冠主要黃酮類化合物及苯丙烷類代謝途徑上游關(guān)鍵物質(zhì)苯丙氨酸（圖8），分別為：野黃芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、蘆丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由圖8 可知，與空白組相比，CtSDR3過表達(dá)株系相較于空白組野黃芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA 提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有顯著性升高。其他化合物含量則有無顯著性變化趨勢。通過對過表達(dá)株系與空白組的含量分析，我們認(rèn)為CtSDR3基因過表達(dá)會引起紅花中黃酮類物質(zhì)的變化，尤其是HSYA 含量升高顯著。同時，苯丙氨酸代謝途徑屬于植物重要的次生代謝途徑，過表達(dá)組引起苯丙氨酸含量的顯著上升，上述指標(biāo)性成分的變化也進(jìn)一步說明CtSDR3對紅花黃酮類化合物次生代謝途徑具有一定的影響，但目前我們尚難以判斷CtSDR3紅花中影響次生代謝產(chǎn)物積累的明確途徑。

圖6 真核表達(dá)載體構(gòu)建及陽性鑒定電泳圖

圖7 過表達(dá)植株CtSDR3 的相對表達(dá)量

圖8 陽性植株黃酮類化合物含量測定

2.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)

目的片段成功擴(kuò)增，將目的條帶進(jìn)行膠回收、純化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1構(gòu)建的pGEX-6p-1、pET-28a 原核表達(dá)載體均有在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a 表達(dá)的目的蛋白均形成包涵體，存在于沉淀中。無法進(jìn)行下一步大量純化實驗，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1 誘導(dǎo)表達(dá)了存在于上清液的目的蛋白，明顯可以在上清液中觀察到分子量約為50 000 的蛋白條帶（圖9）。

圖9 目的片段PCR 產(chǎn)物電泳及表達(dá)蛋白電泳分析

3 討論

越來越多的紅花藥理學(xué)相關(guān)研究表明，紅花的主要藥效物質(zhì)包括查爾酮類、黃酮醇類等多種黃酮類化合物，其中，查爾酮類HSYA 對腦缺血具有保護(hù)作用，并且還能抗腦血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA 的生物合成分途徑，對于HSYA 的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

本研究借助生物學(xué)分子技術(shù)、結(jié)合代謝組分析測定，篩選出3 個參與HSYA 生物合成途徑的關(guān)鍵短鏈脫氫還原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，這3 個基因序列具有高度保守性，在不同器官的表達(dá)模式均呈現(xiàn)出花冠＞葉＞莖＞根的特點，而且在花冠中的表達(dá)量隨花冠發(fā)育逐漸升高，表明其很有可能參與紅花中HSYA 等主要藥用成分的積累。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CtSDR3 過表達(dá)T2代陽性植株花冠中CtSDR3基因的轉(zhuǎn)錄水平增加了2～3 倍，次生代謝物HSYA 的含量提高了7.1%～16.6%（P＜0.05），驗證了我們對CtSDR3在紅花體內(nèi)參與黃酮類化合物生物合成功能的推測。本研究中，體外表達(dá)CtSDR3 蛋白，得到目的蛋白條帶，但由于包涵體等原因，蛋白表達(dá)和純化條件仍需要進(jìn)一步摸索。下一步，我們將對可能起黃酮類生物合成途徑的關(guān)鍵SDRs 進(jìn)行深入的生物學(xué)特性特別是酶結(jié)合位點的研究，為更好地闡釋SDRs 的生物學(xué)功能、利用分子生物育種技術(shù)培育高HSYA 含量的紅花新品種奠定基礎(chǔ)。