腸道菌群在病毒性心肌炎小鼠中的初步研究

孔清 陳利利

摘要：目的：應(yīng)用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)，初步探索腸道菌群在柯薩奇病毒B3（CVB3）誘導(dǎo)的小鼠病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）中的變化和意義。方法：雄性BALB/c 小鼠經(jīng)腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS）0.1ml+102TCDI50 CVB3病毒液，建立VMC小鼠模型;健康對(duì)照組為雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.1ml PBS。在注射后的第14天，心肌HE染色觀察兩組心肌病理形態(tài)特征，留取新鮮糞便，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)16S rRNA，對(duì)兩組小鼠的腸道菌群進(jìn)行特征分析。結(jié)果：對(duì)比對(duì)照組，VMC組腸道菌群的Alpha及Beta多樣性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在門水平上分析，兩組優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes），且二者比值（F/B）在VMC組中明顯升高，為0.43，而對(duì)照組F/B比值為0.29?？扑椒治?，擬桿菌門S24-7菌科，對(duì)照組的相對(duì)豐度為39.47%，明顯高于VMC組31.58%（p<0.05）;梭菌科的相對(duì)豐度，對(duì)照組為0.27%，低于VMC組0.47%（p<0.05）;F16的相對(duì)豐度，對(duì)照組為0.20%，低于VMC組為0.40%（p<0.05）。而兩組的瘤胃球菌屬、脫硫弧菌屬、產(chǎn)硫細(xì)菌、梭狀芽胞桿菌屬、卵形擬桿菌等，其相對(duì)豐度亦有顯著差異（p均<0.05）。結(jié)論：CVB3導(dǎo)致的病毒性心肌炎小鼠存在腸道菌群紊亂，提示腸道菌群紊亂可能參與病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制。

關(guān)鍵詞：病毒性心肌炎;腸道菌群;16S rRNA

【中圖分類號(hào)】? R542.2+1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）14--03

病毒性心肌炎（VMC）是常見心血管病之一，以心肌彌漫性或局灶性炎癥為主要特征。VMC主要由腸道病毒感染引起，是青少年、運(yùn)動(dòng)員猝死的主要原因之一，目前仍缺乏有效的早期診斷和有效的治療手段。由于地域的不同，全球范圍VMC的發(fā)病率約為0.1%-15%，而我國(guó)VMC發(fā)病率約2%-15%[1， 2]。腸道病毒是VMC的重要病因，其中B3型柯薩奇病毒（CVB3）感染是VMC最主要的病原[3， 4]。CVB3為細(xì)小RNA病毒科中腸道病毒屬，經(jīng)糞-口途徑感染食道和胃腸道之后，病毒CVB3入血感染心肌細(xì)胞，繼發(fā)自身免疫反應(yīng)及損傷。然而， VMC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明

腸道病毒CVB3病毒感染機(jī)體后，腸道是其最初部位和早期復(fù)制部位，受到廣泛關(guān)注。人類腸道菌群包含微生物眾多，約1013～1014個(gè)，而其基因組是人體細(xì)胞的150倍，因此腸道菌群也被看作是人類的“第二基因組”[5， 6]。既往由于技術(shù)限制，人類對(duì)腸道菌群的功能檢測(cè)缺乏有效的手段，腸道菌群成為了“被遺忘的微生物器官”。如今借助高通量測(cè)序技術(shù)，其不依賴培養(yǎng)，研究者們發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)機(jī)體的影響幾乎涉及各個(gè)系統(tǒng)，特別在炎癥、免疫反應(yīng)方面具有舉足輕重的作用。且大量研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與多種非傳染性疾病，如腦血管疾病、2型糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[7-9]。

在心血管疾病中，有研究報(bào)道腸道菌群紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、缺血性心肌病、心衰等疾病有關(guān)[10]。如慢性心衰患者可出現(xiàn)腸道致病細(xì)菌和念珠菌屬的過度生長(zhǎng)，甚至有研究者提出新概念--心衰中存在“心-腸軸”[11]。這些研究提示腸道菌群參與部分心血管疾病發(fā)病機(jī)制。而在VMC中，腸道乳酸桿菌等菌株的豐度在雌雄小鼠中存在顯著差異，提示心肌炎可能與腸道菌群失調(diào)有密切關(guān)系[12]。但VMC小鼠與健康對(duì)照組腸道菌群的差異，未見報(bào)道，亟需進(jìn)一步的研究。因此本研究通過收集CVB3誘導(dǎo)的VMC小鼠與健康對(duì)照組的糞便，應(yīng)用高通量測(cè)序?qū)δc道菌群進(jìn)行特征分析，試圖尋找兩組小鼠腸道差異性菌群，為闡明VMC發(fā)病機(jī)制以及探索腸道菌群干預(yù)等新治療方式提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.材料：實(shí)驗(yàn)用BALB/c小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，5-6周齡雄性BALB/c小鼠均在廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。CVB3（Nancy株）和Hep-2細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室友情提供。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

2.建立模型和分組：Hep-2細(xì)胞活化增殖CVB3 Nancy株，培養(yǎng)72小時(shí)后，依據(jù)細(xì)胞病變效應(yīng)檢測(cè)半數(shù)組織感染濃度（TCID50），為1×107。小鼠根據(jù)隨機(jī)方法分設(shè)兩組，健康對(duì)照組8只（Concrol組）、VMC組10只（VMC組），對(duì)照組腹腔注射0.1 ml PBS， VMC組注射0.1 ml含100 TCID50 CVB3的PBS。腹腔注射當(dāng)天被定義為第0天。第14天時(shí)，采用頸椎脫臼法處死存活小鼠。

3.心肌組織病理學(xué)檢查：取小鼠心臟切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌病理學(xué)變化。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算心肌炎癥面積占視野總面積的百分比，具體如下：無病變?yōu)?分，<25%為1分，25%-50%為2分，50%-75%為3分，>75%為4分[13]，

4.糞便采集：第14天時(shí)，無菌收集存活小鼠的糞便，立即存至無菌EP管中，-80℃保存。

5. DNA提?。簯?yīng)用CTAB方法，提取兩組糞便的基因組DNA，PCR選擇16SrDNA V3-V4測(cè)序區(qū)域，使用瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，剪切回收相應(yīng)的目的條帶。

6.構(gòu)建DNA文庫(kù)及16S rDNA高通量測(cè)序：文庫(kù)構(gòu)建使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行，經(jīng)Qubit及Q-PCR定量、文庫(kù)合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。對(duì)Illumina測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接及嵌合體過濾，利用 QIIME2（2019.4）生物信息平臺(tái)得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）進(jìn)行后續(xù)分析。

7.生物信息學(xué)分析：基于Clean Tags進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，97%一致性序列被聚類成為OTUs?；贠TUs的代表序列，利用Qiime軟件進(jìn)行物種注釋。選用Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于特征序列進(jìn)行物種注釋?；贠TU和注釋結(jié)果，使用R軟件（v2.2，https：//rdp.cme.msu.edu/）行物種組成分析，并進(jìn)行Beta、Alpha多樣性計(jì)算等統(tǒng)計(jì)。根據(jù)OTUs的物種注釋結(jié)果，觀察各組樣品在不同水平中相對(duì)豐度較高的物種，例如在門（Phylum）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）水平上分析統(tǒng)計(jì)。上述標(biāo)本處理、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理及分析均在維爾凱生物平臺(tái)進(jìn)行（南寧維爾凱生物科技有限公司）。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：生物信息學(xué)相關(guān)統(tǒng)計(jì)用 QIIME2 軟件進(jìn)行分析。其余計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)照組和VMC組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。

2結(jié)果：

兩組小鼠一般情況及心肌病理學(xué)變化：在腹腔注射病毒后第3天，VMC組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、聳毛、易激惹等表現(xiàn)，14天內(nèi)死亡小鼠為2只;對(duì)照組一般情況好，無異常表現(xiàn)，死亡小鼠為0。HE染色可見VMC組小鼠心肌組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、伴心肌細(xì)胞局灶性壞死，病理積分為1.9±0.4。對(duì)照組無心肌細(xì)胞壞死或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理積分為0。兩組病理積分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示VMC造模成功（圖1）。

2.兩組小鼠腸道菌群多樣性分析：經(jīng)測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及物種注釋分析、基于OTU分析結(jié)果，進(jìn)行Alpha及Beta多樣性分析。Alpha多樣性分析中ACE和Chao1評(píng)估菌群豐度指數(shù)，Shannon及Simpson評(píng)估多樣性指數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VMC與對(duì)照組比較，上述四個(gè)指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05，圖2）。此外，應(yīng)用Beta分析了解VMC與對(duì)照組腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成在總體水平上的差異。主成分分析（PCA）提示，VMC與對(duì)照組兩組間存在交叉現(xiàn)象，兩組腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成在整體上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.18，圖3）。

3.兩組小鼠在不同分類水平上的腸道菌群差異：對(duì)樣本物種信息注釋后，并根據(jù)豐度值進(jìn)行排序，結(jié)果示兩組優(yōu)勢(shì)菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、脫鐵桿菌門、藍(lán)菌門等組成。在門水平上各組優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門與擬桿菌門，且二者比值（F/B）在VMC組中明顯升高，為0.43，而對(duì)照組為0.29（P<0.05），見圖4。

如圖4所示，科水平分析，各組優(yōu)勢(shì)菌種主要由擬桿菌門S24-7菌科、梭菌目、毛螺旋菌科、理研菌科、瘤胃菌科等組成?？扑椒治?，擬桿菌門S24-7菌科的相對(duì)豐度，對(duì)照組為39.47%，VMC組為31.58%，VMC組比對(duì)照組明顯降低（p<0.05）。其余的優(yōu)勢(shì)菌屬中，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而非優(yōu)勢(shì)菌種中，對(duì)照組梭菌科的相對(duì)豐度為0.27%，顯著低于VMC組0.47%（p<0.05）;對(duì)照組F16的相對(duì)豐度為0.20%，明顯低于VMC組0.40%（p<0.05），見表1。

此外，屬水平上分析發(fā)現(xiàn)部分菌屬相對(duì)豐度在兩組間差異顯著，包括擬桿菌AF12、瘤胃球菌屬、脫硫弧菌屬、梭菌屬等。而種水平上分析亦發(fā)現(xiàn)部分菌種在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括耳蝸形梭菌、產(chǎn)氣莢膜菌、卵形擬桿菌、糖菌屬（圖4、表1）。

3討論：

腸道菌群與人體的健康的關(guān)系越來越引起科學(xué)界的重視。腸道菌群甚至被視為獨(dú)立的“器官”，認(rèn)為腸道菌群能為人體提供營(yíng)養(yǎng)、參與宿主共代謝、調(diào)節(jié)抗生素敏感性、誘導(dǎo)先天性免疫等，并參與了肥胖、糖尿病、代謝異常、炎癥性腸病和高血壓等疾病的發(fā)病機(jī)制[14]。因此，從腸道菌群的視角探索疾病發(fā)病機(jī)制引起廣泛的關(guān)注。

腸道病毒尤其是CVB3是病毒性心肌炎最常見的病原體，而腸道是CVB3 病毒感染機(jī)體的最初器官。類似于臨床所見，CVB3誘導(dǎo)的心肌炎小鼠模型中，雄性易感，而雌性不易感。雄性小鼠對(duì)CVB3易感是否與腸道菌群有關(guān)？既往錢乾等發(fā)現(xiàn)[12]，CVB3誘導(dǎo)的心肌炎，雌雄兩組小鼠的腸道菌群多樣性分析無顯著差異。該研究提示心肌炎的嚴(yán)重程度可能與腸道菌群的多樣性無關(guān)。而我們首次利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)CVB3導(dǎo)致的病毒性心肌炎小鼠腸道菌群進(jìn)行整體和門屬水平分析，發(fā)現(xiàn)菌群整體多樣性與健康對(duì)照組無顯著差異，提示在VMC組小鼠中無特異性表達(dá)的腸道細(xì)菌，說明并非單一的腸道細(xì)菌而有一群腸道菌群在VMC小鼠腸道存在差異，可能影響小鼠腸道免疫功能。

腸道菌群功能和結(jié)構(gòu)比例異常是腸道菌群紊亂的表現(xiàn)，目前常用來評(píng)價(jià)腸道菌群失調(diào)的一個(gè)重要指標(biāo)為F/B 比值，其上調(diào)被認(rèn)為是與高血壓等心血管疾病相關(guān)腸道菌群失調(diào)的重要標(biāo)志[5]。本課題中，我們計(jì)算發(fā)現(xiàn)F/B比值在VMC組明顯升高，提示VMC小鼠存在腸道菌群紊亂。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，胡小凡等在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎小鼠中發(fā)現(xiàn)[15]，其F/B比值明顯升高（≈2 倍正常組）。因此，通過干預(yù)調(diào)整F/B比例有可能成為抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌炎，控制VMC進(jìn)展的途徑之一。

菌屬水平分析上我們鑒定到各組優(yōu)勢(shì)菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、脫鐵桿菌門、藍(lán)菌門等組成?？扑椒治?，我們鑒定到VMC組擬桿菌科S24-7明顯降低，擬桿菌 S24-7被視為能促進(jìn)丙酸鹽和丁酸鹽的生成，因此，本課題組既往發(fā)現(xiàn)VMC中短鏈脂肪酸明顯降低（數(shù)據(jù)未發(fā)表），其可能與 S24-7減少有關(guān)。短鏈脂肪酸（SCFA），包括丁酸鹽、丙酸鹽和乙酸鹽，對(duì)于腸道生理生化穩(wěn)定以及細(xì)菌自身能量代謝具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SCFA如丁酸鹽具有增加胰島素敏感性、減少炎癥、心臟保護(hù)等作用[16]。因此，VMC中心肌炎癥可能與擬桿菌 S24-7降低導(dǎo)致SCFA減少有關(guān)，但需對(duì)代謝物質(zhì)進(jìn)一步分析證實(shí)。梭菌屬在VMC組中明顯升高，梭菌屬參與腸道黏膜的完整性[17]，其相關(guān)毒素破壞腸黏膜完整性[18]，梭菌屬在VMC組中明顯升高可能參與腸道粘膜破環(huán)、損傷免疫功能。而放線菌門F16，被認(rèn)為減少糖代謝[19]，且可作為心血管不良事件的特征性標(biāo)志物[20]。VMC中F16明顯升高，其是否加重VMC心肌炎癥、是否能作為VMC心血管不良事件的特征性標(biāo)志物，需臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，擬桿菌門AF12屬、瘤胃球菌屬、脫硫弧菌屬等菌群為非優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度較低，但在兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這些腸道菌群的改變可能參與了VMC病情的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)尚存諸多不足之處：（1）未檢測(cè)腸道菌群產(chǎn)物如代謝組學(xué)及相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)，在解釋VMC中差異菌群可能的相關(guān)機(jī)制時(shí)需要更加謹(jǐn)慎;（2）標(biāo)本為排至體外的糞便，導(dǎo)致檢測(cè)的菌群可能有所減少，如能檢測(cè)腸道內(nèi)容物則更為理想。

本研究通過對(duì)VMC及健康對(duì)照組小鼠的腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VMC組小鼠腸道菌群多樣性無明顯變化，但F/B比值增加，提示存在腸道菌群紊亂。進(jìn)一步分析提示，擬桿菌門S24-7菌科、梭菌科、放線菌門F16等菌群存在差異，證實(shí)腸道菌群失調(diào)可能參與VMC發(fā)病機(jī)制，調(diào)整腸道菌群的方法如腸道菌群移植、抗生素干預(yù)等策略，或?qū)⒊蔀橹委烿MC極具吸引力的新思路和方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]DENNERT R， CRIJNS H J， HEYMANS S. Acute viral myocarditis [J]. Eur Heart J， 2008， 29（17）： 2073-82.

[2]SCHWAAB B， KINDERMANN I， BJARNASON-WEHRENS B， et al. Viral myocarditis： a forbidden indication for cardiac rehabilitation？ [J]. Eur J Prev Cardiol， 2021.

[3]ERIKSSON U， RICCI R， HUNZIKER L， et al. Dendritic cell-induced autoimmune heart failure requires cooperation between adaptive and innate immunity [J]. Nat Med， 2003， 9（12）： 1484-90.

[4]FAIRWEATHER D， STAFFORD K A， SUNG Y K. Update on coxsackievirus B3 myocarditis [J]. Curr Opin Rheumatol， 2012， 24（4）： 401-7.

[5]LI J， ZHAO F， WANG Y， et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension [J]. Microbiome， 2017， 5（1）： 14.

[6]ELOE-FADROSH E A， RASKO D A. The human microbiome： from symbiosis to pathogenesis [J]. Annu Rev Med， 2013， 64： 145-63.

[7]DINAKARAN V， RATHINAVEL A， PUSHPANATHAN M， et al. Elevated levels of circulating DNA in cardiovascular disease patients： metagenomic profiling of microbiome in the circulation [J]. PLoS One， 2014， 9（8）： e105221.

[8]MA Q， LI Y， WANG J， et al. Investigation of gut microbiome changes in type 1 diabetic mellitus rats based on high-throughput sequencing [J]. Biomed Pharmacother， 2020， 124： 109873.

[9] LEE H， LEE H K， MIN S K， et al. 16S rDNA microbiome composition pattern analysis as a diagnostic biomarker for biliary tract cancer [J]. World J Surg Oncol， 2020， 18（1）： 19.

[10] TANG W H， KITAI T， HAZEN S L. Gut Microbiota in Cardiovascular Health and Disease [J]. Circ Res， 2017， 120（7）： 1183-96.

[11] KAMO T， AKAZAWA H， SUZUKI J I， et al. Novel Concept of a Heart-Gut Axis in the Pathophysiology of Heart Failure [J]. Korean Circ J， 2017， 47（5）： 663-9.

[12] 錢乾. TLR13和腸道菌群在柯薩奇病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機(jī)制 [D]; 蘇州大學(xué)， 2014.

[13] REZKALLA S K R A， KHATIB G，ET AL. Effcet of metoprolol in acute coxsackievirus B3 murine myocarditis [J]. J Am Coll Cardiol， 1988， 12： 412-4.

[14] LI Q， GAO B， SIQIN B， et al. Gut Microbiota： A Novel Regulator of Cardiovascular Disease and Key Factor in the Therapeutic Effects of Flavonoids [J]. Front Pharmacol， 2021， 12： 651926.

[15] HU X F， ZHANG W Y， WEN Q， et al. Fecal microbiota transplantation alleviates myocardial damage in myocarditis by restoring the microbiota composition [J]. Pharmacol Res， 2019， 139： 412-21.

[16] QIUJIN JIA H L， HUAN ZHOU，XIAONAN ZHANG，YINGYU XIE，YANYANG LI，SHICHAO LV，JUNPING ZHANG. Role and Effective Therapeutic Target of Gut Microbiota in Heart Failure [J]. Cardiovasc Ther， 2019.

[17] ASANO Y， HIRAMOTO T， NISHINO R， et al. Critical role of gut microbiota in the production of biologically active， free catecholamines in the gut lumen of mice [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2012， 303（11）： G1288-95.

[18] ABUGHANIMEH O， QASRAWI A， KADDOURAH O， et al. Clostridium difficile infection in oncology patients： epidemiology， pathophysiology， risk factors， diagnosis， and treatment [J]. Hosp Pract （1995）， 2018， 46（5）： 266-77.

[19] NULI R， CAI J， KADEER A， et al. Integrative Analysis Toward Different Glucose Tolerance-Related Gut Microbiota and Diet [J]. Front Endocrinol （Lausanne）， 2019， 10： 295.

[20] SCHULZ S， REICHERT S， GROLLMITZ J， et al. The role of Saccharibacteria （TM7） in the subginival microbiome as a predictor for secondary cardiovascular events [J]. Int J Cardiol， 2021， 331： 255-61.

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金，項(xiàng)目編號(hào)：2018JJB140169